李選文，熊忠平，周藝萍，王金華，韋建福，3，陳曉溪，熊 智

1. 西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224； 2. 西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)與利用學(xué)院，昆明 650224； 3. 云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500

云南石林地處中國(guó)西南山脈片區(qū)，分布于云南省昆明市石林縣境內(nèi)，其間擁有眾多的巖溶地貌，地理位置是24°30′-25°03′ N，103°10′-103°40′ E，海拔1 600～1 950 m，屬亞熱帶低緯度高原山地季風(fēng)氣候，年平均氣溫約16 ℃[1]．云南石林位于中國(guó)西南喀斯特地區(qū)，是典型的喀斯特地貌，以其連續(xù)分布面積大(超過(guò)900 km2)、發(fā)育類型齊全、景觀秀麗和生態(tài)環(huán)境脆弱而著稱于世[2-3]．云南石林的喀斯特地貌由于其脆弱的地質(zhì)背景和不合理的人為活動(dòng)，導(dǎo)致了地上植被消失，巖石裸露，極易導(dǎo)致石漠化，給社會(huì)帶來(lái)巨大的損失[4-6]．

石林由碳酸鹽巖、白云巖和CaCO3含量較高的石灰?guī)r組成[7]，巖石作為特殊的生存環(huán)境，隨環(huán)境條件變化產(chǎn)生巨大的波動(dòng)(包括太陽(yáng)輻射、干旱、營(yíng)養(yǎng)缺乏和溫度波動(dòng)等)，各種微生物以其特殊的生存方式在巖石的表面和內(nèi)部存活．?dāng)?shù)量巨大的微生物作用于巖石的表面和內(nèi)部，參與了喀斯特地區(qū)演化的過(guò)程，特別是生物圈巖石和礦物的風(fēng)化以及土壤的形成過(guò)程等[8]．

研究表明，微生物可能通過(guò)兩種方式加速風(fēng)化碳酸鹽巖，包括直接與巖石接觸或者自身分泌活性物質(zhì)(如酶)[9]．根據(jù)曹成亮等對(duì)放線菌的礦物轉(zhuǎn)化作用研究發(fā)現(xiàn)[10]，石生放線菌驅(qū)動(dòng)了CaCO3分子重組，重結(jié)晶，對(duì)于碳酸鹽礦物的生物轉(zhuǎn)化有重要的作用．此外，巖石上的石生放線菌還能導(dǎo)致碳酸鹽的結(jié)構(gòu)被破壞，造成這種現(xiàn)象的原因是巖石表面由于微生物作用吸收不同的太陽(yáng)輻射，從而改變巖石晶體局部結(jié)構(gòu)，甚至造成一些建筑物的損傷．因此，對(duì)石生放線菌的研究不僅可以為我們了解放線菌多樣性提供便利，豐富的放線菌資源還可以對(duì)建筑物和石質(zhì)文物的保護(hù)提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支持．另外，絕大部分的醫(yī)用抗生素都是由放線菌產(chǎn)生(如鏈霉素(streptomycin)、土霉素(oxytetracycline)等)[11]．

目前，關(guān)于石漠化地區(qū)微生物的特性已有一定的研究，但卻缺少對(duì)石林石漠化地區(qū)石生放線菌多樣性的研究．本研究以石林石漠化地區(qū)巖石為材料，采用純培養(yǎng)技術(shù)、形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列對(duì)石生放線菌進(jìn)行初步的分離鑒定，研究石生放線菌的多樣性，為研究微生物對(duì)碳酸鹽巖的風(fēng)化成土過(guò)程及喀斯特地區(qū)石漠化的治理提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 巖石樣品

巖石樣品采自云南省石林縣石林石漠化地區(qū)帶有不同顏色微型菌落的巖石(圖1)，在不同的環(huán)境條件下，隨機(jī)選取8～10個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)取樣4～5份，總計(jì)挑選40份巖石作為研究樣品．為了防止樣品被采樣工具污染，每次采樣前用75%乙醇沖洗小錘3次．將采集好的巖石樣品與附著的微型菌落一起裝入無(wú)菌袋中密封保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，然后保存于4 ℃冰箱中備用．

圖1 部分巖石樣本采樣點(diǎn)

1.2 培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基： 可溶性淀粉20 g，KNO31 g，F(xiàn)eSO3·7H2O 0.01 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水補(bǔ)足1 000 mL，pH值為7.4～7.6，121 ℃，0.12 MPa滅菌30 min．

1.3 放線菌的分離純化及保存

材料處理： 采用土壤稀釋涂布平板法[12]，將可能含有放線菌的巖石置于高溫高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌水和95%乙醇重復(fù)清洗以祛除表面的污垢，用切石器將巖石樣品鑿成細(xì)小的巖片，將其放入裝有適量玻璃珠并盛有99 mL無(wú)菌水的錐形瓶?jī)?nèi)，充分搖勻，浸泡片刻后進(jìn)行梯度稀釋(用無(wú)菌移液槍吸取10-2懸液1 mL，吹入9 mL無(wú)菌水中即為10-3，如此重復(fù)2次，可制成10-4，10-5的稀釋液)．分別吸取濃度為10-2，10-3，10-4和10-5懸浮液100 μL滴在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，用涂布器進(jìn)行涂布，溫度為28.5 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為3～4 d．1) 劃線分離： 培養(yǎng)3～4 d待長(zhǎng)出一定量的菌絲后，用接種環(huán)從培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取少許菌苔，在高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中劃線分離．2) 培養(yǎng)： 劃線完畢后蓋上培養(yǎng)皿蓋，平板倒置，28.5 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，檢查是否有雜菌摻雜，發(fā)現(xiàn)雜菌后不斷進(jìn)行分離與純化直到獲得純的菌株．從中挑選1株單一菌株，用砂土管法保存在4 ℃的冰箱中備用．

1.4 放線菌形態(tài)學(xué)觀察

石林石生放線菌形態(tài)觀察采用插片法進(jìn)行觀察[13]．將分離獲得的石生放線菌使用點(diǎn)接種法接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，用無(wú)菌蓋玻片傾斜45°插在距離菌種1 cm左右的位置．28.5 ℃暗培養(yǎng)，待菌絲生長(zhǎng)至蓋玻片1/2時(shí)取出蓋玻片．置于顯微鏡下觀察菌絲、孢子等形態(tài)結(jié)構(gòu)，并用電子顯微鏡進(jìn)行拍照．參照《放線菌系統(tǒng)學(xué)——原理方法及實(shí)踐》[14]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]，對(duì)放線菌的形態(tài)展開(kāi)觀察鑒定．

1.5 石生放線菌DNA抽提及PCR擴(kuò)增

1.5.1 石生放線菌DNA提取

采用酶解法[16]小量提取菌株的DNA，稍作改變，步驟如下：

1) 將約480 μL的含有溶菌酶30 μL的1×TE溶液(溶菌酶的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL)加入到裝有50 mg菌體的離心管中，然后放入37 ℃搖床12 h．

2) 加入5 μL質(zhì)量濃度為20 μg/mL蛋白酶K和50 μL 20%SDS震蕩混勻1 min，55 ℃水浴45～60 min．

3) 加550 μL苯酚、氯仿、異戊醇溶液，比例為25∶24∶1，震蕩混勻，12 000 r/min低溫離心10 min，吸取上清液(不要吸到中間部分)．

4) 往上清液中加入50 μL 3 mol/L乙酸鈉(pH值為4.8～5.2)混合加入500 μL異丙醇后，放入-20 ℃冰箱2 h．

5) 12 000 r/min低溫離心10 min，去除上清液，加入200 μL 70%乙醇輕搖2次，12 000 r/min低溫離心5 min，棄乙醇．

6) 37～55 ℃干燥后加入50 μL 1×TE溶解DNA(視DNA量而定)，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.5.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序[17]

引物選擇，27F(正向引物)： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3’； 1492R(反向引物)： 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，引物由生工生物科技有限公司提供．?dāng)U增體系為50.0 μL： 10× PCR Buffer為5.0 μL； MgCl2為5.0 μL； dNTP為1.0 μL； 模板DNA為2.0 μL； 27F為1.5 μL； 1492R為1.5 μL； 雙蒸水補(bǔ)充至50.0 μL．PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性1 min； 55 ℃退火30 s； 72 ℃延伸2 min； 共30 個(gè)循環(huán)．72 ℃延伸2 min，-20 ℃保存．

把4.0 μL PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物和10×上樣緩沖液混合，然后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物科技有限公司測(cè)序．從公司測(cè)得的序列通過(guò)Sequencher 4.14軟件進(jìn)行拼接，將拼接好后的序列在http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/中將菌株的16S rDNA 序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用軟件MEGA 6.06 構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用自展法檢測(cè)1 000次數(shù)據(jù)集，然后根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中組群間的親緣關(guān)系對(duì)石生放線菌菌株進(jìn)行分類，判定其種屬關(guān)系．

1.6 分離率及多樣性指數(shù)

1.6.1 分離率與相對(duì)分離率[18]

分離率(Isolation rates，IR)是指從樣本組織塊中得到的菌株數(shù)與全部樣本組織塊數(shù)的比值，用來(lái)衡量石生放線菌的豐富程度； 相對(duì)分離率(Relative ferquency，RF)是指從樣品中分離到的某一種放線菌的株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分率，用來(lái)衡量石生放線菌某種放線菌的優(yōu)勢(shì)度．

1.6.2 多樣性指數(shù)(H′)，即Shannon-Weiner指數(shù)

Shannon-Weiner指數(shù)可以反映每一份樣品所含放線菌的物種多樣性程度．按Shannon-Weiner指數(shù)計(jì)算[19]，若Shannon-Weiner指數(shù)數(shù)值越大，說(shuō)明石生放線菌的多樣性越高．

式中，Pi表示第i種石生放線菌的數(shù)量占該生境中全部放線菌菌株總數(shù)的比例．

2 結(jié)果與分析

2.1 石生放線菌分離結(jié)果

采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基對(duì)石林石生放線菌進(jìn)行分離純化，共分離得到65株石生放線菌，所用巖石塊數(shù)為40塊，計(jì)算出分離率達(dá)到162.50%，種數(shù)為11種．基于以上結(jié)果，可以認(rèn)為石林石生放線菌具有較高的豐富性．

2.2 菌落形態(tài)特征

根據(jù)菌落的形態(tài)特征將分離純化后的石生放線菌初步分離合并為11 種形態(tài)型，整理合并編號(hào)為SLG01，SLG03，SLG05，SLG06，SLG08，SLG11，SLG14，SLG15，SLG22，SLG23，SLG24，根據(jù)菌落形態(tài)特征(圖2)、菌絲或孢子(圖3)及顯微結(jié)構(gòu)特征(表1)，初步判定SLG01，SLG08，SLG11，SLG14，SLG15，SLG22，SLG23，SLG24為鏈霉菌屬(Streptomyces)； SLG03為放線菌屬(Actinobacterium)； SLG05，SLG06為擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsissp)．因?yàn)椴糠志晷螒B(tài)結(jié)構(gòu)特征過(guò)于相似，因此需結(jié)合分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定．

從表1可以看出，分離的65株石生放線菌中，根據(jù)相對(duì)分離率計(jì)算方法可得到鏈霉菌屬的相對(duì)分離率為90.76%，為優(yōu)勢(shì)菌群，擬無(wú)枝酸菌屬的相對(duì)分離率為7.70%，放線菌屬的相對(duì)分離率為1.54%．根據(jù)多樣性指數(shù)計(jì)算公式，得到高氏一號(hào)培養(yǎng)基分離到石生放線菌的多樣性指數(shù)為2.276 29，表明石林石生放線菌具有豐富的多樣性．

表1 放線菌的主要特征

圖2 部分菌落形態(tài)

圖3 部分菌絲體顯微特征(比例尺： 5 μm)

2.3 石生放線菌16S rDNA序列PCR擴(kuò)增及序列分析

提取分離純化后的石生放線菌DNA，檢測(cè)純度合格后采用引物27F(正向引物)： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3’； 1492R(反向引物)： 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，大小均在1 500 bp左右(圖4)．

圖4 放線菌16S rDNA序列PCR電泳結(jié)果

將所獲11種石生放線菌16S rDNA序列在GenBank中注冊(cè)，獲得GenBank登錄號(hào)(表2)．序列提交至GenBank進(jìn)行Blast同源比對(duì)，選取同源性最高序列作為參照菌株序列．與獲得的11種放線菌16S rDNA一起，運(yùn)用軟件MEGA 6.06 構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用自展法檢測(cè)1 000次數(shù)據(jù)集，然后根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中組群間的親緣關(guān)系對(duì)石生放線菌菌株進(jìn)行分類，判定其種屬關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖5．在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，分離到的石生放線菌與聚在同一系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上相應(yīng)菌株的16S rDNA序列相似度在99%～100%之間．

表2 放線菌GenBank 登錄號(hào)及最大相似菌株

從GenBank登錄號(hào)(表2)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)上看，這65株菌屬于1門(mén)1綱1目3科3個(gè)屬11個(gè)種，SLG01為鏈霉菌屬公牛鏈霉菌(Streptomycestauricus) ，SLG03為放線菌屬(Actinobacterium)，SLG05為擬無(wú)枝酸菌屬東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)，SLG06為擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsissp.)，SLG08為鏈霉菌屬暗色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesphaeochromogenes)，SLG11為鏈霉菌屬淡紫灰鏈霉菌(Streptomyceslavendulae)，SLG14為鏈霉菌屬委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)，SLG15為鏈霉菌屬微紅鏈霉菌(Streptomycessubrutilus)，SLG22為鏈霉菌屬糞生鏈霉菌(Streptomycesfimicarius)，SLG23為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，SLG24為鏈霉菌屬藍(lán)微褐鏈霉菌(Streptomycescyaneofuscatus)．其中，SLG03，SLG06，SLG23只能鑒定到屬，其余8株菌均鑒定到種，但不能夠確定其真正的種屬地位，還需要進(jìn)一步鑒定，鏈霉菌屬可能是石林石漠化地區(qū)石生放線菌中的優(yōu)勢(shì)菌株．

圖5 基于16S rDNA序列構(gòu)建放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法)

3 結(jié)論與討論

目前石漠化已經(jīng)成為西南巖溶地區(qū)生態(tài)惡化的主要因素，對(duì)石生微生物——放線菌多樣性的研究，不僅可為石漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)與重建提供理論依據(jù)，還可以豐富放線菌的資源．我們采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基對(duì)石生放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，從巖石樣品中分離共得到65株石生放線菌．因?yàn)樯砩荒芡耆珳?zhǔn)確到放線菌的種屬，需進(jìn)行分子鑒定，經(jīng)16S rDNA 序列同源性分析及生物學(xué)表型特征分析，結(jié)果表明分離得到的65株石生放線菌隸屬于1門(mén)1綱1目3科3個(gè)屬11個(gè)種．分別是SLG01為鏈霉菌屬公牛鏈霉菌(Streptomycestauricus)，SLG03為放線菌屬(Actinobacterium)，SLG05為擬無(wú)枝酸菌屬東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)，SLG06為擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsissp.)，SLG08為鏈霉菌屬暗色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesphaeochromogenes)，SLG11為鏈霉菌屬淡紫灰鏈霉菌(Streptomyceslavendulae)，SLG14為鏈霉菌屬委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)，SLG15為鏈霉菌屬微紅鏈霉菌(Streptomycessubrutilus)，SLG22為鏈霉菌屬糞生鏈霉菌(Streptomycesfimicarius)，SLG23為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，SLG24為鏈霉菌屬藍(lán)微褐鏈霉菌(Streptomycescyaneofuscatus)．說(shuō)明石林石漠化地區(qū)石生放線菌具有豐富的多樣性，其中鏈霉菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群．這些菌株對(duì)石漠化地區(qū)土壤改良和生態(tài)環(huán)境恢復(fù)等有極其重要的意義．

石林微生物群是一個(gè)龐大的菌群，石林石生放線菌僅是其中的一個(gè)代表．石林微生物多樣性的研究是一項(xiàng)對(duì)于提高放線菌資源有利的研究，這對(duì)改善喀斯特地貌的環(huán)境，提高社會(huì)對(duì)喀斯特石漠化地區(qū)的關(guān)注具有重大的意義．為了能夠更加透徹地研究放線菌對(duì)喀斯特地貌的影響，在后續(xù)工作中可就不同季節(jié)、不同地區(qū)、不同生長(zhǎng)環(huán)境下的放線菌進(jìn)行多樣性研究，為喀斯特地貌研究提供數(shù)據(jù)參考，也能對(duì)石林的保護(hù)提供重要的理論與技術(shù)支持．另外，鏈霉菌屬菌株作為一株可以產(chǎn)生天然活性物質(zhì)的菌種(67%的醫(yī)用抗生素都是由其產(chǎn)生)，對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)的研究有重要的前景[19]．為了后續(xù)的研究，可以在石生放線菌解鈣解鎂方面做一個(gè)比較深入的研究，還可以就不同季節(jié)的喀斯特地貌石生微生物進(jìn)行研究，以利于研究石生微生物的多樣性，豐富石生微生物的資源．