（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類的糖類物質(zhì)利用率是三大營養(yǎng)物質(zhì)中最低的。魚類飼料中添加適宜水平的糖類物質(zhì)可以降低飼料中蛋白質(zhì)的用量，促進(jìn)ATP的形成，活化氨基酸，增加魚體自身蛋白質(zhì)的合成。更重要的是，飼料中糖類物質(zhì)的添加可以大幅度降低養(yǎng)殖成本，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖對魚粉、魚油等緊缺資源的依賴，同時減少飼料中氮、磷的排放對水體的污染，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但是，飼料中糖水平超過一定限度會引發(fā)魚類抗病力低、生長遲緩、高死亡率等現(xiàn)象。李晉南等[1]研究了不同糖及糖水平對松浦鏡鯉（Cyprinus carpioL.）腸道消化酶和腸道形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)高淀粉可以增加腸道消化酶活性，同時對腸道形態(tài)未產(chǎn)生影響。

精氨酸（Arginine，Arg）作為一種條件性必需氨基酸，不僅是機(jī)體蛋白質(zhì)的組成成分，而且是一氧化氮（NO）、尿素、多胺、肌酸等活性物質(zhì)的前體，在促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、增強(qiáng)機(jī)體的免疫力、激素分泌和繁殖等各種生理過程中起著重要作用。目前研究表明，在魚類糖代謝調(diào)控中，葡萄糖并非是誘導(dǎo)胰腺分泌胰島素的最有效應(yīng)因子，精氨酸或其他氨基酸具有比葡萄糖更高的促胰島素分泌能力[2-3]。在糖尿病患者的臨床實驗中發(fā)現(xiàn)，精氨酸可以促進(jìn)糖吸收，增加胰島素的分泌，提高胰島素的敏感性，從而影響機(jī)體的糖代謝[4-5]，Paolisso等[6]研究表明L-精氨酸可以通過胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖吸收，而D-精氨酸沒有這個功能。但目前關(guān)于精氨酸調(diào)節(jié)魚類糖代謝的研究尚未見報道。

松浦鏡鯉是中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所在德國鏡鯉選育系(F4)的基礎(chǔ)上選育的新品種，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。松浦鏡鯉作為雜食性魚類，對糖類物質(zhì)的利用能力較強(qiáng)，Wilson[7]的研究表明鯉魚利用淀粉的能力優(yōu)于葡萄糖，并且能耐受400 g/kg 的糖類物質(zhì)；Li 等[8]研究表明，松浦鏡鯉可以耐受50%高淀粉飼料。本研究以松浦鏡鯉為研究對象，研究高淀粉水平下添加精氨酸對松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為高糖飼料的利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

L-精氨酸購自Sigma，純度≥98.5%。

1.2 實驗動物及日糧

松浦鏡鯉選自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站。實驗飼料以酪蛋白和魚粉作為蛋白質(zhì)源，魚油和豆油作為脂肪源，淀粉作為糖源，配制成5 組等氮等脂的實驗飼料，在45%水平的高淀粉飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.6%、1.2%、1.8%、2.4%的精氨酸，其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料經(jīng)粉碎過篩后，按飼料配比準(zhǔn)確稱量后混合均勻，采用逐級擴(kuò)大法混合少量的組分，然后用顆粒機(jī)制成1.5 mm 顆粒飼料，自然風(fēng)干后，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成（干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Table 1 Ingredients and approximate composition in the basal diets (air-dry basis) %

1.3 實驗設(shè)計與管理

實驗選擇規(guī)格一致的健康松浦鏡鯉預(yù)飼2 周后隨機(jī)分組，初始體質(zhì)量為（6.84±0.02）g 的松浦鏡鯉360 尾隨機(jī)分為5 組，每組設(shè)4 個重復(fù)，每個重復(fù)18 尾魚，分別為高淀粉飼料中添加0%Arg 組（A0）、0.6%Arg 組（A0.6）1.2%Arg 組（A1.2）、1.8%Arg 組（A1.8），以及2.4%Arg 組（A2.4）。養(yǎng)殖周期8 周，每天定時投喂3 次，每次投喂以飽食無殘餌為準(zhǔn)。實驗在室內(nèi)控溫循環(huán)水玻璃缸中進(jìn)行（200 L），24 h 不間斷供氧，整個實驗光周期為12 L/12 D，溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0.02 mg/L，溫度為（23±1）℃，pH 值為7.15±0.05。每日吸污，每周換去水族箱內(nèi)1/3 水并注入已曝氣的水，每日觀察記錄魚攝食和死亡情況。

1.4 腸道消化酶的測定

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，停飼12 h[9]，每缸隨機(jī)取3尾魚，用MS-222(0.5 mg/L)麻醉后，測量體質(zhì)量和體長后，置于冰盤中迅速解剖，取腸道用預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%生理鹽水清洗腸道中的內(nèi)容物，濾紙吸干水分，測量腸質(zhì)量和腸長。將腸道分為前腸、中腸和后腸，分別按1∶9 質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的生理鹽水，以FJ-200CL 高速組織勻漿機(jī)勻漿，將勻漿液在4 ℃條件下離心10 min（4 000 r/min），取上清液分裝于1.5 mL 離心管中，保存于-20 ℃冰箱中，待測前中后腸的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。

蛋白酶活性測定采用福林-酚（Folin-phenol）法，淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體方法參見試劑盒說明書。組織蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[10]。

1.5 腸道形態(tài)的測定

制備腸道組織切片：飼養(yǎng)實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)取3 尾魚，用MS-222(0.5mg/L)麻醉后，置于冰盤中迅速解剖，分別取1 cm 的前腸、中腸和后腸組織段，去除腸道內(nèi)容物，用生理鹽水（0.86%）沖洗干凈后，固定于Bouin 氏液中。固定24 h 后，經(jīng)過乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（5 μm）、HE 染色、脫水、透明、中性樹脂封片。制成組織切片，用Leica MD 4000B 顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，Motic Images Plus 2.0 軟件對圖像進(jìn)行測量，每段腸樣測量10 個以上完整皺襞高度、絨毛寬度和肌層厚度，取其平均值作為該樣品皺襞高度、絨毛寬度和肌層厚度的測定結(jié)果。

腸道指標(biāo)計算：根據(jù)實驗魚體質(zhì)量、體長、腸質(zhì)量和腸長，計算腸體指數(shù)（Intestinal somatic index，ISI）和腸長指數(shù)（Intestinal length index，ILI）。

腸體指數(shù)（ISI）=腸質(zhì)量/體質(zhì)量；

腸長指數(shù)（ILI）=腸道長/體長。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 高淀粉飼料中添加Arg 對松浦鏡鯉腸道消化酶的影響

高淀粉飼料中添加Arg 后比較松浦鏡鯉前腸、中腸和后腸的淀粉酶活性，各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)；添加2.4%精氨酸組的前腸脂肪酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，中腸和后腸的脂肪酶活性各組間沒有顯著差異(P＞0.05)；前、中、后腸蛋白酶活性隨精氨酸的添加而增加，添加1.8%和2.4%精氨酸組的前腸和中腸蛋白酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，添加2.4%精氨酸組的后腸蛋白酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)（圖1）。

2.2 高淀粉飼料中添加Arg 對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

由表2 可見，高淀粉飼料中添加Arg 顯著影響了腸道的皺襞高度，但對腸絨毛寬度和肌層厚度沒有顯著影響。A2.4 組前腸皺襞高度顯著高于其他各組(P＜0.05)，A1.8 組中腸和后腸皺襞高度顯著高于A0 組(P＜0.05)，與其他各組間差異不顯著(P＞0.05)。A1.2、A1.8 和A2.4 組的腸體指數(shù)顯著高于A0 組(P＜0.05)，A2.4 組的腸長指數(shù)顯著高于A0組(P＜0.05)。

圖1 高糖飼料中添加Arg 對松浦鏡鯉腸道消化酶活性影響Fig.1 Effects of Arginine supplementation in high starch diets on intestinal digestive enzyme activities of Songpu mirror carp

表2 高淀粉飼料中添加Arg 對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響Table 2 Effects of Arg supplementation in high starch diets on the intestinal morphology of Songpu mirror carp

2.3 腸道組織切片觀察

各實驗組前腸組織切片如圖2 所示，各實驗組的前腸腸絨毛均發(fā)育良好，絨毛密度沒有顯著差異。

圖2 松浦鏡鯉前腸組織切片F(xiàn)ig.2 Tissue slice of foregut of songpu mirror carp

各實驗組中腸組織切片如圖3 所示。各組中腸的腸絨毛均發(fā)育較好，排列整齊緊密，各組間沒有顯著差異。

圖3 松浦鏡鯉中腸組織切片F(xiàn)ig.3 Tissue slice of midgut of songpu mirror carp

各實驗組后腸組織切片如圖4 所示。各實驗組后腸的腸絨毛均發(fā)育較好，排列較為緊密，各組間沒有顯著差異。

圖4 松浦鏡鯉后腸組織切片F(xiàn)ig.4 Tissue slice of hindgut of songpu mirror carp

3 討論

魚類對飼料糖的利用率較低，飼料中添加過量的糖類物質(zhì)會影響魚類的生長性能。目前，關(guān)于不同糖及糖水平對魚類腸道健康的影響已有報道[11-12]，但是尚未見高糖飼料中添加精氨酸對腸道健康影響的報道。精氨酸是魚類所需的10種必需氨基酸之一[13]，在魚類營養(yǎng)代謝及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[14-16]。有研究[2-3]表明，在魚類中，精氨酸具有更高促胰島素分泌能力，從而影響魚類的糖代謝，進(jìn)而提高魚類對糖類物質(zhì)的利用率。因此，本研究通過探討高淀粉水平下精氨酸對鯉魚腸道健康的影響，可為提高魚類對飼料糖的利用率奠定基礎(chǔ)。鯉魚是無胃魚，營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要場所就是腸道，腸道中消化酶的活性是衡量其對營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收能力的重要指標(biāo)[17]。淀粉酶的活性和分泌量影響著魚類對飼料中糖類物質(zhì)的消化吸收能力[18]，已有研究證明提高飼料中糖水平可以提高淀粉酶活性[19-20]，也有研究表明淀粉酶活性主要由遺傳因素決定[21]。本實驗室前期研究顯示飼料中添加淀粉可以顯著提高腸道淀粉酶活性[1]。王際英等[22]對仿刺參（Apostichopus japonicus）的研究表明，飼料精氨酸水平可以顯著影響仿刺參腸道蛋白酶的活性，對脂肪酶和淀粉酶活性無顯著影響。王連生等[23]對雜交鱘（Acipenser schrrenckii ♀×A.baeri ♂）的研究表明，飼料中添加精氨酸顯著提高其前腸蛋白酶和淀粉酶活性。飼料中精氨酸水平可以顯著提高建鯉蛋白酶和脂肪酶活性，但對淀粉酶活性無顯著影響[24]。在黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）幼魚的研究[25]中表明，飼料中添加適宜水平的精氨酸顯著提高了其胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性及肝臟淀粉酶活性。本實驗研究結(jié)果顯示，高糖飼料中精氨酸對腸道淀粉酶活性沒有顯著影響，其可能原因是高淀粉飼料已經(jīng)顯著提高了淀粉酶活性，因此添加精氨酸后對淀粉酶活性沒有顯著影響。但飼料中添加精氨酸顯著提高了前腸脂肪酶和前、中、后腸的蛋白酶活性，這一結(jié)果說明高淀粉飼料中添加精氨酸，可以顯著改善腸道消化酶活性，提高其營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。

除了腸道消化酶活性是影響魚類消化吸收能力的重要指標(biāo)，腸道發(fā)育同樣是影響魚類對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要因素[26]，其中腸道皺襞的高度、密度及排列狀態(tài)等均可影響魚類腸道消化吸收能力[27-28]。Cheng等[29]研究表明，添加1%精氨酸可以提高美國紅魚（Sciaenops ocellatus）前腸和中腸皺襞高度和前腸的上皮細(xì)胞高度，添加1%～ 2%精氨酸可以提高雜交條紋鱸（Morone chrysops×Morone saxatilis）腸道絨毛高度、腸上皮細(xì)胞高度和微絨毛高度[30]。在雜交鱘幼魚的研究[24]中表明，飼料中添加適宜水平的精氨酸能顯著提高其前腸和中腸的皺襞高度，以及前腸肌層厚度。陳思琦等[31]研究表明，隨精氨酸添加水平的升高，斜帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）前中后腸的肌層厚度、皺襞高度均升高。本實驗研究表明，高淀粉飼料中添加適宜水平的精氨酸可以顯著增加松浦鏡鯉前中后腸的皺襞高度，說明適宜水平的精氨酸可以改善腸道結(jié)構(gòu)來提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。此外，哺乳動物的研究中表明，精氨酸可以增加腸道質(zhì)量[32-33],本實驗的結(jié)果同樣顯示，高淀粉飼料中添加適宜水平的精氨酸顯著增加了腸體指數(shù)和腸長指數(shù)，這一結(jié)果說明精氨酸可以通過促進(jìn)腸道發(fā)育來提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。

綜上，在高淀粉飼料中添加1.8%～ 2.4%精氨酸可以顯著提高松浦鏡鯉腸道消化酶活性，改善腸道結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道發(fā)育，從而提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。