范亞莉，洪軍，殷青寧，周林平，巨巧云，馬紹青，王積川

青海省婦女兒童醫(yī)院急診科，青海 西寧 810007

細(xì)胞因子是由活化免疫細(xì)胞合成分泌的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能作用的多肽分子，與免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合，參與細(xì)胞及體液免疫[1]，主要包括淋巴因子、干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子和集落刺激因子等[2]。細(xì)胞因子在疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，它們不僅作用于免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，還作用于神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)，對細(xì)胞的增殖分化和效應(yīng)功能有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。免疫球蛋白也是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子[4]。C3、C4通過多個補(bǔ)體激活途徑參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，參與抗感染的早期防御[5]。目前針對我國高海拔地區(qū)(＞3 000 m)藏族健康兒童的細(xì)胞因子及免疫球蛋白水平評估尚未見報道。因此，本研究以青海玉樹地區(qū)藏族和漢族健康兒童為研究對象，應(yīng)用流式細(xì)胞儀微球芯片(cytometricbeadarray，CBA)技術(shù)和免疫比濁法對其靜脈血清中細(xì)胞因子水平和免疫球蛋白及補(bǔ)體水平進(jìn)行檢測和分析，探討其水平變化并比較不同民族、不同性別和不同年齡之間的差異，以期為制定適用于不同年齡段兒童細(xì)胞因子檢測的正常參考值提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2019年12月在青海省婦女兒童醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢且世居在海拔＞3 000 m的青海玉樹地區(qū)的藏族兒童600例和漢族621例。藏族兒童中男性367例，女性233例；平均年齡(8.0±3.4)歲，按照年齡分組分為學(xué)齡前組(3～6歲)440例和少年組(7～14歲)160例。漢族兒童中男性337例，女性284例；平均年齡(8.6±3.0)歲，按照年齡分組分為學(xué)齡前組(3～6歲)237例和少年組(7～14歲)384例，兩組兒童的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。納入人群必須符合以下條件：(1)外周血細(xì)胞計數(shù)、肝腎功能、X線檢查無異常；(2)無心、腦血管疾??；(3)無先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾??；(4)無3周內(nèi)發(fā)生感染性疾病及急性時相反應(yīng)；(5)無HBV、HCB、HIV和梅毒等慢性感染性疾??；(6)近期未使用過影響免疫系統(tǒng)的藥物者。本研究經(jīng)青海省婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核通過(2017院倫審研第1號)，本人及家屬均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 于無菌條件下采集空腹12 h以上外周血3 mL，置入分離膠儲血管中，每分鐘3 000 r的速度進(jìn)行離心10 min，分離血清，待測。

1.2.2 儀器與試劑 雙激光四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀(美國BD FACS-cantoⅡ型流式細(xì)胞儀)。Th1/Th2細(xì)胞因子分析試劑盒(杭州塞基生物)。SIEMENSADVIA-2400全自動生化分析儀，診斷試劑盒(九強(qiáng))。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子 (1)基質(zhì)B的準(zhǔn)備：將5 mL實(shí)驗(yàn)緩沖液加入到凍干粉基質(zhì)B中，靜置至少15 min待凍干粉溶解，渦旋使其充分混勻。(2)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：向標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉中加入250 μL實(shí)驗(yàn)緩沖液，室溫下靜置10 min，將其標(biāo)記為C7；準(zhǔn)備六只空管，分別標(biāo)記為C6、C5、C4、C3、C2、C1，每管中加入25 μL梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，C0中只加入實(shí)驗(yàn)緩沖液。(3)加樣步驟：標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣本同步進(jìn)行，所有試劑在使用前應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定到室溫。向標(biāo)準(zhǔn)品管中加入25 μL基質(zhì)B和25 μL標(biāo)準(zhǔn)品；向樣品管中加入25 μL實(shí)驗(yàn)緩沖液和25 μL樣品，向所用管中加入25 μL混合微球和25 μL檢測抗體，用錫箔紙包被管子，室溫避光震蕩孵育2 h后每管中加入25 μL SA-PE，用錫箔紙包被管子，室溫避光震蕩30 min，250×g離心5 min，用移液槍將上清吸掉，再向每管中加入200 μL 1×洗滌緩沖液，250×g離心5 min，用移液槍將上清吸掉，最后向每管中加入150～300 μL洗滌緩沖液，重懸上機(jī)檢測。應(yīng)用BD Cellquest軟件獲取，獲取標(biāo)準(zhǔn)品曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)的熒光強(qiáng)度做定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而根據(jù)樣本檢測的熒光強(qiáng)度得到檢測濃度。

1.2.4 血清免疫球蛋白檢測 儀器采用SIEMENS ADVIA-2400全自動生化分析儀，試劑盒由九強(qiáng)診斷產(chǎn)品公司提供，采用免疫比濁法檢測血清中的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例數(shù)及百分比(%)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同民族和年齡兒童間的細(xì)胞因子水平比較 藏族兒童學(xué)齡前組和少年組之間比較，除IL-10以外，其余細(xì)胞因子比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。漢族學(xué)齡前與少年組之間IL-2、IL-6和IFN-γ水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。藏族學(xué)齡前組與漢族學(xué)齡前組的 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z分別為-7.526、-10.969、-7.698、-1.840、-11.028和-16.325，P均＜0.05)。藏族少年組與漢族少年組的IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z分別為-2.165、-1.966、-3.074和-2.549，P均＜0.05)，見表1。

2.2 不同民族和性別兒童間的細(xì)胞因子水平比較 藏族男性與女性之間比較，只有IFN-γ差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。漢族男性與女性之間比較，各檢測項(xiàng)目比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。藏族男性和漢族男性之間比較，藏族女性和漢族女性之間比較，除IL-10以外，其余細(xì)胞因子比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z分別為-4.558、-7.412、-7.698、-9.367、-14.109和-4.726、-6.791、-4.679、-7.800、-13.085；P均＜0.05)，且藏族細(xì)胞因子水平明顯低于漢族，見表2。

表1 藏族與漢族健康兒童細(xì)胞因子水平比較[pg/mL，M(P2.5，P97.5)]

表2 藏族與漢族不同性別健康兒童的細(xì)胞因子水平比較[pg/mL，M(P2.5，P97.5)]

2.3 不同民族和年齡兒童的免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4水平比較 藏族兒童學(xué)齡前組和少年組之間比較，只有IgA、IgM差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；漢族健康兒童學(xué)齡前組和少年組之間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。藏族學(xué)齡前組與漢族學(xué)齡前組兒童間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Z分別為-1.133、-0.705、-0.467、-0.229、-1.276，P均＞0.05)。藏族少年組與漢族少年組兒童間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z分別為-8.988、-6.892、-9.229、-11.380和-7.432，P均 ＜0.05)，見表3。

2.4不同民族和性別兒童間的免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4水平比較 藏族男性與女性之間的IgG和IgM水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。漢族男性與女性間的IgA和IgM水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。藏族兒童男性與漢族男性之間以及藏族兒童女性與漢族女性之間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z分別為-4.769、-5.440、-5.272、-3.219、-2.789和-7.726、-6.957、-5.430、-4.510、-3.841，P均＜0.05)，見表4。

表3 藏族與漢族不同年齡兒童的免疫球蛋白補(bǔ)體C3、C4水平比較[g/L,MP2,5,P97,5]

表4 藏族與漢族不同性別兒童免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4水平比較[g/L，M(P2.5，P97.5)]

3 討論

近年來細(xì)胞因子成為免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[6]，檢測細(xì)胞因子可監(jiān)測重癥患者是否發(fā)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是流感后肺炎發(fā)生的重要因素，在此次新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情中，患者病情急劇惡化與體內(nèi)爆發(fā)的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的升高[7]；還可分清機(jī)體炎癥及免疫狀態(tài)，利于精準(zhǔn)治療，比如促炎因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的升高提示炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，應(yīng)當(dāng)以抗炎為主，抗炎因子IL-4和IL-10升高提示免疫抑制狀態(tài)，應(yīng)當(dāng)以提升免疫為主[8]；還可指導(dǎo)臨床激素及抗炎藥的應(yīng)用以及急性感染的早期診斷[9]；IL-6水平與肝炎嚴(yán)重程度存在正相關(guān)，提示細(xì)胞因子水平對病毒感染的進(jìn)展起到關(guān)鍵作用[10]；膿毒血癥患兒出現(xiàn)炎癥時，血清IL-6和IL-10同時顯著升高[11]。細(xì)胞因子還與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，監(jiān)測細(xì)胞因子譜變化有助于腫瘤患者療效觀察[12]；CAR-T治療中細(xì)胞因子可作為CRS(細(xì)胞因子釋放綜合征)的伴隨診斷[13]；IL-6和IL-10可由腫瘤細(xì)胞自身分泌，使淋巴瘤、骨髓瘤及前列腺癌等腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，高表達(dá)IL-6和IL-10的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者容易復(fù)發(fā)耐藥，預(yù)后不良[14-15]。細(xì)胞因子作為調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)在免疫排斥反應(yīng)的起始階段即可出現(xiàn)明顯變化，研究表明，在排斥反應(yīng)過程中常伴有Th1型細(xì)胞因子表達(dá)增高和Th2型細(xì)胞因子不表達(dá)或低表達(dá)，而在免疫耐受時則相反[16]。此外，在不同的自身免疫性疾病中，Th1/Th2平衡失調(diào)的表現(xiàn)也各不相同。

高原低氧環(huán)境可引起機(jī)體免疫功能下降，導(dǎo)致免疫功能紊亂，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生，增加機(jī)體的炎癥反應(yīng)易感性，比如帶狀皰疹病毒、免疫異常性皮膚病及腦損傷局部炎性反應(yīng)等[17]，因此，了解高原低壓低氧環(huán)境下機(jī)體各細(xì)胞因子的表達(dá)水平有非常重要的意義。本研究結(jié)果表明：民族和年齡是造成細(xì)胞因子指標(biāo)差異的關(guān)鍵因素，除IL-10外，藏族兒童各細(xì)胞因子隨年齡增長表達(dá)水平均增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而漢族有具有不同的年齡變化趨勢，漢族兒童IL-2和IFN-γ隨著年齡增長表達(dá)水平下降，其余增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這與劉怡等[18]研究結(jié)果一致。蘭萱等[19]分析了100名鄭州地區(qū)健康漢族成年人的細(xì)胞因子，表明低海拔正常人群中血清細(xì)胞因子水平不受性別及年齡影響，結(jié)論與本研究不同，這可能與研究對象的年齡、人數(shù)、生活環(huán)境、飲食習(xí)慣和海拔高度不同有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，除IL-10外，不論整體比較還是男性和女性分別比較，藏族各細(xì)胞因子表達(dá)水平均低于漢族，說明民族也是造成細(xì)胞因子指標(biāo)差異的重要因素。藏族健康兒童僅有IFN-γ男性略高于女性，其余指標(biāo)均無性別差異，漢族所有指標(biāo)均沒有性別差異，這表明性別可能不是細(xì)胞因子影響因素，這還需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果還顯示，藏族兒童IgA、IgM隨年齡增長表達(dá)水平增高，其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而漢族漢族兒童免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4隨著年齡增長表達(dá)水平均增高，說明高原漢族兒童隨著年齡增長，對暴露的抗原刺激變得更敏感，免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟而導(dǎo)致分布不同，而高原藏族兒童僅有IgA、IgM水平符合這一規(guī)律，具體原因還有待繼續(xù)研究；不同民族之間比較，藏族和漢族學(xué)齡前組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而少年組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明隨著年齡增長，不同民族造成免疫系統(tǒng)發(fā)育的差異才開始顯示出來，且藏族健康兒童免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4水平整體高于漢族，這點(diǎn)與細(xì)胞因子檢測結(jié)果相反，表明藏族兒童免疫反應(yīng)能力較漢族兒童更強(qiáng)，可能與藏族居住青藏高原歷史較長，對高原低氧環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力和有不同于漢族的低氧適應(yīng)機(jī)制。本研究通過分析不同年齡段藏族和漢族健康兒童細(xì)胞因子、免疫球蛋白及補(bǔ)體C3、C4的表達(dá)水平，以求將此技術(shù)應(yīng)用于臨床來探討細(xì)胞因子在各種兒童疾病中所發(fā)生的改變，更有效地為臨床提供診斷依據(jù)。