杜海濤，王平，李娜，丁潔，張敬，袁成民，孫鐵鋒，韓莉，張忠法

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3.天津大學(xué) 精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3000722；4.濰坊市中醫(yī)院，山東 濰坊 261000；5.濟(jì)南市傳染病醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021)

新冠肺炎(COVID-19)是一種由新型高致病性的冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的蔓延到全世界范圍的急性呼吸道傳染病[1-2]。該病潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)，人群普遍易感，臨床上以發(fā)熱、干咳、乏力為初期表現(xiàn)，后期嚴(yán)重患者還會(huì)出現(xiàn)胃腸道嚴(yán)重不適、急性呼吸窘迫綜合征等癥狀，在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播，對(duì)人們的生產(chǎn)生活和健康造成了巨大威脅[3]。

山東省COVID-19病例以輸入性為主。該地地形復(fù)雜，沿海地區(qū)傍水、內(nèi)陸地區(qū)地平易濕，發(fā)病季為冬春之交，氣溫仍低，極易感外寒。而COVID-19具有典型的濕毒致病特點(diǎn)，疫毒從口鼻入，侵襲氣道，進(jìn)一步出現(xiàn)邪犯肺衛(wèi)、邪犯腸胃等證[4]?；颊邤y帶原發(fā)濕疫并由于山東復(fù)雜地域與時(shí)令，易從上向下至三焦傳變，多數(shù)病人辨證為“三焦疫毒寒濕癥”，《疫證治例》云“疫病邪自中作，或出而三陽(yáng)三陰之經(jīng)，入而三陽(yáng)之腑，三陰之臟，每隨人元?dú)庵癖　⑴K腑之寒熱以為傳化”。三焦疫毒寒濕癥藥隊(duì)出自濟(jì)南市COVID-19救治定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)——濟(jì)南市傳染病醫(yī)院總結(jié)的P2藥隊(duì)，針對(duì)COVID-19寒、濕、毒、瘀特點(diǎn)兼扶正達(dá)邪、三焦分治之《傷寒論》桂枝湯、《溫病條辨》三仁湯或藿樸夏苓湯化裁而來(lái)。藥隊(duì)由桂枝、廣藿香、防風(fēng)、貫眾、半夏、澤瀉、茯苓構(gòu)成：桂枝溫陽(yáng)化氣以利水，可解表宣肺；廣藿香芳香化濕之效溫煦而不燥烈，能除中焦?jié)裥?，并助脾胃正氣；防風(fēng)乃風(fēng)藥，可解表發(fā)汗、祛風(fēng)勝濕，瀉上焦補(bǔ)下焦，能治肺實(shí)，散肝舒脾；貫眾清熱解毒；清半夏燥濕化痰，降逆止嘔；澤瀉、茯苓淡滲利濕，可解困脾之濕，諸藥合用，可治療三焦疫毒寒濕。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)患者自身情況靈活加減味進(jìn)而演化成多個(gè)對(duì)癥COVID-19患者臨床用方，對(duì)收治入院的35例患者進(jìn)行治療，已取得良好的治療效果[5]。本研究從分子調(diào)控出發(fā)，運(yùn)用分子對(duì)接及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，尋找三焦疫毒寒濕癥藥隊(duì)治療COVID-19的直接及間接作用機(jī)制，確定在機(jī)體網(wǎng)絡(luò)中重要靶標(biāo)，為三焦疫毒寒濕癥系列方在抗疫戰(zhàn)中發(fā)揮更大的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥隊(duì)中入血成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese system pharmacology database and analysis platform, TCMSP, https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索桂枝、廣藿香、防風(fēng)、貫眾、半夏、澤瀉和茯苓的活性成分。根據(jù)TCMSP靶點(diǎn)篩選指南和化合物ADME(absorption, distribution, metabolism, excretion)參數(shù)，設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18，以此條件篩選，并下載*.mol2結(jié)構(gòu)文件建立藥隊(duì)中核心成分的數(shù)據(jù)庫(kù)[6]。

1.2 活性成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)

將收集的化學(xué)成分逐一輸入至Open Babel，將化合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為SMILES并導(dǎo)入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://swisstargetprediction.ch/)，設(shè)置種屬為“homosapiens”，將篩選后的化合物與數(shù)據(jù)庫(kù)中靶點(diǎn)進(jìn)行模擬對(duì)接，基于二維/三維結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測(cè)化合物靶點(diǎn)，選取結(jié)果Probability大于0的靶點(diǎn)建立化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化，生成藥隊(duì)成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)[7]。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.2下預(yù)測(cè)到的靶標(biāo)導(dǎo)入 STRING平臺(tái)(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，設(shè)定物種為人，將最低相互作用閾值設(shè)置為 0.99 進(jìn)行篩選，隱藏離散節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。下載結(jié)果以*.tsv 格式保存，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1可視化，并用Network analyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)特征靶點(diǎn)。以“度值”評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)的重要程度，度值代表網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接作用的節(jié)點(diǎn)數(shù)目，值越大表示參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)，并以度值數(shù)值大小為PPI節(jié)點(diǎn)著色。

1.4 基因本體論及信號(hào)通路分析

將靶點(diǎn)基因名用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)轉(zhuǎn)換為Uniprot ID。在DAVID(the database for annotation,visualization and intergrated discovery)6.8平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體分析(gene ontology,GO)及京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，選擇差異性有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)的條目，得到關(guān)鍵核心靶標(biāo)參與的過(guò)程及通路信息。

1.5 分子對(duì)接

在 PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)檢索 Mpro 與 ACE2 的人源高分辨晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: Mpro-6LU7; ACE2-1R42)，導(dǎo)入薛定諤Maestro 11.9軟件。使用Protein Preparation Wizard套件預(yù)處理原始結(jié)構(gòu)，包括向蛋白質(zhì)中添加氫原子、鍵順序的分配以及刪除5?以上的水分子；使用配體結(jié)合位點(diǎn)來(lái)定義蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)，使用Receptor Grid Generation套件，使用基于網(wǎng)格的能量學(xué)的配體對(duì)接算法(glide)生成格點(diǎn)文件；使用LigPrep套件對(duì)配體進(jìn)行預(yù)處理，包括互生成不同構(gòu)象和使用Epik在pH(7.0±2.0)下的電離態(tài)，添加氫原子，中和帶電基團(tuán)，優(yōu)化配體的幾何構(gòu)型；最后利用Ligand Docking套件進(jìn)行分子對(duì)接，分析格點(diǎn)結(jié)合能值分?jǐn)?shù)，該數(shù)值為負(fù)則提示能自由結(jié)合。本次研究設(shè)定對(duì)接得分小于-5為結(jié)合具有顯著性[8]，以此初步驗(yàn)證常用藥隊(duì)在COVID-19防治的直接作用機(jī)理。

2 結(jié)果

2.1 藥隊(duì)入血成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

從 TCMSP中檢索篩選獲得建立數(shù)據(jù)庫(kù)共含中藥活性成分共 77個(gè)，表1為其中的主要活性成分，全部活性成分請(qǐng)查閱OSID。通過(guò)Swiss Target Prediction獲取預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 4760 個(gè)。利用 Cytoscape3.7.1 構(gòu)建藥隊(duì)成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1，該網(wǎng)絡(luò)共898個(gè)節(jié)點(diǎn)，4841條邊。圖中，邊代表相互作用關(guān)系，綠色方形節(jié)點(diǎn)代表成分靶點(diǎn)，藍(lán)色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，紅色V型節(jié)點(diǎn)代表來(lái)源藥物。因部分成分沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)圖中成分節(jié)點(diǎn)共68個(gè)，其中MOL000358為半夏、防風(fēng)與桂枝的共有成分，MOL000359為防風(fēng)、桂枝與澤瀉的共有成分。

表1 常用藥隊(duì)活性成分信息

圖1 常用藥隊(duì)成分-靶標(biāo)

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

將STRING11.0平臺(tái)獲取的 PPI關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行可視化分析，生成PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示。該網(wǎng)絡(luò)共有218個(gè)節(jié)點(diǎn)、254條邊，其中，邊代表PPI關(guān)系，方形節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)蛋白，節(jié)點(diǎn)顏色代表度值高低。可見(jiàn)CDK1、AKT1、STAT3、CDK2與PLK1等靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮核心作用，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

注：顏色范圍，表示從左往右為度值降低。

2.3 GO和KEGG 富集結(jié)果

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8中進(jìn)行分析，包含3個(gè)分支，即分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)以及生物過(guò)程(BP)，篩選P≤0.01的過(guò)程，列出富集數(shù)前十位的過(guò)程(圖3)。其中，在MF層面，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)主要與蛋白結(jié)合(protein binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)和蛋白激酶活性(protein kinase activity)相關(guān)；在CC層面，胞漿(cytosol)、胞核(nucleus)和胞質(zhì)(cytoplasm)所占比例較大；在BP層面，與蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)關(guān)系緊密。

圖3 GO富集分析結(jié)果

通過(guò)KEGG富集分析藥隊(duì)核心成分抗COVID-19可能參與的通路，結(jié)果得到P≤0.01的信號(hào)通路共105條，圖4列舉了富集數(shù)前20位的相關(guān)通路。其中 PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、FOXO信號(hào)通路(FOXO signaling pathway)、RAS信號(hào)通路(RAS signaling pathway)和MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等與肺系疾病密切相關(guān)。KEGG富集分析表明藥隊(duì)的核心成分可能作用于這些通路，從而起到抵御新型冠狀病毒引起的各種癥狀的作用。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

Mpro 的晶體結(jié)構(gòu)為 6LU7(2.16 ?)，ACE2 的晶體結(jié)構(gòu)為 1R42(2.2 ?)。使用glide gscore來(lái)描述配體與受體蛋白的匹配程度，分?jǐn)?shù)絕對(duì)值越大，匹配程度越高[9-10]。二者結(jié)合分?jǐn)?shù)均小于-5的化合物得分如表2所示。其中，與IR42結(jié)合最佳的化合物是(2R)-5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并二氫吡喃-4-酮(MOL001040，glide gscore：-8.708，glide energy：-43.340)，與6LU7結(jié)合最佳的化合物是(+)-表兒茶素(MOL000073，glide gscore：-6.881，glide energy：-38.862)，對(duì)接模式見(jiàn)圖5。

表2 藥隊(duì)核心化合物分子對(duì)接分?jǐn)?shù)

圖5 分子對(duì)接模式

3 討論

SARS-CoV-2的感染會(huì)引起嚴(yán)重的肺部炎癥及并發(fā)癥，而宿主對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)有限，需要依靠強(qiáng)有力的外部干預(yù)。據(jù)國(guó)家中醫(yī)藥管理局通報(bào)，多地中醫(yī)藥治療COVID-19的參與率可達(dá)90%以上，對(duì)癥狀有明顯的改善作用[11]。水土有別，人文迥異，中醫(yī)藥的有效性關(guān)鍵是把握“辨證施治”原則，不應(yīng)只局限于直接抗病毒藥物，診療方案必須依據(jù)發(fā)病人群的不同進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，從調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)、改善體內(nèi)環(huán)境、扶持自身正氣、增強(qiáng)抵御外邪能力方面出發(fā)，亦可達(dá)到治療目的[12-13]。本文所提之藥隊(duì)由桂枝、廣藿香、防風(fēng)、貫眾、半夏、澤瀉、茯苓組成，貫眾味苦，性微寒，《普濟(jì)方》云“解一切諸熱度”，凡溫?zé)岫拘八轮C，皆可用之；桂枝解肌散邪，溫通利水；防風(fēng)發(fā)表勝濕；廣藿香芳香化濕，開(kāi)胃健脾；半夏燥濕化痰；茯苓、澤瀉，淡滲利濕，諸藥合用，可治療三焦疫毒寒濕。

基于SARS-CoV-2與SARS-CoV基因與結(jié)構(gòu)的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)二者基因序列同源性接近80%，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與ACE2受體的親和力明顯高于SARS-CoV，因此SARS-CoV-2傳染性更強(qiáng)[14]。ACE2受體在肺泡上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種人體細(xì)胞表面表達(dá)，是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)的關(guān)鍵分子[15]。在獲得SARS-CoV-2水解酶(Mpro)和ACE2高分辨率晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，結(jié)合虛擬篩選和酶學(xué)測(cè)試相結(jié)合的研發(fā)思路，是歸納篩選新藥的思路之一[16]。從分子對(duì)接角度來(lái)看，潛在有效化合物(+)-表兒茶素(MOL000073)、兒茶素(MOL000492)、3，23-二羥基-12-齊墩果烯-28-酸(MOL005923)、5-羥基-7，4′-二甲氧基黃烷酮(MOL005911)、(2R)-5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并二氫吡喃-4-酮(MOL001040)、黃芩素(MOL002714)、黃芩苷(MOL002776)同屬于黃酮類，占化合物數(shù)目的半數(shù)以上(54%)，此類化合物與Mpro、ACE2均有較好的親和性，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)價(jià)值。據(jù)報(bào)道，黃酮類化合物(尤其是黃酮醇類)具有廣泛的抗病毒抗菌作用[17]。Jo等[18]通過(guò)分子對(duì)接及蛋白水解法、色氨酸熒光法驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物(尤其是黃酮醇類)具有疏水性芳環(huán)和親水性羥基，能與SARS-CoV Mpro活性位點(diǎn)完美親和，并有效阻斷Mpro的活性使其失去原本調(diào)控復(fù)制的能力。綜上所述，藥隊(duì)中的黃酮類成分，具有靶向性的抗病毒、抗炎和抗氧化功效，其對(duì)接得分小于-5，能夠與靶蛋白自發(fā)結(jié)合，為開(kāi)發(fā)P2藥隊(duì)提供了重要的參考。

本研究基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段檢索到三焦疫毒寒濕癥藥隊(duì)77種活性成分，4760個(gè)潛在作用靶標(biāo)，構(gòu)建了其成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)PPI分析發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)CDK1、AKT1、STAT3、CDK2與PLK1在調(diào)控中起核心作用，STAT3、EGFR、JUN、MAPK3、PIK3R1、TNF、BCL2、IL1B等主要與細(xì)胞因子相關(guān)，是調(diào)控病毒引發(fā)機(jī)體過(guò)度免疫導(dǎo)致炎性因子風(fēng)暴的關(guān)鍵靶標(biāo)[19-20]。炎癥反應(yīng)對(duì)于病毒性肺炎是一把“雙刃劍”，有益的炎癥對(duì)局部組織抵抗感染具有幫助，但若COVID-19患者的炎癥加劇導(dǎo)致免疫過(guò)度反而會(huì)危及機(jī)體，造成彌漫性肺泡損傷和纖維化、呼吸衰竭和多器官功能障礙，控制炎癥反應(yīng)對(duì)于控制三焦?jié)窈Y狀向危重癥轉(zhuǎn)變有重要意義。STAT3可被干擾素(IFN)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、白介素(IL)絲裂素激活的蛋白激酶(MAPK)等激活，介導(dǎo)細(xì)胞多種基因的表達(dá)，在生長(zhǎng)、凋亡、免疫中起關(guān)鍵作用。有研究表明，STAT3直接抑制劑能限制細(xì)胞因子風(fēng)暴和T細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少[21]。一項(xiàng)針對(duì)COVID-19患者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示病毒可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡，其相關(guān)基因設(shè)計(jì)自噬相關(guān)基因BCL2、AKT1、MAPK、PIK3，凋亡相關(guān)基因JUN、BCL2、TNF、MAPK，p53信號(hào)相關(guān)BCL2、CDK2等[22]。提示藥隊(duì)多個(gè)核心成分參與調(diào)控COVID-19患者炎癥、免疫、凋亡、自噬等過(guò)程，多途徑多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)濕寒癥狀。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法考察了三焦疫毒寒濕癥P2藥隊(duì)治療COVID-19的作用機(jī)制，主要從抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抗癌等方面通過(guò)多途徑多靶點(diǎn)發(fā)揮作用。值得注意的是，受制于當(dāng)前對(duì)病毒和染病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不足、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)方法及數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)可靠性等自身局限性的影響，分子對(duì)接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)可能會(huì)存在與實(shí)際出現(xiàn)偏差的情況，需要進(jìn)一步深入研究。