吳俁，劉良麗，朱曉龍

貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550000

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，是一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)2030年，COPD將成為全球第三位的致死原因，COPD給全世界所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將其列為所有單病種排位的第五位[1-2]。肺間質(zhì)纖維化(pulmonary interstitial fibrosis，PIF)是以肺泡壁為主并包括肺泡周圍組織及其相鄰支氣管結(jié)構(gòu)發(fā)生病變的一組疾病群，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸團(tuán)難或刺激性干咳[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)和肺泡纖維化是COPD病變向肺組織深處發(fā)展的結(jié)果，PIF是COPD發(fā)展的必然趨勢(shì)和病理結(jié)局[4-5]。COPD合并PIF后，患者會(huì)出現(xiàn)更加嚴(yán)重的缺氧和肺部高血壓癥狀，預(yù)期的生存年限中位數(shù)也會(huì)降低至6年[6-7]。因此抑制COPD向合并纖維化發(fā)展有著重要的臨床意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smad通路是調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵通路，TGF-β1/Smad通路上調(diào)會(huì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化和遷移，在腎臟、肝臟和肺纖維化的研究中都發(fā)現(xiàn)了TGF-β1/Smad通路異常激活的情況[8-10]。本研究以COPD合并PIF大鼠模型為研究對(duì)象，檢測(cè)清肺保元湯對(duì)肺纖維化的抑制作用，探討清肺保元湯對(duì)TGF-β1/Smad通路的調(diào)控作用，以此豐富中藥治療COPD合并PIF的理論，為中醫(yī)中藥治療COPD合并肺纖維化提供有力佐證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠，雄性，250～300 g，15只[SCXK(湘)2016-0002，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司]、DcR3抗體(Abcam，ab8405)、香煙、養(yǎng)肺保元湯(黃芪30 g、黨參15 g、生地黃15 g、熟地黃15 g、太子參15 g、麥冬15 g、當(dāng)歸15 g、淮山藥15 g、川芎10 g、茯苓15 g、炒白術(shù)15 g、甘草3 g等，由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，用上述組方500 g加水1 000 mL煎煮兩遍，合并煎液為100 mL)。

1.2 主要試劑 蘇木素染液(AR11800-1，BOSTER)；伊紅染色液(AR11800-2，BOSTER)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(C1088，碧云天)；大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)試劑盒(MM-0181R1，酶免)；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(TA-08，中杉金橋，1/2 000)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金橋，1/5 000)；Rabbit Anti-Smad2(ab40855，Abcam，1/2 000)；Rabbit Anti-Smad3(ab40854，Abcam，1/1 000)；Rabbit Anti-Smad7(ab90086，Abcam，1/1 000)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金橋，1/5 000)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 15只SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成正常對(duì)照組3只、COPD合并PIF模型組4只(模型組)、COPD合并PIF+DcR3抗體4只(DcR3抗體組)、COPD合并PIF+養(yǎng)肺保元湯4只(養(yǎng)肺保元湯組)。除正常對(duì)照組外，大鼠按組分別置于自制60 cm×50 cm×40 cm的有機(jī)玻璃吸煙箱吸煙，煙量為5支/次，每天一次，每次吸煙時(shí)間為1 h，共計(jì)42 d，進(jìn)行COPD合并PIF造模。造模結(jié)束后開(kāi)始給藥，為期一個(gè)月，DcR3抗體給藥組大鼠尾靜脈注射DcR3抗體，濃度1 μg/mL，2次/d，每次3 mL；養(yǎng)肺保元湯給藥組大鼠每天灌胃養(yǎng)肺保元湯，3次/d，每次3 mL；而模型組大鼠每天灌胃生理鹽水，3次/d，每次3 mL。

1.4 HE染色 樣本用福爾馬林固定完畢后，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。將石蠟切片進(jìn)行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片，鏡檢。

1.5 TUNEL染色 將石蠟切片進(jìn)行烤片，然后脫蠟，水化。將切片移入濕盒，每個(gè)樣本上滴加50 μg/mL Proteinase K工作液，37℃反應(yīng)30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。每個(gè)樣本上滴加足夠量的TUNEL檢測(cè)液，45℃避光孵育2 h，PBS洗滌3次。封片，鏡檢。

1.6 ELISA檢測(cè) 血漿樣品直接進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止、測(cè)定等操作。用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.7 Western blot檢測(cè) 取組織液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入一EP管中，冰上裂解30 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜2 h。一抗溶液孵育，4℃過(guò)夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity One”軟件分析各條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。當(dāng)P值＜0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS19.0完成，統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad Prism6.01繪制。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的體質(zhì)量比較 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠每周稱量體質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示。在第7周時(shí)吸煙造模結(jié)束，給藥治療開(kāi)始。從第六周開(kāi)始，與正常組大鼠質(zhì)量比較，DcR3抗體組或者養(yǎng)肺保元湯組大鼠質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，雖然DcR3抗體組或者養(yǎng)肺保元湯組大鼠體質(zhì)量均值低于模型組，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DcR3抗體給藥組與養(yǎng)肺保元湯組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各項(xiàng)大鼠的體質(zhì)量比較

2.2 DcR3抗體和養(yǎng)肺保元湯對(duì)大鼠COPD合并PIF造模的治療效果 大鼠肺組織切片的HE染色和TUNEL細(xì)胞凋亡染色見(jiàn)圖2和圖3。與正常組比較，經(jīng)過(guò)COPD合并PIF造模的大鼠肺泡變小，肺泡間質(zhì)增厚有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織中有更多細(xì)胞凋亡。DcR3抗體給藥組和養(yǎng)肺保元湯給藥組大鼠肺泡間質(zhì)增生程度低于模型組，細(xì)胞凋亡水平也低于模型組。說(shuō)明兩個(gè)給藥組大鼠的肺組織相比于模型組大鼠更加健康。

2.3 DcR3抗體和養(yǎng)肺保元湯對(duì)TGF-β1/Smad通路的影響 WB檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織中Smad2、Smad3和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，養(yǎng)肺保元湯組以及DcR3抗體組大鼠肺組織中Smad2、Smad3和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而與養(yǎng)肺保元湯組比較，DcR3抗體組Smad3表達(dá)較高，Smad7表達(dá)量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但Smad2表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，其他各組大鼠血液中TGF-β1含量與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖4和圖5。

圖2 大鼠肺部組織HE染色結(jié)果(×100)

圖3 大鼠肺部組織TUNEL染色結(jié)果，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為凋亡細(xì)胞(×200)

圖4 大鼠肺組織中Smad2、Smad3和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)水平WB檢測(cè)結(jié)果

圖5 大鼠血漿中TGF-β1含量ELISA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2015年12月28日發(fā)布《2015中國(guó)成人煙草調(diào)查報(bào)告》稱，我國(guó)人群吸煙率為27.7%，其中男性吸煙率為52.1%，與5年前的調(diào)查相比，沒(méi)有顯著變化；吸煙是COPD的首要誘因[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)讓大鼠高強(qiáng)度被動(dòng)吸煙42 d來(lái)進(jìn)行造模，造模結(jié)束后1個(gè)月，取大鼠肺組織切片觀察可以見(jiàn)到經(jīng)過(guò)造模的大鼠肺部已經(jīng)出現(xiàn)了肺泡變小，肺泡間質(zhì)增厚且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況，可以認(rèn)為大鼠已經(jīng)處于肺間質(zhì)纖維化的狀態(tài)了。這也與COPD持續(xù)發(fā)展會(huì)導(dǎo)致并發(fā)PIF的理論相符。而且兩個(gè)給藥組大鼠肺間質(zhì)纖維化水平要低于未受處理組，可以推測(cè)在停止吸煙后，即使COPD不再受誘導(dǎo)，PIF也會(huì)持續(xù)發(fā)展，這顯示出了對(duì)PIF進(jìn)行治療的臨床意義。

TGF-β1/Smad通路是影響肺間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵通路。TGF-β1/Smad通路上調(diào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡，尤其對(duì)成纖維細(xì)胞的“上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移”過(guò)程有顯著的誘導(dǎo)作用，最終導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域的組織纖維化，特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化就是一種典型病癥[12-13]。TGF-β1/Smad通路中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是激活通路的細(xì)胞因子，而Smad則是一類受TGF-β受體激活的信號(hào)蛋白[14]。Smad2和Smad3被激活后會(huì)從TGF-β受體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，引發(fā)促纖維化基因過(guò)表達(dá)[15]。Smad7的表達(dá)同樣受Smad2和Smad3誘導(dǎo)，但是Smad7主要起著抑制TGF-β受體活性的功能，從而達(dá)到抑制TGF-β1/Smad通路的效果[16]。Fas信號(hào)通路會(huì)激活細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)TGF-β1/Smad通路有一定的拮抗效果[17-18]。DcR3是一種分泌蛋白，能夠結(jié)合Fas受體的對(duì)應(yīng)配體Faslg，從而降低Faslg和細(xì)胞表面的Fas受體的結(jié)合，達(dá)到抑制Fas通路的效果[19]。本實(shí)驗(yàn)中DcR3抗體組大鼠為接受尾靜脈注射DcR3抗體的COPD合并PIF大鼠，通過(guò)DcR3抗體結(jié)合DcR3，降低DcR3結(jié)合Faslg，從而上調(diào)Fas通路抑制TGF-β1/Smad通路，達(dá)到降低肺部纖維化的目的。而HE染色結(jié)果也反映出DcR3抗體組和養(yǎng)肺保元湯組大鼠肺間質(zhì)纖維化水平較低。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)進(jìn)一步研究各組大鼠肺組織中TGF-β1/Smad通路激活水平，來(lái)驗(yàn)證DcR3抗體和養(yǎng)肺保元湯對(duì)肺部TGF-β1/Smad通路的抑制效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組、模型組、DcR3抗體組和大鼠血液中TGF-β1含量都沒(méi)有顯著的組間差異，這也許說(shuō)明肺部組織表達(dá)的TGF-β1主要通過(guò)旁分泌作用于周圍組織，較少進(jìn)入血液。肺組織中COPD合并PIF造模的大鼠肺組織中Smad2、Smad3和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上升，而DcR3抗體和養(yǎng)肺保元湯能夠降低Smad2、Smad3和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)，這說(shuō)明COPD合并PIF造模會(huì)上調(diào)肺組織中TGF-β1/Smad通路，而上調(diào)的TGF-β1/Smad通路又會(huì)促進(jìn)組織纖維化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了DcR3抗體和保肺養(yǎng)元湯能夠抑制吸煙誘導(dǎo)COPD并發(fā)PIF的肺組織中TGF-β1/Smad通路的活性，有抑制COPD所并發(fā)的PIF進(jìn)一步發(fā)展的療效。

此外，本研究結(jié)果表明養(yǎng)肺保元湯和DcR3抗體具有相似性，也許說(shuō)明養(yǎng)肺保元湯的有效成分有著上調(diào)TGF-β1/Smad通路的效果，這一點(diǎn)值得在未來(lái)的研究中做進(jìn)一步探索。