胡冬秀 劉 浩 洪彥彬 梁炫強(qiáng) 陳小平

花生莢果發(fā)育過程中的microRNA鑒定與表達(dá)分析

胡冬秀**劉 浩**洪彥彬 梁炫強(qiáng) 陳小平*

廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國家油料作物改良中心南方分中心 / 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 廣東廣州 510640

花生(L.)是典型“地上開花、地下結(jié)果”的作物, 為從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平解析此獨(dú)特的果實(shí)發(fā)育現(xiàn)象, 本文應(yīng)用small RNA測序技術(shù)研究莢果發(fā)育11個(gè)時(shí)期果殼及種子中的microRNA及其靶基因。通過測序分別獲得212個(gè)已知的microRNA和112個(gè)新microRNA, 其中, 已知microRNA包括197個(gè)保守microRNA和15個(gè)花生特異microRNA, 新microRNA來自62個(gè)新的microRNA前體序列。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 67個(gè)microRNA及其靶基因在莢果發(fā)育的11個(gè)時(shí)期存在時(shí)空特異性表達(dá), 部分microRNA的表達(dá)量積累階段性調(diào)節(jié)果殼與種子的發(fā)育, 表明microRNA參與了花生莢果暗發(fā)育的整個(gè)過程。此外, 對28個(gè)microRNA與30個(gè)靶基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn), microRNA和靶基因的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果基本一致。本研究通過對花生莢果不同發(fā)育時(shí)期的果殼和種子進(jìn)行small RNA測序, 鑒定參與調(diào)控花生莢果膨大相關(guān)的microRNA, 為研究黑暗條件下植物果實(shí)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制與花生遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

花生; 莢果發(fā)育; small RNA測序; microRNA; 靶基因

花生作為“地上開花、地下結(jié)果”的作物, 其生殖發(fā)育過程與其他作物存在差異?；ㄉ_花受精后, 子房柄伸長并向地生長形成果針, 位于其頂端的受精胚珠隨著果針的伸長被推入土壤中, 果針停止伸長, 胚胎發(fā)育在黑暗條件下重新啟動(dòng), 最終膨大形成莢果?；ㄉv果發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程, 不同水平的調(diào)控對花生莢果種子發(fā)育均至關(guān)重要。研究microRNA如何調(diào)控黑暗條件下花生種子發(fā)育, 對理解植物果實(shí)暗發(fā)育調(diào)控與作物遺傳改良具有重要意義。

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA, 在植物中通常由18~24個(gè)核苷酸組成, 通過靶向降解或翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[1]。植物中非編碼的microRNA基因, 在NOT2和CDC5等轉(zhuǎn)錄因子的作用下通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄物Pri-microRNA (Primary microRNA)。隨后Pri-microRNA經(jīng)DCL1、HY1和SE組成的切割復(fù)合體剪切產(chǎn)生前體pre-microRNA (microRNA前體)[2], pre-microRNA經(jīng)DCL1與DCL4進(jìn)一步剪切生成成熟的microRNA[3], 在甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1的作用下使其3'端發(fā)生2'-O-甲基化來增強(qiáng)其穩(wěn)定性[4-5]。microRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HST作用下從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中, 隨后與AGO效應(yīng)蛋白(argonaute proteins, AGOs)結(jié)合形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complexes, RISCs)中, 結(jié)合互補(bǔ)的靶向基因信使RNA后使其被剪切降解[6]。microRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子, 參與植物的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)、器官分化以及病原菌調(diào)控等多種生物學(xué)過程[7-14]。擬南芥中, FUL蛋白與ARF (auxin response factor)相互作用并結(jié)合到miR172前體序列的啟動(dòng)子區(qū)域, 通過抑制miR172下游靶基因與3表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)果實(shí)發(fā)育[15]; 人為干預(yù)miR319的表達(dá)活性則導(dǎo)致擬南芥花瓣變短、雄蕊敗育、種子缺失等現(xiàn)象[16]。單子葉植物中, 水稻OsIDD2與SLR1相互作用, 通過赤霉素途徑調(diào)控miR396介導(dǎo)的細(xì)胞增殖過程[17]; 而OsmiR408剪切OsUCL8編碼序列會(huì)影響細(xì)胞中的銅離子穩(wěn)態(tài)、質(zhì)體藍(lán)素豐度與水稻光合效率, 從而增加穗部分枝和粒數(shù)[18]?；ㄉ艿近S曲霉侵染時(shí), 種子通過降低ayh-miRNA160、ayh-miRNA164對抗病基因TIR-NBS-LRR表達(dá)量產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控效應(yīng), 從而提高抗病蛋白的表達(dá)量以抵御黃曲霉污染[19]?；ㄉ臃勘械腶yh-miR160a、ayh-miR171n與ayh-miR156e通過調(diào)控其靶基因參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 在花生莢果、種子膨大階段起關(guān)鍵作用[20]。

花生(L.)是我國重要的油料與經(jīng)濟(jì)作物, 莢果暗發(fā)育是花生最顯著的特征之一, 已有相關(guān)研究報(bào)道非編碼小RNA參與了花生胚胎與莢果早期的發(fā)育[21-22], 但對其莢果種子發(fā)育的整個(gè)過程缺乏全面的了解, 尤其對microRNA方面的相關(guān)研究仍然較為欠缺。本研究以‘粵油7號’為試驗(yàn)材料, 對其莢果發(fā)育不同時(shí)期的材料進(jìn)行small RNA測序, 并利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證測序的結(jié)果, 鑒定和篩選出花生莢果種子發(fā)育過程中相關(guān)的microRNA及其在花生莢果種子發(fā)育過程中的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生品種粵油7號種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地。對粵油7號植株的自交花進(jìn)行鑒定并用彩色線標(biāo)記, 在花后第8天用彩色標(biāo)簽系好伸長的果針。花生果針入土前, 被標(biāo)記為第1個(gè)時(shí)期, 命名為P0 (Pod 0); 莢果開始膨大后通過測量莢果與種子的直徑大小, 將整個(gè)莢果發(fā)育劃分為10個(gè)時(shí)期, 即P1~P10 (Pod1~Pod10), 其中果殼與種子分開取樣。果殼樣品以縮寫SH (Shell)表示, 種子樣本以縮寫SD (Seed)表示。本研究共對11個(gè)時(shí)期, 包括1個(gè)地上(果針即將入土)和10個(gè)地下發(fā)育階段(圖1-A), 以開花后天數(shù)為參考, 莢果與種子直徑為主要指標(biāo)來劃分生育期, 最后獲得20份樣品。

1.2 RNA的提取及small RNA測序

利用TRIzol (Invitrogen)法提取20個(gè)樣品的總RNA, 使用NanoDrop (Thermo Scientific)和安捷倫2100生物分析儀(安捷倫)對每個(gè)樣品的RNA質(zhì)量進(jìn)行評估分析; 利用Illumina small RNA-seq文庫構(gòu)建試劑盒制備small RNA測序文庫, 利用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)產(chǎn)生原始測序數(shù)據(jù)。

1.3 small RNA測序結(jié)果分析

利用Fastx-Tool kit, 對small RNA序列的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選, 去除接頭序列、低質(zhì)量序列, 包括冗余堿基或未被識別的堿基冗余序列, 以及小于18 nt的序列。將過濾后的數(shù)據(jù)利用Rfam 11.0數(shù)據(jù)庫和GenBank非編碼RNA數(shù)據(jù)庫去除t/r/sn/snoRNA以及帶有ployA尾巴的RNA, 對其他的small RNA序列利用microRNA19.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTn搜索, 以檢索花生中已知的microRNA。此外, 利用Bowtie將small RNA序列映射到GenBank中的AHGI v2.0和花生GSS中進(jìn)行比對, 完全匹配的序列將用于進(jìn)一步分析。如果接近完全匹配的序列小于檢索的small RNA或已知small RNA的長度, 則人工挑選檢查與比較不匹配部分, 以確定匹配核苷酸的數(shù)量。為了有效識別花生中潛在的microRNA前體序列和新的microRNA, 用miREAP預(yù)測軟件分析microRNA前體序列, 利用MiPred對由此產(chǎn)生的莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行過濾, 剩余的pre-microRNA的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)使用CentroldFold軟件進(jìn)行評估。

1.4 花生莢果發(fā)育過程中microRNA趨勢分析

microRNA測序數(shù)據(jù)以RPKM (reads per kilobase per million mapped reads)值表示, 將表達(dá)量數(shù)據(jù)歸一化分析。差異表達(dá)的microRNA以RPKM > 10為篩選標(biāo)準(zhǔn), 以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)利用TBtools軟件繪制表達(dá)熱圖, 利用STEM軟件對花生莢果發(fā)育過程中的microRNA和靶基因進(jìn)行趨勢分析, 并獲得顯著性和非顯著性表達(dá)模式, 其中≤0.05的定義為顯著表達(dá)模式。

1.5 莖環(huán)RT-PCR熒光定量檢測microRNA

取5 μg總RNA加入DNase I去除基因組DNA污染, 利用TaKaRa SMART Scribea Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶對microRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取2 μg的總RNA樣品中加入終濃度為2 μmol L-1的microRNA的莖環(huán)引物, 將混合物在72℃預(yù)熱3 min后置于冰上冷卻使RNA變性, 打開二級結(jié)構(gòu)。隨后加5×First Strand Buffer、dNTP Mix、20 mmol L-1DTT、0.15 μL RRI (recombinant RNase inhibitor, 40 U μL-1)。加入1 mL (100 U μL-1) SMART Scribe RT再次混勻, 42℃孵育60 min, 反應(yīng)結(jié)束后70℃加熱15 min或加入4 μL 50 mmol L-1EDTA終止反應(yīng)。熒光定量PCR方法參照試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書, 上述反轉(zhuǎn)的cDNA樣品濃度稀釋為150 ng μL-1。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL, 包含10 μL SYBR Green Master Mix、2 μL模板、特異性正向引物和通用反向引物各0.4 μL、0.4 μL ROX Reference Dye I、6.8 μL的ddH2O。ABI Step OnePlus儀器檢測, 循環(huán)反應(yīng)為95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán);為內(nèi)參基因, 用2-ΔΔCT法計(jì)算microRNA表達(dá)水平的相對定量, 每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 Quantative real time-PCR檢測靶基因表達(dá)量

利用Prime Script RT試劑盒(TaKaRa, 中國大連)將1 μg總RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA, 反應(yīng)體系為20 μL, 采用ABI Step One Plus系統(tǒng), 使用SYBR Premix Ex(TaKaRa, 中國大連)進(jìn)行PCR反應(yīng), 用2-ΔΔCT法計(jì)算目標(biāo)基因各組織的相對表達(dá)量, 以P0作為對照樣品。作為內(nèi)參基因, 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù), 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean± SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生莢果種子發(fā)育的表型特征

花生開花受精后, 子房柄不斷伸長形成果針(P0)。隨著果針的伸長, 位于其頂端的受精胚珠進(jìn)入土壤中, 當(dāng)果針剛進(jìn)入地下時(shí)(P1), 其直徑并未發(fā)生變化(圖1-B)。在黑暗條件下, 果針停止伸長, 頂端迅速膨大形成莢果(P2~P6)。通過測量直徑, 果殼在P6時(shí)期的直徑大小是P2時(shí)期的5~6倍, 但是P6階段過后, 果殼基本不再繼續(xù)膨大, 因此進(jìn)入土壤后的第6個(gè)時(shí)期是果殼發(fā)育逐漸停止的時(shí)期。種子發(fā)育在P2~P6階段生長緩慢, 在P6期果殼不再發(fā)育之后, 種子則以較快的速度開始充實(shí), 其直徑從P6到最后的成熟期, 至少增大了3倍以上。表明, 果殼早于種子開始發(fā)育, 果殼的提前膨大為后續(xù)種子生長提供了空間和能量, 兩者間發(fā)育的時(shí)間差有利于能量物質(zhì)有效地供應(yīng)種子生長。

A: 試驗(yàn)樣品信息; B: 花生莢果種子發(fā)育的表型特征。P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實(shí)充實(shí)期; P9~P10: 成熟期。

A: summary of experimental samples; B: phenotype characteristics of peanut pod (shell and seed) development. P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

2.2 花生莢果發(fā)育過程中small RNA分析

對花生果殼和種子發(fā)育的20個(gè)樣品進(jìn)行small RNA測序, 共獲得282,960,633個(gè)reads, 每個(gè)文庫的reads數(shù)量從7,049,655到17,761,513。對接頭序列和短序列進(jìn)行修剪后, 共得到206,940,419個(gè)序列(圖2-B), 長度大于17 nt。其中長度在18~30 nt的有177,581,859條, 有38,699,203條為花生中的特異small RNA。

microRNA屬于微小的非編碼RNA, 在轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控中具有重要作用。為全面了解莢果發(fā)育過程中microRNA的全基因組信息, 從花生莢果種子發(fā)育過程中鑒定了長度為18~30 nt的small RNA序列(圖2-A), 在21個(gè)和24個(gè)核苷酸處觀察到了花生地下莢果種子發(fā)育(P1~P10)的2個(gè)主要高峰。果殼文庫(P2SH~P10SH)有2個(gè)接近的高峰, 而種子文庫(P2SD~P10SD)則以24個(gè)核苷酸small RNA為主。值得注意的是, 氣生莢果P0中19個(gè)核苷酸處出現(xiàn)1個(gè)額外的高峰, 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 這19個(gè)核苷酸序列中的大多數(shù)來自于幾個(gè)高度表達(dá)的microRNA。此外, 在最初的地下莢果P1中, 總的small RNA在27~30個(gè)核苷酸之間高度表達(dá), 但24個(gè)核苷酸small RNA在所有樣本中均占優(yōu)勢, 在種子和果殼的總small RNA中分別占74%和72%, 表明花生的small RNA是類型復(fù)雜且多樣的非編碼RNA。

A: 全部以及特異性small RNA的長度分布和頻率; B: small RNA統(tǒng)計(jì)分析; C: small RNA的分類。P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實(shí)充實(shí)期; P9~P10: 成熟期。

A: length distribution and frequency of total and unique small RNAs; B: summary statistics of small RNAs; C: the categories of peanut small RNAs. P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

2.3 花生莢果發(fā)育過程中small RNA的鑒定

為進(jìn)一步鑒定花生中保守的和新的特異性microRNA, 我們通過圖3所示的策略分析small RNA。對接頭和短序列進(jìn)行過濾后, 共得到38,699,203條花生的特異small RNA, 隨后去除t/r/sn/snoRNA共15,326,397條, 其中rRNA的數(shù)量最多, 其次是tRNA、snRNA和snoRNA數(shù)量相對較少(圖2-C)。得到38,326,363條候選的small RNA, 鑒定到212個(gè)已知的microRNA, 包括39個(gè)microRNA家族的197個(gè)保守的microRNA和13個(gè)microRNA家族的15個(gè)特異microRNA (附表1)。經(jīng)過逐步篩選, 本研究還獲得62個(gè)新的microRNA二級前體結(jié)構(gòu)以及其對應(yīng)生成的112個(gè)新的成熟microRNA。將前體命名為ahy-MIR-s (1~62)。利用RNAfold在線軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWeb- Suite/RNAfold.cgi)預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)(圖4), 所有前體都能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu), 多數(shù)前體形成4~6個(gè)莖環(huán), 此外, ahy-MIR-s23、ahy-MIR-s31和ahy-MIR-s57等3個(gè)前體形成了3個(gè)莖環(huán), ahy-MIR-s2、ahy-MIR-s36和ahy-MIR-s56 3個(gè)前體有7個(gè)莖環(huán), ahy-MIR-s45和ahy-MIR-s20分別形成1個(gè)和8個(gè)莖環(huán)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 112個(gè)新的成熟microRNA (表1)定位于62個(gè)的新的Pre-miRNA的3￠臂或5￠臂, 并將其命名為ahy-miR-s(1-62)-3/5P, 大小為19~24 nt, 其中ahy-miR-s8-3p為19 nt, ahy-miR-s3-5p、ahy-miR-s7- 5p和ahy-miR-s29-5p等7個(gè)microRNA為20 nt, ahy-miR-s1-3p、ahy-miR-s2-3p和ahy-miR-s3-3p等40個(gè)microRNA為21 nt, 序列長度為22 nt和23 nt的microRNA分別為12個(gè)和6個(gè), ahy-miR-s6-5p、ahy-miR-s15-5p和ahy-miR-s16-3p等46個(gè)microRNA長度為24 nt。

2.4 花生莢果發(fā)育過程中microRNA的表達(dá)分析

對RPKM大于10的microRNA進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 在花生莢果11個(gè)發(fā)育階段共有67個(gè)microRNA差異表達(dá)。利用TBtools軟件[23]進(jìn)行聚類分析和繪制熱圖(圖5)發(fā)現(xiàn), microRNA在莢果發(fā)育過程動(dòng)態(tài)表達(dá), 且呈時(shí)期特異性。在種子中microRNA的表達(dá)可分為K1、K2和K3三個(gè)簇, K1簇中microRNA在種子發(fā)育中表達(dá)相對較低。在K2簇中microRNA在種子成熟期(P7~P10)高表達(dá)。例如, ahy-miR166e、ahy-miR-s21-5p和ahy-miR-s26-5p在P8具有較高的表達(dá)量, 而ahy-miR-s1-3p、ahy-miR319c、ahy- miR-s29-5p和ahy-miR-s53-5p等4個(gè)microRNA在P10表達(dá)顯著高于其他時(shí)期; ahy-miR166h-3p、ahy-miR168a和ahy-miR-s12-5p等microRNA在P8~P10都呈現(xiàn)了較高的表達(dá)。K3簇中microRNA主要在P5~P7中表達(dá), 其中ahy-miR319i、ahy- miR390a-5p和ahy-miR-s31-5p等3個(gè)microRNA在種子初期(P2)有較高表達(dá)。ahy-miR167-3p、ahy-miR- s36-5p和ahy-miR-s10-5p等3個(gè)microRNA在P4~P6均有較高表達(dá)。在種子發(fā)育過程中P3時(shí)期microRNA的表達(dá)都相對較低。microRNA在果殼中的表達(dá), 聚類將其分為了5個(gè)簇, C1簇中microRNA在果殼P8~P10高度表達(dá), 例如, ahy-miR319c、ahy-miR156b-5p和ahy-miR167e分別在P10、P9和P8時(shí)期高豐度表達(dá)。C2簇主要在果殼發(fā)育初期(P2)高豐度表達(dá), C3簇中microRNA呈現(xiàn)階段性表達(dá), 主要在P5~P9期有較高的表達(dá)量, 例如ahy- miR167c在P7~P9均表達(dá)較高。C4簇中microRNA在果殼中呈現(xiàn)低表達(dá), C5簇主要在P3呈現(xiàn)高表達(dá)。表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)一步表明, microRNA在果殼和種子中都以高度階段性或時(shí)期特異性的方式表達(dá)。

花生莢果發(fā)育過程中microRNA的趨勢分析結(jié)果顯示, 花生莢果發(fā)育中的microRNA共分為10種表達(dá)模式(圖6-A), 大約84%的microRNA聚類到兩種模式, 其中有43個(gè)microRNA聚類為profile.9表達(dá)模式(圖6-B), 13個(gè)microRNA聚類為profile.8表達(dá)模式, 說明花生莢果發(fā)育過程中多數(shù)microRNA歸入上述2個(gè)顯著表達(dá)模式。microRNA在花生莢果發(fā)育過程中的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的, 在profile.9表達(dá)模式中, 花生莢果發(fā)育初期(P2~P5期)中microRNA的表達(dá)在種子中呈現(xiàn)下調(diào), 在果殼中表達(dá)也較低, 隨后microRNA表達(dá)上調(diào), 種子和果殼發(fā)育中期(P6~P7期) microRNA表達(dá)達(dá)到最高, 花生莢果發(fā)育后期microRNA表達(dá)下調(diào)。在profile.8表達(dá)模式中, 花生莢果發(fā)育過程中microRNA的表達(dá)均處于上調(diào), 在種子發(fā)育P4和P7期表達(dá)最高, 而在果殼中P9期表達(dá)最高。在其他幾個(gè)表達(dá)模式中, microRNA在花生莢果發(fā)育的不同時(shí)期的積累水平也存在一定的差異。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實(shí)充實(shí)期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

2.5 花生莢果發(fā)育過程中靶基因的表達(dá)分析

microRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其下游靶基因來發(fā)揮生物學(xué)功能, 對67個(gè)microRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析, 按照錯(cuò)配數(shù)≤5進(jìn)行篩選, 共得到552個(gè)靶基因, 其中ahy-miR482e的靶基因數(shù)目最多(32個(gè)), ahy-miR-s51-3p和ahy-miR-s58-5p的靶基因數(shù)目最少(僅1個(gè))。大多數(shù)保守的microRNA的靶基因是MYB、ARF和BEL1-like等轉(zhuǎn)錄因子, 其他microRNA的靶基因包括NB-LRR型抗病蛋白、F-box/FBD/LRR重復(fù)蛋白和鋅指蛋白等, 此外還有部分未知功能的靶基因。為了進(jìn)一步了解所預(yù)測靶基因的可能功能, 對其進(jìn)行表達(dá)模式分析, 如圖7所示, 其靶基因在花生果殼和種子發(fā)育過程中也呈現(xiàn)了高度階段性和特異性的表達(dá)方式。例如,為BEL1-like轉(zhuǎn)錄因子, 在種子的P6期高豐度表達(dá), 而和分別在果殼的P4和P3期高豐度表達(dá)。編碼了NB-LRR抗病蛋白, 在種子中表達(dá)量較高, 而在果殼中幾乎不表達(dá)。介導(dǎo)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)途徑, 在莢果發(fā)育的后期, 即種子和果殼的P7~P10期均有較高的表達(dá)。值得注意的是,在莢果發(fā)育的整個(gè)過程中均高豐度表達(dá), 但對其功能有待研究。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實(shí)充實(shí)期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

對花生莢果發(fā)育過程中靶基因表達(dá)趨勢進(jìn)行分析表明, 花生莢果發(fā)育過程中靶基因共有20個(gè)表達(dá)模式(圖8)。其中有profile.7、profile.11、profile.18和profile.19等4個(gè)顯著表達(dá)模式, 在profile.7表達(dá)模式中, 基因在種子P6~P9中高豐度表達(dá), 在種子成熟期基因表達(dá)逐漸下調(diào), 而在果殼中表達(dá)相對較低。在profile.11表達(dá)模式中, 基因在種子和果殼的發(fā)育早期表達(dá)最高。在profile.18中基因在莢果發(fā)育的過程中均處于上調(diào)表達(dá), 在種子P3和P6以及果殼的P9時(shí)期表達(dá)量最高。在profile.19中, 種子發(fā)育早期基因表達(dá)量較低, 在P6時(shí)期基因上調(diào)表達(dá), 而在果殼發(fā)育早期基因表達(dá)量較高, P8期開始下調(diào)表達(dá)。

2.6 RT-PCR實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測序結(jié)果數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性, 選取28個(gè)microRNA和30個(gè)靶基因分別進(jìn)行莖環(huán)RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn), microRNA和靶基因的表達(dá)趨勢與測序分析結(jié)果基本一致(圖9)。例如, 在microRNA中(圖9-A), ahy-miR-s29-5p和ahy- miR166d分別在種子P10和果殼P3高豐度表達(dá); ahy-miR2118a在果殼中高豐度表達(dá), 而在種子中表達(dá)相對較低; ahy-miR156e在種子發(fā)育過程中從P3時(shí)期開始有表達(dá), P7時(shí)期表達(dá)量最高, 隨后逐漸降低, 而在果殼中幾乎不表達(dá)。在靶基因表達(dá)中(圖9-B),編碼的AUX1蛋白基因在果殼P10時(shí)期的表達(dá)顯著高于其他時(shí)期,為GATA轉(zhuǎn)錄因子, 在種子的P8時(shí)期高表達(dá),為乙醇酸氧化酶基因, 該基因在種子P7~P9時(shí)期均高豐度表達(dá), 呈現(xiàn)階段性的表達(dá)方式?？傮w而言, 熒光定量檢測結(jié)果表明, microRNA及其靶基因的表達(dá)量與測序結(jié)果基本一致, 該結(jié)果為后續(xù)深入分析、克隆microRNA及其靶基因調(diào)控花生莢果發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實(shí)充實(shí)期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

3 討論

為了解花生莢果發(fā)育過程的表型特征, 對花生莢果的1個(gè)地上發(fā)育時(shí)期和10個(gè)地下發(fā)育時(shí)期的研究發(fā)現(xiàn), 果針向地生長過程中(即P0~P1時(shí)期)不斷伸長但其直徑幾乎不變, 果針入土后停止生長, 胚胎恢復(fù)發(fā)育, 莢果迅速膨大, 即P2~P6時(shí)期是莢果體積的快速增長階段, 而種子的發(fā)育相對滯后, 即在這一時(shí)期生長相對緩慢。在P6時(shí)期后莢果大小基本不變, 種子則進(jìn)入快速生長階段。因此, P6時(shí)期既是莢果停止膨脹的分界點(diǎn), 也是種子進(jìn)入快速發(fā)育階段的分界點(diǎn)。

本研究獲得了62個(gè)新的Pre-microRNA和112個(gè)新的成熟的microRNA, 對Pre-microRNA進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn), 所有前體均具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu), 且多數(shù)序列(A+U)含量高于(G+C)含量, 說明鑒定得到的microRNA前體結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。成熟的microRNA在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3￠臂或5￠臂上, 并能檢測到其表達(dá)。此外, 對microRNA進(jìn)行表達(dá)模式分析表明, microRNA在莢果發(fā)育過程中的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的, 且呈現(xiàn)階段性和特異性表達(dá)。例如, ahy-miR390a-5p在種子P2時(shí)期表達(dá)較高, 在甘藍(lán)型油菜中, miR390通過調(diào)控靶基因的表達(dá)介導(dǎo)早期胚胎發(fā)育, 從而影響其種子的含油量, 推測ahy-miR390a-5p可能參與花生莢果發(fā)育早期胚胎的發(fā)育[24]。ahy-miR156d和ahy-miR156e在花生種子成熟期(P7~P9)的表達(dá)顯著高于其他時(shí)期, 相關(guān)研究表明, miR156通過靶向和基因, 能夠?qū)е虏徽５募?xì)胞分裂[25], 從而控制種子的發(fā)育[26-27]。ahy-miR397a在P0期高度表達(dá), 在水稻中, miR397的過表達(dá)通過靶向L-抗壞血酸氧化酶(AO)[28], 抑制抗壞血酸(AA)的氧化, 從而使脫氫抗壞血酸(DHA)維持在較低水平, 進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂[29]。而種子在早期發(fā)育階段需要具備很高的細(xì)胞分裂能力, 推測ahy-miR397a可能通過抗氧化途徑而調(diào)控花生種子的發(fā)育過程。ahy-miR167e在種子P4~P7時(shí)期表達(dá)顯著高于其他時(shí)期, ahy-miR167-5p在種子發(fā)育過程中均高表達(dá), 在擬南芥和水稻中, miR167通過調(diào)控靶基因和的表達(dá)參與種子的發(fā)育[30-31], 因此ahy- miR167可能在花生莢果發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。microRNA319家族(ahy-miR319a、ahy-miR319b、ahy- miR319e和ahy-miR319f)在P0時(shí)期高度表達(dá), miR319在花生莢果發(fā)育過程中參與生長素和GA信號傳導(dǎo)途徑, 能夠促進(jìn)花生胚胎和莢果早期發(fā)育[22]。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實(shí)充實(shí)期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

4 結(jié)論

花生莢果種子發(fā)育過程中, microRNA以時(shí)空特異的方式表達(dá), 表明不同的microRNA在花生莢果、種子發(fā)育的不同時(shí)期發(fā)揮作用, 該結(jié)果為闡釋花生莢果暗發(fā)育的分子機(jī)制提供了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的理論參考依據(jù)。

附表 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.chinacrops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuo wxb.aspx。

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Identification and expression analysis of microRNA during peanut (L.) pod development

HU Dong-Xiu**, LIU Hao**, HONG Yan-Bin, LIANG Xuan-Qiang, and CHEN Xiao-Ping*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / South China Peanut Sub-Center of National Center of Oilseed Crops Improvement / Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China

“Aerial flower and subterranean fruit” is a distinct feature in peanut (L.). To dissect this character at post-transcription level, small RNA sequencing was performed to identify microRNAs in peanut pod shell and seed during eleven developmental stages. Sequencing analysis identified 212 known microRNAs, including 197 conserved and 15 specific microRNA. In addition, 112 novel microRNAs from 62 novel microRNA precursors were identified. Among the known and new microRNAs, 67 microRNAs and their target genes showed differentially expressed patterns during peanut pod development. Expression trend analysis revealed stage-specific and tissue-specific expression of microRNA and their target genes during pod shell and seed development, implying that microRNAs probably played a role in peanut pod development. To validate expression profiles from small RNA sequencing, quantitative real-time RT-PCR were performed using 28 microRNAs and 30 target genes, revealing consistent expression profiles with sequencing results. The data regarding microRNA and their target genes generated in this study would contribute to understanding the molecular mechanism of plant fruit development under darkness and to crop improvement.

peanut; pod development; small RNA sequencing; microRNA; target gene

10.3724/SP.J.1006.2021.04144

本研究由廣東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2020B020219003), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31771841)和廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(2020A1515010021)資助。

This study was supported by the Guangdong Provincial Major Research and Development Project (2020B020219003), the National Natural Science Foundation of China (31771841), and the Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2020A1515010021).

陳小平, E-mail: chenxiaoping@gdaas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

胡冬秀, E-mail: HuDX1017@163.com; 劉浩, E-mail: liuhao@gdaas.cn

2020-07-02;

2020-10-14;

2020-11-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201118.1557.006.html