姚宗廷，蔣淑華，賈澤峰

(1.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059；2.中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所 真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

地衣是由真菌和藻類或藍(lán)細(xì)菌共生所形成的復(fù)雜群落，在該共生系統(tǒng)中，起主要作用的為真菌，真菌幾乎決定了其特征結(jié)構(gòu)[1-2]。乳嘴衣屬地衣(Trypethelium)隸屬于真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)座囊菌綱(Dothideomycetes)乳嘴衣目(Trypetheliales)乳嘴衣科(Trypetheliaceae)。該屬主要分布在熱帶地區(qū)，樹皮生，通常具有顏色鮮艷的假子座(pseudostromata)[3]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)該屬呈現(xiàn)出更豐富的物種多樣性，被證實(shí)為非單系類群[4]，但是對(duì)于該屬的解剖學(xué)特征目前了解尚不完全[3]，這也為該屬的分種帶來(lái)了一定的困難。作者在研究中發(fā)現(xiàn)該屬的模式種乳嘴衣種內(nèi)差異較大，但經(jīng)過(guò)分子數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，這些標(biāo)本均為乳嘴衣種。

目前國(guó)外對(duì)乳嘴衣屬研究較多，而對(duì)于中國(guó)乳嘴衣屬的研究相對(duì)匱乏，更缺乏系統(tǒng)性的研究。鑒于此，本文通過(guò)開展中國(guó)乳嘴衣屬地衣的系統(tǒng)分類學(xué)研究，闡明乳嘴衣屬地衣在中國(guó)的物種組成及分布，期望為中國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)地衣物種多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 乳嘴衣屬地衣的研究概況

1804年，Sprengel以乳嘴衣為模式種建立了乳嘴衣屬，但是一直以來(lái)，關(guān)于乳嘴衣屬的界線劃分問(wèn)題備受爭(zhēng)議。早期許多地衣學(xué)家提出和擴(kuò)展了該屬的分類方案[5-6]，但當(dāng)時(shí)的分類系統(tǒng)存在一定的人為因素，這會(huì)導(dǎo)致屬的多源性，但考慮到表型特征尚未得到分子學(xué)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，所以當(dāng)時(shí)并沒有進(jìn)行正式的分類學(xué)上的改動(dòng)。之后，2009年Nelsen等[4]利用分子數(shù)據(jù)證實(shí)了該屬的非單系性，這也進(jìn)一步證實(shí)了需要修訂該屬的分類學(xué)界線。隨后Nelsen等[7]于2014年對(duì)乳嘴衣科進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，除乳嘴衣組外，該屬大多數(shù)物種隸屬于Astrothelium分支，且子囊孢子為菱形，因此被劃分為Astrothelium屬。乳嘴衣組內(nèi)的成員與該屬內(nèi)其他成員的主要不同在于孢子腔的形狀[7]，Luangsuphabool等[8]的研究揭示，對(duì)于區(qū)分乳嘴衣組內(nèi)的成員T.eluteriae，T.platystomum和T.subeluteriae，除了傳統(tǒng)的分類學(xué)特征之外，次級(jí)代謝產(chǎn)物也是重要的特征。根據(jù)IndexFungorum記載，目前世界范圍內(nèi)報(bào)道該屬約120種，根據(jù)《中國(guó)地衣綜覽》中國(guó)報(bào)道有5種，主要分布在臺(tái)灣[9-12]、江蘇[13]、上海[13]、浙江[13]、香港[14-16]、福建[12]和云南[3]等地區(qū)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的55份乳嘴衣標(biāo)本采自廣東省，現(xiàn)保存于聊城大學(xué)地衣標(biāo)本室(LCUF)。

2.2 表型分析

表型特征在奧林巴斯SZX16和TEELEN XTL-207A解剖顯微鏡下觀察并拍照。解剖特征在奧林巴斯BX53復(fù)合顯微鏡下進(jìn)行檢查和拍照.用K(10%氫氧化鉀水溶液)、C(次氯酸鈣水溶液的飽和溶液)和P(95%乙醇中對(duì)苯二胺的飽和溶液)測(cè)試皮層和髓層的化學(xué)成分。地衣次生代謝物用標(biāo)準(zhǔn)薄層色譜法檢測(cè)，使用C系統(tǒng)[17-19]。

2.3 基因型分析

2.3.1 DNA的提取擴(kuò)增和測(cè)序

采用十六烷基二甲基溴化銨法(CTAB法)從55份乳嘴衣屬標(biāo)本的子囊組織中提取基因組DNA[20]，并PCR擴(kuò)增核糖體RNA基因區(qū)，包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)和大亞基rDNA(LSU)。擴(kuò)增引物分別為ITS4/ITS5[21-22]和AL2R/LR6[23-24]。25 μL的反應(yīng)體系包括引物各1 μL，2 μL基因組DNA，8 μL ddH2O和13 μL 2×Taq PCR MasterMix?。熱循環(huán)條件包括：(1)ITS：預(yù)變性95 °C 5 min；34個(gè)循環(huán)包括94 °C 30 s，52 °C 30 s，72 °C 60 s；最后72 °C延伸600 s。(2)LSU：預(yù)變性94 °C 300 s，35個(gè)循環(huán)包括95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 60 s；最后72 °C延伸600 s。目的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，并由Majorbio(上海)進(jìn)行測(cè)序。序列信息見表1。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用的地衣標(biāo)本

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將新測(cè)得的ITS和LSU序列與GenBank中下載的乳嘴衣科其他11條序列(表1)使用MEGA軟件進(jìn)行比對(duì)，以隸屬于Pleosporales的Arthopyreniasalicis為外群[25]，利用MEGA7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[26]。采用基于Tamura-Nei模型的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[27]，bootstrap值設(shè)為1000，相關(guān)分類單元聚集在一起的樹百分比顯示在分支旁邊，如圖1所示。

注：紅色字體表示的樣本為作者測(cè)序，其余為GenBank中下載序列。

3 結(jié)果分析

由圖1構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，Trypethelium、Marcelaria及Astrothelium屬各自形成單獨(dú)的分支。乳嘴衣屬分支具有97%的較高支持率，主要由乳嘴衣和T.subeluteriae組成。與該屬關(guān)系最近的類群是Marcelaria，這與Aptroot等[3]報(bào)道的結(jié)果一致，但與Marcelaria屬的區(qū)別在于后者子囊殼具較寬的小孔和較大的磚壁型子囊孢子。

4 描述和討論

4.1 乳嘴衣(圖2)

圖2 乳嘴衣Trypethelium eluteriae(憑證標(biāo)本GD19024)

TrypetheliumeluteriaeSpreng., Anleit.Kennt.Gew.3: 350(1804)

地衣體具皮層，橄欖綠至微黃色，光滑至不平坦，或具有疣狀突起。子囊殼頂端小孔，可見小點(diǎn)或較為寬闊，埋生于假子座中。假子座1～2 mm，突出至固著，淺棕色至深棕色，除小孔外，覆蓋有黃色色素，內(nèi)部通常具有黃色色素。盤被除小孔外其余碳化，33～57 μm，子實(shí)層清晰，孢子9～13隔，(37～52 μm)×(8～11μm)，無(wú)色透明。

化學(xué)：地衣體UV-，K-；假子座 UV+ 紅色，K+ 紫色，具有黃色的蒽醌類物質(zhì)。

基物：樹皮。

研究標(biāo)本：廣東深圳市，大鵬國(guó)家地質(zhì)公園，50 m，2019.1.17，劉飛月GD19036、GD19020、GD19024、GD19004、GD19049、GD19033。廣州市，中國(guó)科學(xué)院華南植物園，澳洲植物園，26 m，2019.01.20，姚宗廷GD19274、GD19265、GD19272、GD19267、GD19275、GD19269、GD19266；北門附近，22 m, 2019.01.21，姚宗廷GD19356；沙漠植物室，42 m，2019.01.21，劉飛月GD19305、GD19306、GD19307；西門處，23 m，2018.01.20，李敏GD19240、GD19241、GD19252、GD19226、GD19223、GD19251、GD19255、GD19239、GD19257、GD19253、GD19249；山茶園，27 m，2019.01.21，姚宗廷GD19293；棕櫚園，65 m，2019.1.18，劉飛月GD19190、GD19206、GD19181、GD19208。深圳市，仙湖植物園，龍尊塔附近，102 m，2019.1.18，姚宗廷GD19153、GD19154、GD19151、GD19143、GD19144、GD19177、GD19172、GD19161、GD19141；綜合樓附近，58 m，2019.1.18，姚宗廷GD19109、GD19104、GD19106、GD19105；木蘭園，104 m，2019.1.18，姚宗廷GD19130、GD19335、GD19339、GD19125、GD19348、GD19347、GD19128、GD19127、GD19126。

分布：泛熱帶地區(qū)[3]。上海[13]、江蘇[13]、浙江[13]、香港[14-16]和臺(tái)灣[9-10]。

討論：乳嘴衣是乳嘴衣屬的模式種，以該種為中心形成的單系類群為乳嘴衣組，代表了狹義乳嘴衣屬Trypetheliums.str.。該組主要是由幾個(gè)樹皮生物種組成，通常會(huì)產(chǎn)生假子座狀的子囊殼，假子座含有蒽醌類色素，也通常被蒽醌類色素覆蓋。在對(duì)中國(guó)乳嘴衣屬的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，該種表型極具多樣性，地衣體光滑至不平坦，或具有疣狀突起，子囊殼小孔可見小點(diǎn)，或較寬闊，周圍有黑色的邊緣(子囊殼露出來(lái)的部分)，子囊孢子無(wú)色透明，橫隔型，橫隔處不收縮。但是這些物種在表型上的微小差異均為種內(nèi)變異，其分子數(shù)據(jù)差異也較小。該種在化學(xué)成分上也具有較大的多樣性，Thrower[16]1988年報(bào)道了該種在香港的分布，在研究標(biāo)本中含有黑茶漬素，但是本文研究的廣東標(biāo)本中不含黑茶漬素。中國(guó)之前報(bào)道乳嘴衣的兩變種，其中一變種為聚球變種[T.eluteriaev.conglobatum(Ach.)Zahlbr.]，報(bào)道自中國(guó)臺(tái)灣[9,11]；另一變種為檸檬變種[T.eluteriaev.citrinum(Eschw.)Müll.Arg.]，Brotherus[28]1929年報(bào)道了中國(guó)廣東的該變種。根據(jù)Index Fungorum記載，該變種現(xiàn)被歸入乳嘴衣。由于該種的形態(tài)特征多樣，因此作者在文中不處理為變種。

4.2 白色乳嘴衣

TrypetheliumepileucodesNyl., Lich.Japan.: 116(1890)

地衣體殼狀，橄欖綠至黃棕色，光滑至不平坦。子囊殼頂端小孔，明顯的假子座狀。假子座0.5～1.5 mm寬，迸出，白色，有黑色的小孔，假子座不含有色素色。子實(shí)層清晰，子囊8孢，雙囊壁，孢子雙列排布。孢子無(wú)色透明，梭形，橫隔型，5～9(～13)隔，(30～60)μm×((5～)8～13)μm。

化學(xué)：地衣體和假子座UV-，K-，未檢測(cè)到化學(xué)物質(zhì)。

基物：樹皮。

分布：泛熱帶地區(qū)[3]。香港[14]。

討論：該種因假子座表面白色，不含有蒽醌類物質(zhì)而易與其他種區(qū)分，孢子5～9(～13)隔，(30～60)μm×((5～)8～13)μm。

4.3 臺(tái)灣乳嘴衣

TrypetheliumformosanumZahlbr., Feddes Repert.31: 204(1933)

地衣體殼狀，樹皮生，暗棕色，有淡白色斑點(diǎn)，光滑。子囊殼小孔淺黑色或略為白色。假子座與地衣體同色，2 mm寬，基部收縮，內(nèi)部暗棕色，K-。子實(shí)層清晰，子囊8孢，孢子無(wú)色透明，紡錘形，兩端圓鈍，胞室雙凸透鏡狀或幾乎圓形，3隔，(20～30)μm×(7～8)μm。

基物：樹皮。

分布：臺(tái)灣[9,11-12]。

討論：該種與斑點(diǎn)乳嘴衣相近，但在孢子特征上因該種孢子3隔，較小而與后者有明顯區(qū)別。

4.4 斑點(diǎn)乳嘴衣

TrypetheliumleprosulumZahlbr., Annls Mycol.30: 429(1932)

地衣體殼狀，樹皮生，深暗色，略有斑點(diǎn)或粉末。子囊殼頂端小孔，埋生在假子座中。假子座顏色與地衣體同色，形狀不規(guī)則，固著，幾乎成半球形，基部不收縮。子實(shí)層清晰，子囊8孢，孢子無(wú)色透明，梭形或指狀，頂端狹窄或圓鈍，圓形腔，7～9隔，(40～50)μm×(6～8)μm。

基物：樹皮。

分布：福建[12]。

討論：該種孢子大小與白色乳嘴衣相近，但是二者在地衣體的特征上有明顯的區(qū)別。

4.5 板孔乳嘴衣

TrypetheliumplatystomumMont., Annls Sci.Nat., Bot., sér.2 19: 72(1843)

地衣體具皮層，橄欖綠至微黃棕色，光滑至不平坦。子囊殼頂端具有小孔，明顯的假子座狀。假子座0.8～1.5 mm，突出，乳白色，顏色通常比地衣體白，小孔通常融合，周圍有橙色色素。子實(shí)層清晰，子囊8孢，孢子無(wú)色透明，梭形，橫隔型，12～18隔，(55～75)μm×(8～15)μm。

化學(xué)：地衣體UV-，K-；假子座頂部UV+紅色，K+紫色，具有橙色蒽醌類物質(zhì)。

基物：樹皮。

分布：泛熱帶地區(qū)[3]。云南[3]。

討論：在中國(guó)已知種中，該種較明顯的特征是假子座小孔周圍有一薄層橙色色素覆蓋，且孢子比其余4種孢子稍大。

5 中國(guó)乳嘴衣屬檢索表

1a.孢子3隔，(20～30)μm×(7～8)μm

T.formosanum

1b.孢子大于3隔

2

2a.假子座白色具有黑色的小孔，孢子5～9(～13)隔，(30～60)μm×((5～)8～13)μm

T.epileucodes

2b.假子座非白色

3

3a.小孔通常融合成葉狀，周圍覆蓋有一薄層橙色色素，孢子12～18隔，(55～75)μm×(8～15)μm

T.platystomum

3b.小孔周圍無(wú)橙色色素覆蓋

4

4a.子囊孢子9～13隔，(37～52)μm×(8～11)μm

T.eluteriae

4b.子囊孢子7～9隔，(45～50)μm×(6～8)μm

T.leprosulum

6 結(jié)論

乳嘴衣屬是一個(gè)嚴(yán)格的熱帶屬，國(guó)內(nèi)對(duì)于該屬的研究相對(duì)匱乏且缺乏系統(tǒng)性。乳嘴衣屬作為乳嘴衣科的模式屬，與其他屬明顯的區(qū)別是孢子類型以及圓形至橢圓形的腔。該屬的模式種乳嘴衣種內(nèi)變化較大，所以在之后對(duì)乳嘴衣屬的研究應(yīng)該在系統(tǒng)發(fā)育的框架之中，結(jié)合形態(tài)、解剖和化學(xué)特征來(lái)進(jìn)一步完善屬的概念，尋求更自然的屬的劃分界限。