許錦虹，羅苗，姜海琴，熊慧，梅之南，楊光忠*

(1 中南民族大學 藥學院，武漢 430074；2 勁牌有限公司，武漢 430000)

豆科榼藤屬植物榼藤Entadaphaseoloides在傣族和壯族等民族中有著廣泛的應用歷史.榼藤子入藥，味澀、甘，歸肝、腎、大腸經，主治胃痛、黃疸、痔瘡、便秘等病癥，為《中國藥典》2015年版收錄“七味榼藤子丸”的主藥[1-2].壯醫(yī)主要以藤莖入藥，又名過崗龍，用于治療弊病、跌打損傷等[3].榼藤屬提取物中主要含有榼藤酰胺類、酚及酚苷類、三萜皂苷類成分，尚含有少量的倍半萜、黃酮、甾體、生物堿及多糖類成分[4-5].研究采用牛Ⅱ型膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎(Collagen-induced Arthritis，CIA)模型大鼠[6]，以榼藤藤莖提取物給藥干預，來初步探究榼藤提取物的抗炎藥理作用以及相關分子機制，以期為榼藤抗類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)藥效及機制研究提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Wistar大鼠50只，雄性，SPF級，體質量150～170 g，購于湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，適應性喂養(yǎng)5 d，自由進食飲水.

榼藤藤莖采自云南西雙版納，經中南民族大學藥學院劉新橋副教授鑒定為豆科榼藤屬植物榼藤Entadaphaseoloides的藤莖，標本存放于中南民族大學民族藥物研究院.

取榼藤藤莖8.0 kg，粉碎，用70%乙醇水提取3次，每次24 h，提取液減壓濃縮，得浸膏518 g，干燥得提取物[7].

1.2 試劑和儀器

雷公藤多苷片(貴州漢方藥業(yè))；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥)；牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex)；弗氏完全/不完全佐劑(美國Sigma)；ELISA試劑盒(武漢華聯科)；異戊巴比妥鈉(美國Merck)；胎牛血清(美國Gibco)；DEME培養(yǎng)基(美國HyClone)；脂多糖(LPS,美國Sigma)；DEPC水(Biosharp Life sciences)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(國藥集團)；RNAiso Plus(Takara)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Select Master Mix(美國賽默飛).

全波長酶標儀(1510，美國賽默飛)；醫(yī)用離心機(3-18KS，美國Sigma)；CFX ConnetTMReal-Time system(美國Bio-Rad)；C1000TouchTMThermal cycler(美國Bio-Rad).

1.3 造模、分組及給藥

在相同標準的飼養(yǎng)環(huán)境下每只Wistar大鼠尾根部皮內注射牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑的乳化劑0.1 mL(1.0 mg/mL)進行初次免疫，10 d 后再次注射相同劑量進行二次免疫.兩次免疫實驗同時另取6只Wistar大鼠尾根部注射等體積的生理鹽水.14 d后篩選出現繼發(fā)側關節(jié)炎的Wistar大鼠36只，隨機分為6組，每組6只，即模型組(CIA)，雷公藤多苷片組(TPT，20.00 mg/kg)，地塞米松組(DEX，0.25 mg/kg)，榼藤提取物低、中、高劑量組(EP，93.75、187.50、375.00 mg/kg).初次造模時間為0 d(0 D)，雷公藤多苷片組(20.00 mg/kg)，地塞米松組(0.25 mg/kg)，榼藤提取物低、中、高劑量組(EP，93.75、187.50、375.00 mg/kg)，在第15 d(D 15)開始每天上午灌胃給藥，空白組和模型組灌胃等容體積的生理鹽水.地塞米松組每4 d給藥一次，其余組每天一次，連續(xù)灌胃給藥35 d.其中地塞米松片、雷公藤多苷片、榼藤提取物均用生理鹽水溶解，每只大鼠給藥容積為10.0 g/0.1 mL.

1.4 足趾腫脹度測定

在第10 d二次免疫前測量大鼠右后足腳趾容積，之后每4 d一次.于大鼠右后足踝關節(jié)處用紅色馬克筆劃線標記，用左手握住大鼠的前肢下，右手捉住大鼠后膝關節(jié)處使其后腳伸直固定，緩慢放入測量杯內，當水平面與鼠足上的測量標線重疊時，踏動腳踏開關，讀取數據，并計算腫脹度.測量部位盡量少移動，每次測量的部位一致.由專人負責，測量動作要熟練，盡量減少誤差.

腫脹度(mL)=造模后足爪容積-造模前足爪容積[8].

1.5 RA模型相關指標的檢測

1.5.1 動物取材

分別取大鼠的脾臟、腹主動脈血及踝關節(jié)待測[9].

1.5.2 組織切片及染色

取大鼠踝關節(jié)于10 %中性甲醛溶液中固定，96 h后換脫鈣液，等到用大頭針刺關節(jié)時無阻力或者阻力很小時，即脫鈣完成，關節(jié)脫鈣完成后梯度脫水，浸蠟，包埋.待石蠟冷卻后從模具中取出蠟塊放置于-20 ℃冰箱中過夜，次日開始切片(4.0 μm).切片后通過HE染色從滑膜細胞侵蝕，血管翳增生，炎細胞浸潤，軟骨損傷等方面在顯微鏡下(100 ×)觀察踝關節(jié)的病理改變[10].

1.5.3 脾臟指數測定

取材前稱量大鼠體重(g)，取材后記錄大鼠脾臟重量(mg).

計算脾臟指數，脾臟指數(mg/g)=(脾臟重量/大鼠體重)×10

1.5.4 大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2含量測定

腹主動脈取血，4000 r/min離心10 min，取上清.按照ELISA試劑盒中的操作步驟來檢測血清中IL-1β、IL-17、PGE2的含量.

1.6 體外細胞實驗

1.6.1 細胞培養(yǎng)

細胞株小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；加入含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至80%～90%融合后進行傳代培養(yǎng)，實驗時取對數生長期細胞.

1.6.2 MTT法檢測細胞增殖

根據文獻[11]，取對數生長期的巨噬細胞，經胰酶消化后加入完全培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)良好，調整細胞濃度至2×105個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL細胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.吸取培養(yǎng)液，分組加入藥液.空白組設8個復孔,每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基;供試組設置7個不同濃度：6.25 、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、200.0 μg/mL，每個濃度設置8個復孔，每孔加200 μL供試品溶液.陽性藥組為10 μM地塞米松，設置8個復孔每孔200 μL.另外設置4個調零孔，不加細胞.加藥后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于實驗結束前4 h吸去溶液，用PBS洗2～3次，再用DMEM完全培養(yǎng)基配置MTT(5.0 mg/mL)，每孔加100 μL，孵育4 h，吸盡上清，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，至沉淀完全溶解后用自動酶標儀在波長490 nm處讀取吸光值.

細胞增殖抑制率計算：

1.6.3 熒光定量PCR

取對數生長期細胞，細胞濃度為2×105個/mL，接種于12孔板中，每孔加入1 mL細胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.吸取上清液，分組加入藥液，每組設置兩個復孔.空白組(NC)每孔加1 mL DMEM培養(yǎng)基，模型組為LPS(1.0 μg/mL)；EP 12.5 μg/mL，同時含1.0 μg/mL LPS；EP 25.0 μg/mL，同時含1.0 μg/mL LPS；EP 50.0 μg/mL，同時含1.0 μg/mL LPS；DEX 10.0 μmol/L，同時含1.0 μg/mL LPS.所有給藥的溶液都用DMEM配置，每孔都加1.0 mL供試液.3 h后，吸取培養(yǎng)基，用預冷的PBS漂洗1～2次后向每孔加入1 mL RNAiso Plus，在提取細胞樣本中的RNA后反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應.所用PCR引物序列見表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7 統計學處理方法

Graph Pad Prism 6軟件用于數據統計分析和圖形處理，所有數據均表示為 -x±s，P<0.05被認為具有統計學意義.

2 結果和分析

2.1 榼藤提取物對CIA大鼠足趾腫脹度的影響

與空白組相比，模型組大鼠足趾腫脹程度存在明顯的差異(圖1)；與模型組比較，各給藥組從第18 d開始足趾腫脹度逐漸降低.其中地塞米松組足趾腫脹度下降最明顯，榼藤提取物組也明顯降低了大鼠的足趾腫脹度，并呈現劑量依賴性.圖中空白組與模型組相比：dP<0.001，模型組與各個給藥組相比：aP<0.001，bP<0.01，cP<0.05.

圖1 榼藤提取物對CIA大鼠足趾腫脹度的影響Fig.1 The effect of Entada phaseoloides extract on toe swelling of CIA rats

2.2 榼藤提取物對CIA大鼠踝關節(jié)組織病理學的影響

如圖2所示，黑色箭頭代表關節(jié)軟骨，黃色或綠色箭頭代表輕微或嚴重的結締組織增生.空白組大鼠關節(jié)滑膜組織為1～2層細胞，排列整齊，未見炎癥細胞浸潤；模型組大鼠滑膜組織中可見關節(jié)滑膜出現增生，關節(jié)腔內觀察不到關節(jié)軟骨，關節(jié)軟骨消失，骨關節(jié)內骨髓細胞增生，骨小梁等結構減少，骨結構被破壞；與模型組相比雷公藤多苷片組、地塞米松組和榼藤提取物各劑量組中滑膜組織增生程度較低，炎性細胞浸潤減輕，血管翳較少.

圖2 榼藤提取物對CIA大鼠踝關節(jié)組織病理學的影響Fig.2 The effect of Entada phaseoloides extract on histopathology of ankle joint in CIA rats(a)正常組；(b)模型組；(c)雷公藤多苷片組；(d)地塞米松組；(e)榼藤提取物低劑量組；(f)榼藤提取物中劑量組；(g)榼藤提取物高劑量組

2.3 榼藤提取物對CIA大鼠脾臟指數的影響

結果如圖3所示，空白組與模型組相比脾臟指數存在顯著性的差異.與模型組相比，各給藥組的脾臟指數均有所降低.圖中模型組與空白組相比###P<0.001，各個給藥組與模型組相比***P<0.001，**P<0.01.

圖3 榼藤提取物對CIA大鼠脾臟指數的影響Fig.3 The effect of Entada phaseoloides extract on spleen index of CIA rats

2.4 榼藤提取物對CIA大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2含量的影響

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2含量增加(圖4)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2的含量均有不同程度的降低，其中榼藤提取物高劑量組、地塞米松組和雷公藤多苷片組降低程度顯著，榼藤提取物高劑量組對抑制這些炎性因子呈現出相似的效果.榼藤提取物的低、中、高劑量組呈現出劑量依賴性.圖中模型組與空白組相比###p< 0.001，各個給藥組與模型組相比***p< 0.001 ，**p< 0.01 ，*p< 0.05.

2.5 MTT法檢測榼藤提取物對巨噬細胞RAW264.7體外增殖的影響

如圖5所示，MTT結果顯示榼藤提取物的給藥濃度在100.00 μg/mL 以內對細胞的生長無明顯的抑制作用，即無細胞毒性，因此在此實驗的基礎上進行體外細胞實驗濃度梯度的選擇具有可靠性.圖中與空白組相比***P< 0.001.

圖5 榼藤提取物對巨噬細胞RAW264.7體外增殖的影響Fig.5 The effect of Entada phaseoloides extract on the proliferation of macrophages RAW264.7 in vitro

2.6 榼藤提取物對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7中IL-1β、TNF-α、PGE2基因表達的影響

如圖6所示，在LPS誘導的體外細胞炎癥模型中，與空白組相比，模型組的中促炎因子IL-1β、TNF-α、PGE2的表達明顯上調；與模型組相比，各給藥組對IL-1β、TNF-α、PGE2均有不同程度的降低.其中不同濃度的榼藤提取物組對IL-1β的下調明顯并且呈現出劑量依賴性；同時榼藤提取物對TNF-α的下調明顯，但是高劑量組與模型組相比不存在顯著性差異；榼藤提取物能明顯降低PGE2的表達，但是陽性藥組對PGE2的表達沒有影響.圖中模型組與空白組相比###P<0.001，##P<0.01 ，各個給藥組與模型組相比***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.

圖6 榼藤提取物對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7中相關炎性因子表達的影響Fig.6 The effect of Entada phaseoloides extract on the expression of related inflammatory factors in LPS-induced macrophage RAW264.7

3 討論

本研究建立了類風濕性關節(jié)炎(CIA)大鼠模型，實驗結果表明榼藤提取物對CIA大鼠有明顯的治療作用，榼藤提取物各劑量組CIA大鼠的足趾腫脹度在給藥后明顯低于模型組，說明榼藤提取物能有效改善CIA大鼠的踝關節(jié)腫脹度,具有明顯的抗炎、消腫作用.通過HE切片染色，從形態(tài)學的角度能直觀地看到榼藤提取物組以及兩組陽性藥均能抑制滑膜組織增生，降低炎性細胞浸潤，減少血管翳生成，能較好地改善CIA大鼠踝關節(jié)組織病理狀態(tài).

脾臟的免疫功能在機體的淋巴器官中占有重要的地位，CIA大鼠因免疫功能增強，脾臟指數有不同程度的升高，而相對于模型組而言，榼藤提取物可以減輕CIA大鼠脾臟的水腫程度，降低CIA大鼠的脾臟指數，說明其能減輕CIA大鼠脾臟的炎癥程度.

IL-17、IL-1β都參與了RA的多個發(fā)病環(huán)節(jié)，其中IL-17能夠促進滑膜細胞分泌多種細胞因子，并能誘導活化Th17細胞，促進Th17細胞增殖；IL-17也可促進補體C3等急性期反應蛋白的產生，誘導炎癥反應，并協同其他致炎因子，導致RA的進一步發(fā)展[14]，而PGE2可舒張小血管，增加微循環(huán)通透性，增加滲出與水腫，誘導白細胞聚集，加重關節(jié)炎癥反應；榼藤提取物各劑量組CIA大鼠血清中的IL-1β、IL-17、PGE2的含量明顯低于模型組，說明榼藤提取物可能是通過下調IL-1β、IL-17、PGE2等相關炎性因子從而達到治療類風濕關節(jié)炎的炎癥反應[15].

巨噬細胞是機體炎癥反應的重要參與者，LPS是巨噬細胞重要的激活因子，可以直接誘導巨噬細胞釋放促炎因子[16].TNF-α是炎癥反應過程中的初級內源性炎癥因子,IL-1β、PGE2也是促炎因子，共同參與炎癥相關的疾病.本實驗結果顯示，經LPS誘導的小鼠巨噬細胞TNF-α、IL-1β、PGE2分泌量上升，與空白組存在明顯的差異，說明構建的巨噬細胞炎癥模型成功.與模型組相比，榼藤提取物各劑量組都能明顯下調相關炎性因子的表達，說明榼藤提取物在細胞水平上可能是通過抑制TNF-α、IL-1β、PGE2等炎性因子的表達從而改善炎癥癥狀.綜上所述，榼藤提取物能有效改善CIA大鼠的炎癥癥狀，其作用可能與抑制炎性因子IL-17、IL-1β、TNF-α及PGE2的合成或釋放、抑制免疫功能等有關，其抗炎作用具體機制及具體抗炎組分有待于進一步的研究.