王恒波 陳姝琦 郭晉隆 闕友雄

甘蔗抗黃銹病G1標(biāo)記的分子檢測及候選抗病基因的分析

王恒波 陳姝琦 郭晉隆 闕友雄*

福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室 / 國家甘蔗工程技術(shù)研究中心, 福建福州 350002

甘蔗黃銹病是屈恩柄銹菌(Butler)引起的一種世界性真菌病害, 導(dǎo)致產(chǎn)量減少和糖分降低, 給甘蔗產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究采用抗黃銹病分子標(biāo)記G1, 檢測我國和世界上重要的甘蔗栽培品種、野生種和近緣屬的抗黃銹病基因, 并對擴增的代表性特異條帶進行克隆測序、功能注釋和聚類分析, 推測其抗性基因的起源和進化。G1檢測結(jié)果表明, 國內(nèi)124份甘蔗栽培品種檢測到G1標(biāo)記的有83份, 占66.9%; 國外46份甘蔗栽培品種檢測到G1標(biāo)記的有31份, 占67.4%。34份甘蔗野生種和近緣屬中檢測到G1標(biāo)記的有17份, 占50%, 其中割手密種含有該基因比例最高, 為100%。功能注釋揭示, G1標(biāo)記的候選基因編碼一種細(xì)胞壁連接的類受體激酶, 并在甘蔗栽培品種的單倍體蛋白組數(shù)據(jù)庫中鑒定到3個相似度較高的蛋白, 這些蛋白都有細(xì)胞壁受體激酶結(jié)構(gòu)的胞外域、跨膜域和激酶活性的胞內(nèi)域。聚類結(jié)果則清晰展示了抗病候選基因的起源及進化關(guān)系, 具體可分為3組, 第1組來源于割手密種和大莖野生種; 第2組來源于大莖野生種、熱帶種和河八王屬; 第3組來源于割手密種、大莖野生種、中國種和栽培品種。研究結(jié)果為抗黃銹病甘蔗品種的選育提供重要的抗源支撐, 并為抗性分子機制的解析奠定基礎(chǔ)。

檢測; 分子標(biāo)記; 類受體激酶; 黃銹病; 甘蔗

甘蔗作為世界上最重要的糖料和能源作物之一,供應(yīng)全世界食糖總產(chǎn)的80%和生物能源的60%[1]。同時, 甘蔗也是植物遺傳學(xué)、多倍體基因組學(xué)研究的一種熱點植物。甘蔗銹病是一種重要的流行性真菌病害, 給蔗糖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失, 包括2個類型, 即分別由黑頂柄銹菌(Syd. et P. Syd.)和屈恩柄銹菌(Butler.)[2]引起的褐銹病和黃銹病。甘蔗黃銹病最早在澳大利亞發(fā)現(xiàn), 2000年大流行于甘蔗栽培品種Q124[3]。與甘蔗褐銹病相比, 甘蔗黃銹病發(fā)病的區(qū)域范圍相對較窄, 主要分布在澳大利亞、美國、印度、巴西等國家的部分地區(qū)[3-5], 近年來發(fā)病蔗區(qū)呈現(xiàn)逐年擴大趨勢, 引起甘蔗科技工作者尤其是育種家的廣泛關(guān)注和高度重視。王曉燕等[6]于2014年在我國云南蔗區(qū)首次發(fā)現(xiàn)甘蔗黃銹病, 表明該病害在中國蔗區(qū)也存在流行發(fā)生的風(fēng)險。因此, 對我國甘蔗種質(zhì)資源的黃銹病抗性, 在精準(zhǔn)檢測的基礎(chǔ)上, 進行系統(tǒng)地分析評價和抗性溯源, 具有十分重要的理論和實踐意義。

甘蔗為遺傳背景復(fù)雜、基因組龐大的多倍體植物, 尚未有利用基因定位方法獲得抗病基因的報道。目前, 利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù), 選育和種植抗病品種是防治甘蔗病害最為經(jīng)濟有效的方法之一。例如: 在法國的栽培品種R570上, 發(fā)現(xiàn)和定位到抗褐銹病的基因, 被證實對多個國家和地區(qū)的褐銹病分離物具有廣譜抗性, 現(xiàn)已開發(fā)出與基因緊密連鎖的2個分子標(biāo)記(R12H16和9O20-F4), 已經(jīng)作為診斷標(biāo)記在甘蔗抗褐銹病品種的選育中得到了廣泛的應(yīng)用[7-8]。此外, Yang等[1]在利用CP95-1039和CP88-1762雜交的擬“F1”分離群體, 鑒定到1個對表型貢獻率為58%的QTL位點(qORR109), 進而開發(fā)了抗黃銹病基因的分子診斷標(biāo)記G1, 為鑒定甘蔗黃銹病種質(zhì)資源提供了一個重要的技術(shù)方法。Yang等[1]根據(jù)Unigene序列(轉(zhuǎn)錄本ID: Seq_695109)設(shè)計了基因特異性標(biāo)記G1, 其候選基因和高粱的Sobic.002G166150以及擬南芥的(RESISTANCE TO FUSARIUM OXYSPOR UM 1)基因?qū)偻椿? 它是一類編碼細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)受體激酶[9]。迄今, 除了抗褐銹病的Bru1和抗黃銹病G1標(biāo)記外甘蔗中還報道了5個抗花葉病和11個抗黑穗病的DNA標(biāo)記[10], 1個主效的抗甘蔗黃葉病基因位點[11], 但都僅限于抗性位點的發(fā)現(xiàn), 尚未開發(fā)成可用的分子標(biāo)記, 難以用于甘蔗抗病基因的快速鑒定和抗病種質(zhì)的高效篩選。

目前, 國外甘蔗雜交育種計劃中, Bru1標(biāo)記常常被用于評估甘蔗種質(zhì)資源和雜交后代無性系的褐銹病抗性[6]。但是, 關(guān)于甘蔗黃銹病抗性標(biāo)記的應(yīng)用, 除了納入美國的育種計劃外, 其他國家都還未有深入的研究, 也尚未有相關(guān)研究結(jié)果的報道。在我國, 甘蔗黃銹病是一種新發(fā)現(xiàn)的甘蔗真菌病害[6], 但關(guān)于甘蔗種質(zhì)資源中抗黃銹病基因的分子檢測未見其他報道。為深入了解我國和世界上重要的甘蔗栽培品種、野生種和近緣屬中的抗黃銹病基因的分布狀況, 并闡述抗病候選基因的起源及進化關(guān)系, 本研究擬采用抗黃銹病標(biāo)記G1對中國及世界范圍內(nèi)重要的甘蔗栽培品種、野生種及近緣屬材料, 進行抗黃銹病的分子檢測, 進而對該標(biāo)記擴增的代表性片段進行克隆測序、功能注釋和聚類分析。旨在為國內(nèi)外甘蔗種質(zhì)資源的黃銹病抗性鑒定積累技術(shù)和經(jīng)驗, 為甘蔗對黃銹病抗性的起源和演化研究奠定基礎(chǔ), 最終為甘蔗抗黃銹病的分子育種和抗性基因的功能鑒定提供重要的研究基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于黃銹病抗性分子檢測的甘蔗栽培品種、野生種和近緣屬種質(zhì)總共204份, 其中包括170份栽培品種、28份甘蔗屬材料(割手密種、大莖野生種和熱帶種)和6份近緣屬(蔗茅屬、芒屬和河八王屬)種質(zhì)。國內(nèi)甘蔗品種124份, 來自8個不同育種機構(gòu), 包括四川6份、江西1份、臺灣15份、海南13份、福建9份、廣西47份、云南10份和廣東23份; 國外甘蔗品種46份, 其中美國30份, 其他國家16份。詳見附表1和附表2。所有材料都來自國家甘蔗種質(zhì)資源圃(National Germplasm Repository of Sugarcane)。

1.2 蛋白組數(shù)據(jù)的獲取

從法國農(nóng)業(yè)研究所甘蔗基因組中心(http://sug-arcane-genome.cirad.fr/)直接獲得甘蔗栽培品種單倍體R570蛋白組數(shù)據(jù)。高粱蛋白組數(shù)據(jù)來源于網(wǎng)址(https://phYuetang ozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html), 擬南芥的蛋白組數(shù)據(jù)庫來源于網(wǎng)址(https://www.arabidopsis. org/download/index-auto.jsp?dir=/download_files/Proteins)。菠蘿的蛋白組數(shù)據(jù)庫來源于網(wǎng)址(http://pineapple. angiosperms.org/pineapple/html/download.html)。擬南芥的基因(ID: AT1G21270.1-AtWAK2, AT1G 21250.1-AtWAK1(PRO25), AT1G79670.1-AtWAKL22, RFO1)來源于Zhang等[12]的報道。水稻的基因(ID: LOC_Os04g51040.1)和基因(ID: LOC_Os09g38850.1)分別來自孫儷靜等[13]和Wang等[14]的報道。

1.3 黃銹病抗性標(biāo)記G1的PCR擴增和分析

1.3.1 引物合成 依據(jù)Yang等[1]開發(fā)的黃銹病抗性標(biāo)記G1方法對所選的204份甘蔗栽培品種、野生種及近緣屬種質(zhì)進行檢測。G1標(biāo)記上游引物為5'-ACCATGGAAATCCATACGuitangC-3', 下游引物為5'-GGCCAACACTTAGGCCAATA-3'。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。G1標(biāo)記預(yù)期擴增產(chǎn)物長度為911 bp。

1.3.2 DNA提取和PCR擴增體系 采用CTAB法[15]從蔗葉中提取基因組DNA。PCR的反應(yīng)體系配置參考端木卜文等[16]的方法, 即每25 μL反應(yīng)體積中含有DNA模板2 μL、上游和下游引物各(10 μmol L–1) 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL、2×Plus Master Mix (Dye) 12.5 μL, 其中2×Plus Master Mix (Dye)試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。所有擴增均在T100 Thermal CYachengler (Bio-Rad Research, USA)擴增儀上進行。PCR反應(yīng)參照Yang等[1]建立的擴增程序, 94℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35個循環(huán); 最后在72℃下延伸5 min, 4℃保存。所有PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。100 bp DNA Ladder (100~1500 bp)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 黃銹病抗性標(biāo)記G1候選基因的克隆、測序和鑒定

1.4.1 擴增產(chǎn)物的回收、克隆與測序 利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物, 挑選差異性擴增條帶, 膠回收目標(biāo)DNA片段, 純化后, 連接到pMD18-T載體上, 從每個連接轉(zhuǎn)化的反應(yīng)板上挑取5個陽性克隆, 擴增培養(yǎng)后由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.4.2 細(xì)胞壁連接的類受體激酶WAK的鑒定

以高粱細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)的受體激酶(WAK) Sobic. 002G166150的蛋白為種子序列, 進行本地BlastP比對甘蔗栽培品種(R570)單倍體蛋白組數(shù)據(jù)庫, 蛋白質(zhì)篩選標(biāo)準(zhǔn)e-value值為10-2, 相似性為40%以上,獲得與高粱Sobic.002G166150的相似度較高蛋白序列。

1.5 生物信息學(xué)分析方法和工具

利用 Pfam (http://pfam.janelia.org/)和SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)在線軟件預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域, 確保其 N-末端含有一個或多個細(xì)胞壁GUB_WAK_bind結(jié)構(gòu)域、跨膜域、C-末端 Pkinase結(jié)構(gòu)域。采用DNAMAN 6.0將水稻、擬南芥、高粱和甘蔗的WAK蛋白進行多序列比對, 找出保守的氨基酸殘基。采用MEME在線軟件(http://meme- suite.org/tools/meme)預(yù)測WAK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。通過Clustal W軟件對4個物種的WAK蛋白的氨基酸序列進行比對, 將比對結(jié)果運用MEGA7.0軟件 (http://www.megasoftware.net/)利用最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 執(zhí)行參數(shù)為 Poission 模式(Dayhoff model)、全部刪除(complete deletion)和1000次重復(fù)有根樹(Bootstrap method 1000)。選用Adobe Illustrator CS6軟件進行加工和處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗栽培品種抗黃銹病標(biāo)記G1的PCR檢測

基于抗黃銹病標(biāo)記G1, 對國內(nèi)外甘蔗栽培品種共170份進行PCR檢測發(fā)現(xiàn), 中國栽培品種124份, 含有抗性標(biāo)記G1的有83份(占比66.9%); 國外栽培品種46份, 含有抗性標(biāo)記G1的有31份(占比67.4%), 其中來自美國的30個甘蔗栽培品種中, 含有抗性標(biāo)記G1的有21份(占比70%), 陽性率高于中國甘蔗栽培品種。

2.2 甘蔗野生種與近緣屬材料的抗黃銹病標(biāo)記G1的PCR檢測

對28份甘蔗屬野生種進行抗黃銹病標(biāo)記G1檢測發(fā)現(xiàn), 含有抗性標(biāo)記的有15份, 陽性率為53.6%。甘蔗屬野生種的檢測結(jié)果分別是印度種(1/3,HATUNI)、中國種(1/3, 桂林竹蔗)、大莖野生種(2/6, MOL-6081和福建大野)、割手密種(11/11)呈現(xiàn)陽性結(jié)果, 但是占甘蔗栽培品種染色體組70%~80%的熱帶種沒有檢測到911 bp的陽性結(jié)果。利用G1標(biāo)記對6份甘蔗a近緣屬材料進行檢測發(fā)現(xiàn), 蔗茅屬(1/2,貴州78-2-12)、河八王屬(1/2,廣西89-13)呈現(xiàn)陽性結(jié)果, 而芒屬的2個材料檢測結(jié)果為陰性。表明, G1標(biāo)記關(guān)聯(lián)的候選基因也分布于甘蔗野生種和近緣屬材料中, 其中所有參試割手密種質(zhì)G1檢測結(jié)果都為陽性。

1: HoCP 94-806; 2: 贛南99-591; 3: 粵糖00-236; 4: 桂糖05-827; 5: 桂糖00-257; 6: 崖城97-46; 7: 湛蔗80-101; 8: CP 67-412; 9: 桂糖05-322; 10: 崖城94-46; 11: 桂糖08-278; 12: 桂糖00-245; 13: CP 89-1509; 14: 桂糖05-3846; 15: 桂糖29; 16: 崖城93-26; 17: CP 72-2086; 18: 崖城94-30; 19: CP 92-1213; 20: HoCP 92-624; 21: 桂糖05-2605; 22: 崖城96-24; 23: 湛蔗22; 24: 崖城99-6; M:100 bp DNA ladder。

1: HoCP 94-806; 2: Gannan 99-591; 3: Yuetang 00-236; 4: Guitang 05-827; 5: Guitang 00-257; 6: Yacheng 97-46; 7: ZZ 80-101; 8: CP 67-412; 9: Guitang 05-322; 10: Yacheng 94-46; 11: Guitang 08-278; 12: Guitang 00-245; 13: CP 89-1509; 14: Guitang 05-3846; 15: Guitang 29; 16: Yacheng 93-26; 17: CP 72-2086; 18: Yacheng 94-30; 19: CP 92-1213; 20: HoCP 92-624; 21: Guitang 05-2605; 22: Yacheng 96-24; 23: ZZ 22; 24: Yacheng 99-6; M:100 bp DNA ladder.

2.3 G1標(biāo)記PCR擴增產(chǎn)物序列的獲得與分析

利用G1標(biāo)記檢測甘蔗種質(zhì)過程中發(fā)現(xiàn), 在部分種質(zhì)擴增到了與目標(biāo)條帶(911 bp)不一致的非特異性條帶, 如圖2中的泳道2、4、6、11、13、19、20所代表的分別為廣西89-13、印度1號、LA-purple、桂林竹蔗、四川79-1-26、福建89-1-1和福建大野。通過比較分析, 挑選12個具有代表性的差異條帶進行膠回收和克隆測序, 每個樣品均挑選5個陽性克隆測序。從12個甘蔗種質(zhì)中得到了34個候選基因的單倍型, 不同基因型種質(zhì)有1~5個等位基因, 擴增片段大小范圍分別是678~693、911~914、1073~1075和1303~1505 bp (圖3)。聚類結(jié)果表明, G1標(biāo)記所在基因型可以分為3組, 第1組來源于割手密種和大莖野生種; 第2組來源于大莖野生種、熱帶種和河八王屬, 其中熱帶種LA-purple的678 bp片段和河八王屬的693 bp片段間親緣關(guān)系較近, 可能由共同祖先分化而來; 第3組是來源于割手密種、大莖野生種和栽培品種, 核酸片段間相似度較高, 多態(tài)性低, 表明甘蔗栽培品種的抗性候選基因主要來源于割手密種。

2.4 G1標(biāo)記候選基因編碼蛋白WAK的鑒定和結(jié)構(gòu)特征分析

將2.3中克隆得到的所有DNA片段都在NCBI上進行序列比對發(fā)現(xiàn), 所有克隆片段基因都比對到高粱XM_002459982.2基因上, 通過高粱上的注釋發(fā)現(xiàn)它是一種細(xì)胞壁的類受體激酶基因。同時, G1標(biāo)記所在基因與擬南芥的基因?qū)儆谥毕低椿騕9], 表明本研究的G1標(biāo)記的候選基因也可能是一類水平抗性基因, 不是種間特異性抗性基因。

1: 貴州78-2-12; 2: 廣西89-13; 3: 廣東64號; 4: 印度1號; 5: 廣西79-8; 6: LA-purple; 7: 路達仕; 8: 云南95-19; 9: Katha; 10: 云南 95-35; 11: 桂林竹蔗; 12: 四川79-2-11; 13: 四川79-1-26; 14: 貴州78-2-28; 15: 貴州78-1-11; 16: 廣東30號; 17: 廣東21號; 18: 福建89-1-16; 19: 福建89-1-1; 20: 福建大野; 21: NG 77-004; 22: 57NG208; 23: 云南大野; 24: 51NG3; M: 100 bp DNA ladder。

1: Guizhou 78-2-12; 2: Guangxi 89-13; 3: Guangdong 64; 4: Yindu 1; 5: Guangxi 79-8; 6: LA-purple; 7: Loethers; 8: Yunnan 95-19; 9: Katha; 10: Yunnan 95-35; 11: Guilinzhuzhe; 12: Sichuan 78-2-11; 13: Sichuan 79-1-26; 14: Guizhou 78-2-28; 15: Guizhou 78-1-11; 16: Guangdong 30; 17:Guangdong 21; 18: Fujian 89-1-16; 19: Fujian 89-1-1; 20: Fujiandaye; 21: NG77-004; 22: 57NG208; 23: Yunnandaye; 24: 51NG3; M: 100 bp DNA ladder.

將高粱XM_002459982.2與Sobic.002G166150的蛋白序列進行比較發(fā)現(xiàn), 兩者相似性為96.8%, 前者蛋白序列的N端比后者僅多了30個氨基酸殘基,可能是由不同注釋方法引起的差異。以高粱Sobic.002G166150的蛋白為種子序列, 進行本地BlastP比對甘蔗栽培品種(R570)單倍體蛋白組數(shù)據(jù)庫, 得到3個相似度較高的蛋白序列Sh_208E10_ p000080 (相似度53%)、Sh_239A14_p000040 (相似度49.5%)和Sh_222N03_p000030 (相似度43.4%) (命名為ScWAK1、ScWAK2和ScWAK3)。通過Pfam軟件分析發(fā)現(xiàn), 3個蛋白都具有典型的植物細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)激酶結(jié)構(gòu)特征, 包括細(xì)胞壁受體結(jié)構(gòu)(GUB_ WAK_bind) 的胞外域、跨膜域和具有激酶活性的胞內(nèi)域(圖4)。再與擬南芥(WAK2, PRO25和RFO1)、水稻(OsDEES1)已鑒定的植物細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)激酶進行蛋白序列比對(圖5)發(fā)現(xiàn), Sh_239A14_ p000040蛋白在跨膜區(qū)的前端有EGF重復(fù)結(jié)構(gòu)域, 在胞內(nèi)域也具有典型的ATP結(jié)合基序和激酶活性位點。

2.5 甘蔗G1標(biāo)記候選蛋白與其他物種中已鑒定WAK蛋白的聚類分析

聚類分析結(jié)果表明, 3個甘蔗的WAK蛋白序列和高粱、水稻聚類為一組, 表明它們可能具有相似功能(圖6)。而擬南芥的2個成員(WAK2和PRO25)為一組, 且二者是由串聯(lián)重復(fù)事件產(chǎn)生。但水稻的OsWAK50和擬南芥的RFO1聚為一組, 表明二者可能起源于單雙子葉分化之前, 序列相似性僅為32.2%。MEME軟件的預(yù)測結(jié)果顯示, 來自栽培品種R570的Sh_208E10_p000080、Sh_239A14_p000040和Sh_222N03_p000030蛋白和高粱、水稻的WAK蛋白一樣具有10個基序, 除了OsDEES1蛋白少了C端的一個motif 5, 其余2組的4個WAK蛋白有9個完整的基序。根據(jù)Wang等[14]研究結(jié)果, 水稻中有4個OsDEES1的旁系同源基因, 都具有完整的C端, 表達譜分析表明, OsDEES1及旁系同源基因有不同的表達模式, 導(dǎo)致不同功能。綜上分析, 本研究推測甘蔗栽培品種的3個ScWAK蛋白也可能與OsDEES1具有相似的功能。

為了進一步了解WAK蛋白在物種間的進化關(guān)系, 從擬南芥的蛋白數(shù)據(jù)庫得到了21個WAKL蛋白[12], 水稻中獲得125個WAK/WAKL[17], 甘蔗栽培品種R570中得到了134個, 菠蘿蛋白數(shù)據(jù)庫中鑒定到20個, 高粱中鑒定了73個。通過生物信息分析發(fā)現(xiàn), 在單雙子葉物種中, WAK/WAKL基因數(shù)量存在顯著差異, 且單子葉植物的WAK基因多于雙子葉的擬南芥, 但缺少ρ全基因復(fù)制事件的菠蘿WAK基因數(shù)目為20, 與擬南芥相差不大, 這表明WAK基因數(shù)量的擴增現(xiàn)象可能發(fā)生在ρ全基因組復(fù)制事件之后。

3 討論

現(xiàn)代甘蔗栽培品種是熱帶種(L., 2=80,=10)和割手密種(L., 2=40~128,=8)雜交產(chǎn)生的雜交種, 再與熱帶種進行回交產(chǎn)生雜種后代, 具有遺傳背景高度雜合、多倍體和非整倍體性, 且染色體數(shù)目在100~130之間[18]。割手密種具有耐寒性、抗病性和再生能力強等優(yōu)良特性, 經(jīng)“高貴化”育種方法將甘蔗野生種質(zhì)血緣引入甘蔗栽培品種[19]。甘蔗栽培品種中來源割手密種的染色體數(shù)目大約占10%~15%, 種間重組的染色體數(shù)目大約占5%~10%。甘蔗黃銹病是近年來發(fā)生在蔗區(qū)的一種新的甘蔗流行性病害, 感病甘蔗品種的產(chǎn)量損失嚴(yán)重, 培育抗病品種是防控該病害最有效的策略。甘蔗育種從花穗雜交到品種審定往往需要12年左右時間, 具有投入大、周期長等缺點。因此, 了解甘蔗育種親本和其他野生或近緣屬種質(zhì)資源中抗黃銹病基因的分布狀況, 不僅有利于篩選抗性親本和科學(xué)組配雜交組合, 還能提高抗黃銹病分子育種的效率, 對于培育優(yōu)良抗病品種、高效地防控甘蔗病害具有重要意義。Yang等[1]利用群體遺傳學(xué)方法證實, 甘蔗黃銹病的抗性是由多個基因控制, 借助高密度遺傳圖譜, 定位到3個抗黃銹病基因位點(qORR109、qORR102和qORR4), 分別解釋表型變異的58%、8%和12%, 其中前2個位點對抗病性具有正效應(yīng), 而后1個位點為負(fù)效應(yīng)。此外, Yang等[1]還對應(yīng)設(shè)計了96對SSR標(biāo)記和61對基因特異性標(biāo)記, 經(jīng)反復(fù)測試, 開發(fā)了qORR109位點特異性高的G1標(biāo)記, 該標(biāo)記與黃銹病抗性存在顯著的關(guān)聯(lián)。根據(jù)候選基因編碼的蛋白序列比對后發(fā)現(xiàn), G1標(biāo)記的候選基因編碼的蛋白序列與高粱Sobic. 002G166150的蛋白序列相似度最高, 屬于細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)激酶類, 推測G1的候選基因可能是一類水平抗性基因, 不是種間特異性抗性基因。

ED: 胞外域; TM: 跨膜域; ID: 胞內(nèi)域。

ED: extracellular domain; TM: transmembrane region; ID: intracellular domain; EGF2: EGF2-like region; EGF-Ca: calcium-binding EGF-like domain.

EGF1: 表皮生長因子重復(fù)序列; EGF2: 鈣結(jié)合類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域; TM: 跨膜域; ATP-B: ATP結(jié)合位點; KAS: 激酶活性位點。

EGF1: EGF1-like region; EGF2: calcium-binding EGF-like domain; TM: transmembrane region; ATP-B: ATP-binding region; KAS: kinase active site are underlined.

本研究中, 利用G1標(biāo)記對204個甘蔗栽培品種、野生種和近緣屬種質(zhì)的檢測結(jié)果表明, 我國甘蔗栽培品種中抗性標(biāo)記檢出率為66.9%, 國外的甘蔗栽培品種檢出率為67.4%。檢出結(jié)果與Yang等[1]在F1分離群體中檢測結(jié)果(檢出率為65.8%)基本類似。我們推測, 黃銹病的抗性候選基因廣泛分布于大多數(shù)甘蔗栽培品種中, 這可能是甘蔗黃銹病相對其他甘蔗病害發(fā)病面積相對較小的主要原因之一。但是, 端木卜文等[16]在180份甘蔗材料中檢測到G1標(biāo)記, 占比5.6%, 與我們的甘蔗栽培品種中占比66.9%相比, 結(jié)果相差較大。

野生種是現(xiàn)代甘蔗栽培品種中抗病基因的重要來源[20], 亟須對其進行抗病鑒定、篩選優(yōu)良抗源并進一步挖掘抗病基因資源, 最終為抗病分子育種提供重要抗源材料。同時, 我們基于抗病診斷標(biāo)記G1, 追蹤甘蔗野生種質(zhì)中其標(biāo)記候選基因的起源和進化, 對深入分析甘蔗抗病遺傳基礎(chǔ)和選育優(yōu)良抗病品種具有重要價值。本研究中, 對34份甘蔗野生種及近緣屬材料進行抗黃銹病標(biāo)記G1檢測發(fā)現(xiàn), 含有抗性標(biāo)記的有17份(陽性率為50%), 其中28份甘蔗屬材料中檢測到抗性標(biāo)記的有15份(陽性率為53.6%)、6份甘蔗近緣屬中有2份材料(來自蔗茅屬和河八王屬)呈現(xiàn)陽性結(jié)果。表明G1標(biāo)記的候選基因在甘蔗野生種和近緣屬中都廣泛分布, 其中割手密種質(zhì)中抗性候選基因占最多, 這與前人研究中針對甘蔗種質(zhì)資源中褐銹病的抗源分析結(jié)果基本一致[21]。

運用G1標(biāo)記擴增抗性基因的單倍型進行聚類分析表明, 34個擴增基因片段按大小, 可分為4類, 其中678~693 bp擴增基因片段來源于熱帶種LA- purple和割手密種廣西89-13, 而1073~1075 bp來源于大莖野生種Mol-6081, 三者都同屬于聚類分析的第2組。911~914 bp擴增基因片段來源于割手密種四川79-1-26和福建大莖野生種、中國種和栽培品種, 都同屬于聚類分析的第3組, 也進一步闡明甘蔗栽培品種中的抗性基因主要來源割手密種。1303~1305 bp擴增基因片段來源于割手密種四川79-1-26和大莖野生種Mol-6081, 而1500 bp擴增基因片段來源于大莖野生種Mol-6081, 且2種擴增片段類型親緣關(guān)系較近, 都屬于聚類分析的第1組。從甘蔗栽培品種G1標(biāo)記的擴增結(jié)果來看(圖1), 抗性基因片段主要有3種類型, 一種是G1標(biāo)記的候選基因擴增片段為911 bp, 另外2種分別為大約1300 bp和1500 bp, 即使沒有擴增911 bp候選基因片段, 也有1300 bp和1500 bp擴增片段。表明, 除了來源于割手密種的染色體外, 甘蔗栽培品種也具有來源于大莖野生種的染色體片段。熱帶種被認(rèn)為是從大莖野生種家馴化而來, 不僅兩者具有相同的起源中心(新幾內(nèi)亞)和染色體基數(shù)=10[22], 而且利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對甘蔗屬進行聚類分析的研究證實, 熱帶種與大莖野生種具有較近的親緣關(guān)系[23], 本研究結(jié)果從側(cè)面也證明了其結(jié)論的準(zhǔn)確性。

Verica等[24]利用WAK1的蛋白序列對擬南芥和水稻數(shù)據(jù)庫進行比對, 找到一類與WAK結(jié)構(gòu)相似的WAK類似基因(WAK like genes, WAKLs), 除了少數(shù)基因缺少某些序列外(跨膜域和信號肽等), 大部分基因具有WAK的典型結(jié)構(gòu)特征, 且水稻中WAKL基因的數(shù)量遠多于擬南芥[17]。根據(jù)He等[25]研究結(jié)果, 在擬南芥1號染色30 kb內(nèi)鑒定到了5個高度相似的WAK基因(依次WAK4、WAK5、WAK3、WAK1和WAK2), 同時, WAKL1-7基因間都是成簇排列, 表明WAK/WAKL基因家族都發(fā)生了多次串聯(lián)復(fù)制事件。本研究中, 甘蔗栽培品種R570的基因組是基于高粱基因組組裝而成的一套單倍體基因組, 僅有4660 BAC大片段序列, 鑒定了134個WAK/WAKL蛋白, 目前尚無法確定編碼這些蛋白的基因復(fù)制類型。將甘蔗、高粱、水稻與擬南芥的WAK蛋白進行序列比對發(fā)現(xiàn), 與擬南芥蛋白WAK相比, 來自C4作物高粱和甘蔗的WAK蛋白N端胞外域都具有額外的140氨基酸, 可能存在其他特殊的功能, 而C端的氨基酸數(shù)量與擬南芥、高粱的WAK蛋白的氨基酸基本一致, 但該結(jié)果與Wang等[14]報道的水稻OsDEES1分析結(jié)果不一致。需要特別注意的是, WAK蛋白在胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域相似性較高(69.1%), 表明該家族比較保守, 在細(xì)胞內(nèi)可能傳遞或介導(dǎo)相似的信號通路; 但是胞外域同源性就很低, 大約27.3%~33.6%之間, 表明這類蛋白的胞外域結(jié)構(gòu)變異大, 可以結(jié)合不同類型的配基, 來應(yīng)答不同的環(huán)境信號, 分析結(jié)果與He等[25]報道相一致。

甘蔗褐銹病和黃銹病抗性都屬于數(shù)量性狀, 受多基因控制[1,21,26]。前人根據(jù)主效基因的定位結(jié)果, 分別建立了與甘蔗褐銹病和黃銹病抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記(R12H16、9O20-F4和G1)及其檢測方法[1,11]。研究表明, 褐銹病抗性標(biāo)記檢測與表型鑒定之間的關(guān)聯(lián)分析準(zhǔn)確性較低, 即表型鑒定為抗病的甘蔗植株其分子標(biāo)記檢測結(jié)果可能為陰性[26], 這些結(jié)果暗示除了外, 還有其他抗性基因的存在[20,26]。造成這些結(jié)果的原因是已經(jīng)建立的甘蔗遺傳圖譜密度較低[1,11], 但數(shù)量性狀抗性則由多個基因位點控制[1,21,26], 因此需要進一步增加遺傳圖譜密度, 找出所有控制抗性的基因位點, 并建立多個抗性位點的標(biāo)記檢測方法, 這種情況下分子標(biāo)記檢測與表型鑒定之間的關(guān)聯(lián)分析才顯得更有意義[26]。本研究中, 黃銹病抗性屬于多基因控制, 僅進行單一分子標(biāo)記檢測與表型鑒定的關(guān)聯(lián)驗證, 意義和價值不大。進一步的研究, 需要在加密甘蔗遺傳圖譜的基礎(chǔ)上, 獲得控制甘蔗黃銹病抗性的所有基因位點并開發(fā)出系列標(biāo)記, 進而將所有這些標(biāo)記的檢測結(jié)果與表型鑒定結(jié)果相互驗證、相互映襯, 以獲得真實可靠的甘蔗黃銹病抗性鑒定結(jié)果, 為甘蔗抗黃銹育種奠定良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究揭示了G1標(biāo)記的候選基因廣泛分布于甘蔗栽培品種、野生種和近緣屬, 其中割手密種含有該基因比例最高?；诒容^基因組學(xué), 從甘蔗栽培品種R570蛋白數(shù)據(jù)庫中鑒定到3個與候選抗黃銹病WAK基因編碼蛋白相似度較高的蛋白, 蛋白結(jié)構(gòu)特征和保守結(jié)構(gòu)域分析表明, 該蛋白為一種細(xì)胞壁連接的類受體激酶。聚類分析揭示G1標(biāo)記擴增的候選基因可分為3組, 第1組來源于割手密種和大莖野生種; 第2組來源于于大莖野生種、熱帶種和河八王屬; 第3組來源于割手密種、大莖野生種和栽培品種, 推測甘蔗栽培品種的G1標(biāo)記候選基因主要來源于割手密種。以上結(jié)果為甘蔗抗黃銹病基因的圖位克隆及抗性溯源甚至抗性分子機制的解析積累了重要的理論和實踐基礎(chǔ)。

附表 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.China crops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

[1] Yang X, Islam M S, Sood S, Maya S, Hanson E A, Comstock J, Wang J. Identifying quantitative trait loci (QTLs) and developing diagnostic markers linked to orange rust resistance in sugarcane (spp.).,2018, 9: 350.

[2] Ryan C C, Egan B T. CHAPTER XIII-rust. In: Ricaud C, Egan B T, Gillaspie A G, Hughes C G, eds. Diseases of SugarcaneAmsterdam: Elsevier, 1989. pp 189–210.

[3] Braithwaite K S, Croft B J, Magarey R C, Scharaschkin T. Phylogenetic placement of the sugarcane orange rust pathogenin a historical and regional context.,2009, 38: 380–388.

[4] Elmhirst J F, Verma N. First report of anthracnose of salal caused by colletotrichum acutatum in British Columbia.,2007, 92: 175–175.

[5] Barbasso D, Jord?o H, Maccheroni W, Boldini J, Bressiani J, Sanguino A. First report of, causal agent of orange rust of sugarcane, in Brazil.,2010, 94: 1170–1170.

[6] 王曉燕, 李文鳳, 黃應(yīng)昆, 張榮躍, 單紅麗, 羅志明, 尹炯. 云南蔗區(qū)首次發(fā)現(xiàn)由屈恩柄銹菌引起的甘蔗黃銹病. 中國農(nóng)學(xué)通報,2015, 31(18): 273–277. Wang X Y, Li W F, Huang Y K, Zhang R Y, Shan H L, Luo Z M, Yin J. First report of orange rust of sugarcane caused byin Yunnan sugarcane field., 2015, 31(18): 273–277 (in Chinese with English abstract).

[7] Le Cunff L, Garsmeur O, Raboin L M, Pauquet J, Telismart H, Selvi A, Grivet L, Philippe R, Begum D, Deu M, Costet L, Wing R, Glaszmann J C, D’Hont A. Diploid/polyploid syntenic shuttle mapping and haplotype-specific chromosome walking toward a rust resistance gene () in highly polyploid sugarcane (2approximately 12approximately 115).,2008, 180: 649–660.

[8] Asnaghi C, Roques D, Ruffel S, Kaye C, Hoarau J Y, Télismart H, Girard J C, Raboin L M, Risterucci A M, Grivet L, D’Hont A. Targeted mapping of a sugarcane rust resistance gene () using bulked segregant analysis and AFLP markers.,2004, 108: 759–764.

[9] Diener A C, Ausubel F M. RESISTANCE TO, a dominantdisease-resistance gene, is not race specific.,2005, 171: 305–321.

[10] Wei X, Jackson P A, McIntyre C L, Aitken K S, Croft B. Associations between DNA markers and resistance to diseases in sugarcane and effects of population substructure.,2006, 114: 155–164.

[11] Costet L, Le Cunff L, Royaert S, Raboin L M, Hervouet C, Toubi L, Telismart H, Garsmeur O, Rousselle Y, Pauquet J, Nibouche S, Glaszmann J C, Hoarau J Y, D’Hont A. Haplotype structure aroundreveals a narrow genetic basis for brown rust resistance in modern sugarcane cultivars.,2012, 125: 825–836.

[12] Zhang S, Chen C, Li L, Meng L, Singh J, Jiang N, Deng X W, He Z H, Lemaux P G. Evolutionary expansion, gene structure, and expression of the rice wall-associated kinase gene family.,2005, 139: 1107–1124.

[13] 孫麗靜, 張芊, 路鐵剛, 孫穎. 利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選水稻類受體激酶OsWAK50胞內(nèi)域相互作用蛋白. 生物化學(xué)與生物物理進展, 2012, 39: 438–447. Sun L J, Zhang X, Lu T G, Sun Y. Screen of receptor-like kinase OsWAK50 intracellular interacting proteins by yeast two-hybrid system., 2012, 39: 438–447 (in Chinese with English abstract).

[14] Wang N, Huang H J, Ren S T, Li J J, Sun Y, Sun D Y, Zhang S Q. The rice wall-associated receptor-like kinase geneplays a role in female gametophte development.,2012, 160: 696–707.

[15] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.,1980, 8: 4321–4326.

[16] 端木卜文, 黃鄭輝, 吳小斌, 高小寧, 謝振文, 齊永文. 甘蔗(species hybrid)種質(zhì)資源褐銹病和黃銹病抗性位點分子檢測. 分子植物育種, 2019, 18: 2626–2632. Duan-Mu B W, Huang Z H, Wu X B, Gao X N, Xie Z W, Qi Y W. Molecular detection of resistance loci to brown rust and orange rust in sugarcane germplasm resources., 2019, 18: 2626–2632 (in Chinese with English abstract).

[17] Shiu S H, Karlowski W M, Pan R, Tzeng Y H, Mayer K F X, Li W H. Comparative analysis of the receptor-like kinase family inand rice.,2004, 16: 1220–1234.

[18] Hermann S R, Aitken K S, Jackson P A, George A W, Piperidis N, Wei X, Kilian A, Detering F. Evidence for second division restitution as the basis for 2+maternal chromosome transmission in a sugarcane cross.,2012, 187: 359–368.

[19] Piperidis G, Piperidis N, D’Hont A. Molecular cytogenetic investigation of chromosome composition and transmission in sugarcane.,2010, 284: 65–73.

[20] 李文鳳, 王曉燕, 黃應(yīng)昆, 張榮躍, 單紅麗, 羅志明, 尹炯. 101份中國甘蔗主要育種親本褐銹病抗性鑒定及基因的分子檢測. 作物學(xué)報. 2016, 42: 1411–1416. Li W F, Wang X Y, Huang Y F, Zhang R Y, Shan H L, Luo Z M, Yin J. Identification of resistance to brown rust and molecular detection ofgene in 101 main sugarcane breeding parents in China.,2016, 42: 1411–1416.

[21] 李文鳳, 王曉燕, 黃應(yīng)昆, 張榮躍, 單紅麗, 尹炯, 羅志明. 31份甘蔗野生核心種質(zhì)資源褐銹病抗性鑒定及基因的分子檢測. 作物學(xué)報,2015, 41: 806–812.Li W F, Wang X Y, Huang Y K, Zhang R Y, Shang H L, Yin J, Luo Z M. Identification of resistance to brown rust and molecular detection ofgene in 31 wild core sugarcane germplasms., 2015, 41: 806–812 (in Chinese with English abstract).

[22] D’Hont A, Ison D, Alix K, Roux C. Determination of basic chromosome numbers in the genusby physical mapping of ribosomal RNA genes.,2011, 41: 221–225.

[23] Brown J, Schnell R J, Power E, Douglas S. Analysis of clonal germplasm from fivespecies:,,,andA study of inter- and intra-species relationships using microsatellite markers.,2007, 54: 627–648.

[24] Verica J A, He Z H. The cell wall-associated kinase (WAK) and WAK-like kinase gene family.,2002, 129: 455–459.

[25] He Z H, Cheeseman I, He D, Kohorn B D. A cluster of five cell wall-associated receptor kinase genes, are expressed in specific organs of.,1999, 39: 1189–1196.

[26] Racedo J, Perera M F, Bertani R, Funes C, González V, Cuenya M I, D′Hont A, Welin B, Castagnaro A P.gene and potential alternative sources of resistance to sugarcane brown rust disease.,2013, 191: 429–436.

Molecular detection of G1 marker for orange rust resistance and analysis of candidate resistancegene in sugarcane

WANG Heng-Bo, CHEN Shu-Qi, GUO Jin-Long, and QUE You-Xiong*

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / National sugarcane Engineering Technology Research, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Sugarcane orange rust is an important fungal disease caused byButler, which could lead to a reduction in sugarcane production and sugar content and cause serious losses to the sugarcane industry in worldwide. In this study, the molecular marker G1 was used to detect orange rust resistance genes in cultivars, ancestral species and the relatedofin the world. The representative amplified bands were cloned, sequenced, functionally annotated, and clustered, and the origin and evolution of resistance genes was then analyzed. The results showed that 83 and 34 were detected with G1 marker, accounting for 66.9% and 67.4% in 124 Chinese and 46 foreign sugarcane cultivars, respectively. Among 34 sugarcane ancestral species and the related genus of, 17 were detected by G1 marker, accounting for 50%, of which the highest percentage (100%) was in. Functional annotation revealed that G1 target gene encoded a wall-associated receptor-like kinase (WAK), and three proteins with high similarity were identified from the haploid proteome database of sugarcane cultivars. These proteins all contain the extracellular domain, transmembrane domain and intracellular domain with kinase activity of typical cell wall receptor structures. Phylogenetic analysis of nucleotide sequences clearly showed the origin and evolution of the candidate resistancegenes. Specifically, thegenes amplified by G1 marker could be divided into three groups. The first group is fromand. The second group is from,and. The third group is from,,and cultivars. These results provided an important support for breeding of sugarcane cultivars resistant to orange rust, and lay a foundation for further analysis of molecular mechanism of resistance genes.

detection; molecular markers; wall-associated receptor-like kinase; orange rust; sugarcane

10.3724/SP.J.1006.2021.04131

本研究由引進國際先進農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計劃(948計劃)項目(2014-S18), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(糖料)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-17)和福建農(nóng)林大學(xué)?？萍及l(fā)展專項(KFA18025A)資助。

This study was supported by the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology (948 Program) (2014-S18), the China Agricultural (Sugar Crop) Research System (CARS-17), and the Fujian Agriculture and Forestry University Science and Technology Development Special Fund (KFA18025A).

闕友雄, E-mail: queyouxiong@126.com

E-mail: wanghengbo_0354@126.com

2020-06-18;

2020-10-14;

2020-11-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201030.1639.006.html