孫文君, 楊蔚, 許文花, 任健, 韓博, 張冉, 馬向麗

苜蓿幼苗對(duì)鋁脅迫的生理響應(yīng)及綜合評(píng)價(jià)

孫文君1, 楊蔚2, 許文花1, 任健1, 韓博1, 張冉1, 馬向麗1

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 紅云紅河集團(tuán)昆明卷煙廠, 昆明 650202)

為探討鋁脅迫對(duì)苜蓿()幼苗生長(zhǎng)和生理特性的影響，對(duì)鋁脅迫下苜蓿地上和地下生物量、光合色素及根尖胼胝質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)根尖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，最后采用隸屬函數(shù)分析法對(duì)苜蓿耐鋁性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，隨著鋁脅迫的增加，苜蓿地上、地下部分生物量呈降低趨勢(shì)，低濃度和高濃度鋁脅迫使苜蓿生物量顯著下降(<0.05)；苜蓿的葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，胼胝質(zhì)積累量增多；中、高濃度鋁脅迫使根尖胼胝質(zhì)含量顯著上升。隨鋁脅迫濃度升高，根尖橫切面細(xì)胞發(fā)生較大變化，尤其在高濃度時(shí)，細(xì)胞干癟且排列紊亂。隸屬函數(shù)分析結(jié)果表明，No. 12和No. 18苜蓿材料的耐鋁性較好,可在南方酸性富鋁化土壤中推廣應(yīng)用。

苜蓿；鋁脅迫；生物量；葉綠素；幼苗；生理

酸性土壤已覆蓋我國(guó)長(zhǎng)江以南15個(gè)省區(qū)，總面積約占全國(guó)總耕地面積的21%[1]，紅黃壤土地面積大，具脫硅富鋁化成土過(guò)程，致使鋁毒害日益嚴(yán)重[2]。鋁毒害作為酸性土壤中植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子[3]，主要以鋁的氧化物或鋁硅酸鹽等固定態(tài)鋁的形式存在于自然條件下，可供生物利用價(jià)值較小[4]。酸性土壤中鋁毒對(duì)植物的危害首先作用于根部，反映于根部形態(tài)和生理特征[5]：破壞植物根尖結(jié)構(gòu)，阻礙植物根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而使植株地上莖、葉生長(zhǎng)發(fā)育受抑制，最終致使產(chǎn)量和品質(zhì)下降或停止生長(zhǎng)[6–11]。

苜蓿()是世界上栽培面積最大、栽植最早、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的牧草，有改良土壤、保持水土等作用，因而有“牧草之王”之美譽(yù)[12]。苜蓿作為全球最重要的優(yōu)良豆科牧草，對(duì)生態(tài)環(huán)境的改善起著重要作用，對(duì)于牲畜而言，優(yōu)良的苜蓿干草勝過(guò)一切優(yōu)質(zhì)的粗飼料[13]，但由于其抗酸鋁能力差，極大地限制了在我國(guó)南方地區(qū)的種植[5]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于鋁對(duì)麥類[9]植物、大豆()和水稻()[14]等農(nóng)作物的毒害和耐鋁毒機(jī)理等方面的研究已有較多報(bào)道，但對(duì)苜蓿耐鋁性研究相對(duì)較少；且由于苜蓿材料和耐鋁性評(píng)價(jià)體系不同，仍未見(jiàn)報(bào)道強(qiáng)耐鋁苜蓿資源。因此，研究酸鋁脅迫下苜蓿幼苗生長(zhǎng)狀況，篩選耐鋁性品種便顯得十分重要。本研究測(cè)定了8份苜蓿屬種質(zhì)材料在鋁脅迫下的地上和地下部分生物量、葉片光合色素和根尖胼胝質(zhì)含量，并觀察苜蓿根尖細(xì)胞對(duì)鋁毒的敏感度，最后采用隸屬函數(shù)分析法進(jìn)行耐鋁性綜合評(píng)價(jià)，為開(kāi)展苜蓿耐鋁性研究奠定基礎(chǔ)，亦為后期篩選耐鋁性較強(qiáng)的苜蓿品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

前期課題組于云南省各地州進(jìn)行苜蓿資源調(diào)查，收集到云南野生和逸生苜蓿()種質(zhì)資源30份。通過(guò)栽種和生產(chǎn)性能的評(píng)價(jià)鑒定，篩選出生長(zhǎng)狀況良好、且采集地pH值和生存環(huán)境差異性較大的8份材料(表1)，并進(jìn)行繁殖收種，用作耐鋁性鑒定[15]。

表1 云南8份野生和逸生苜蓿材料的采集地點(diǎn)

1.2 培養(yǎng)和處理

在人工智能溫室中，采用12孔育苗盤、珍珠巖育苗，發(fā)芽后澆Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液培育10 d,然后開(kāi)始鋁脅迫處理；將營(yíng)養(yǎng)液pH調(diào)至4.5，用AlCl3配置成濃度為0、50、100、200、500mol/L的鋁溶液，脅迫處理10 d。試驗(yàn)期間，隔3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。鋁脅迫處理后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 方法

生物量 隨機(jī)選取20株，用濾紙吸干根、莖、葉的水分，置于分析天平分別稱量地上、地下部分鮮質(zhì)量。

光合色素含量 隨機(jī)剪取20株苜蓿新鮮葉片，參照王愛(ài)玉等[16]的方法，取0.1 g葉片于95%乙醇中避光浸泡96 h后用分光光度計(jì)在470、649、665 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，計(jì)算葉片葉綠素(Chl) a、Chl b、Chl a+b和類胡蘿卜素(Car)的含量，重復(fù)3次。

根尖胼胝質(zhì)含量 參考Kohle等[17]的方法,隨機(jī)剪取5株根尖5 mm的根段，經(jīng)研磨、提取、高溫(80℃)水浴、冷卻后加入苯胺藍(lán)顯色液，并吸取上清液與空白液混勻，采用熒光分光光度法測(cè)定，計(jì)算胼胝質(zhì)含量，重復(fù)3次。

根尖切片的顯微觀察 隨機(jī)切取10株苜蓿1 cm長(zhǎng)根尖，用200 mL蒸餾水浸泡15 min，再用50 mL 0.2%蘇木精溶液染色20 min，在根尖0~3 mm處切薄片，置于顯微鏡200×物鏡下觀察根尖細(xì)胞形態(tài)并拍照。

綜合評(píng)價(jià) 采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行。與耐鋁性呈正相關(guān)的指標(biāo)(葉綠素、生物量)用(X)=(X–Xmin)/(Xmax–Xmin)計(jì)算隸屬函數(shù)值; 與耐鋁性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)(胼胝質(zhì)含量)用(X)=1–(X–Xmin)/ (Xmax–Xmin)計(jì)算隸屬函數(shù)值; 用(X)=SX/計(jì)算某脅迫濃度下苜蓿各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，式中，(X)為處理指標(biāo)的耐鋁隸屬函數(shù)值；X為處理指標(biāo)的測(cè)定值；Xmax為最大值；Xmin為最小值；X為處理的耐鋁隸屬函數(shù)值的平均值；為指標(biāo)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010和SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，并進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 對(duì)苜蓿地上、地下生物量的影響

鋁脅迫抑制苜蓿地上生物量的積累(表2)，隨著鋁脅迫濃度的增加，苜蓿地上部分生物量均顯著降低(<0.05)，以500mol/L鋁濃度時(shí)最低。其中, No. 11和No. 21苜蓿在鋁濃度為500mol/L時(shí)表現(xiàn)較遲鈍，地上生物量降低幅度有所減緩，與200mol/L的差異不顯著(>0.05)。

從表3可見(jiàn)，隨著鋁脅迫濃度的增加，苜蓿的地下部分生物量也呈下降趨勢(shì)。低濃度(50mol/L)鋁脅迫時(shí)，地下部分生物量比對(duì)照顯著下降(< 0.05)。No. 11、No. 18和No. 21苜蓿在≤100mol/L鋁處理時(shí)，地下部分生物量顯著降低(<0.05)，而當(dāng)脅迫濃度為200mol/L時(shí)，其地下部分生物量雖有下降，但差異不顯著(>0.05)，這表明3份苜蓿在中、高濃度鋁脅迫下產(chǎn)生了一定抗性。但隨脅迫濃度繼續(xù)升高，地下部分的耐受力減弱，所有苜蓿地下部分生物量均呈顯著下降趨勢(shì)(<0.05)。

2.2 對(duì)葉片葉綠素含量的影響

葉綠素a含量 由圖1可看出，鋁處理抑制苜蓿葉綠素(Chl) a的合成，但不同苜蓿對(duì)脅迫的敏感性不同。當(dāng)鋁濃度為50mol/L時(shí)，所有苜蓿葉片的Chl a含量比對(duì)照顯著減少(<0.05)，說(shuō)明苜蓿遭受逆境脅迫能立即響應(yīng)；隨著鋁濃度的增加，所有苜蓿葉片的Chl a含量與對(duì)照間的差異均達(dá)顯著水平(<0.05)，且當(dāng)鋁濃度增至500mol/L時(shí)，Chl a含量降至最低；其中，No. 11、No. 12、No. 22和No. 27苜蓿在中、高濃度(100、200mol/L)鋁脅迫時(shí)，Chl a含量均無(wú)顯著變化(>0.05)。

表2 鋁脅迫對(duì)苜蓿地上部分生物量(g)的影響

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。編號(hào)見(jiàn)表1。下表同。

Data followed different letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level. No. see Table 1. The same is following Tables.

表3 鋁脅迫對(duì)苜蓿地下部分生物量(g)的影響

Chl b含量 由圖1可見(jiàn)，隨著鋁脅迫濃度的增加，苜蓿葉片中Chl b含量均有不同程度的下降，但較Chl a含量變化平緩。其中，低濃度(50mol/L)鋁脅迫對(duì)No. 3和No. 5苜蓿的Chl b含量有促進(jìn)作用，比對(duì)照升高，但隨脅迫的增強(qiáng), Chl b含量顯著下降(<0.05)；No. 11和No. 27苜蓿在100mol/L鋁脅迫時(shí)，Chl b含量雖有下降，但與50mol/L鋁脅迫的差異不顯著(>0.05); No. 12和No. 21苜蓿受鋁脅迫的Chl b含量均比對(duì)照顯著下降，但各脅迫處理間的Chl b含量差異不顯著。

圖1 鋁脅迫對(duì)苜蓿光合色素含量的影響。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

類胡蘿卜素含量 從圖1可見(jiàn)，苜蓿葉片的類胡蘿卜素(Car)含量隨鋁脅迫濃度的增加呈下降趨勢(shì)。No. 11、No. 22、No. 27苜蓿葉片的Car含量在50~200mol/L鋁脅迫時(shí)下降，但未達(dá)顯著差異；No. 12苜蓿受中、高濃度(100~500mol/L)鋁脅迫時(shí)，Car含量變化不顯著，說(shuō)明其對(duì)鋁脅迫敏感度較低，存在一定耐受性。

Chl a+b含量 由圖1可知，鋁處理抑制苜蓿葉綠素的合成，鋁脅迫濃度為500mol/L時(shí)Chl a+b含量最低，各處理間的差異顯著(<0.05)。但不同材料對(duì)不同脅迫濃度的反應(yīng)敏感性不同，其中，No. 22苜蓿的Chl a+b含量在50~500mol/L鋁脅迫下的差異不顯著(>0.05), No. 11的Chl a+b含量在50~200mol/L鋁脅迫下的差異不顯著(> 0.05)，當(dāng)脅迫濃度達(dá)500mol/L時(shí)顯著下降；而No. 12苜蓿葉片Chl a+b含量受≥200mol/L鋁脅迫時(shí)的變化不顯著。

2.3 對(duì)根尖胼胝質(zhì)含量的影響

從圖2可見(jiàn)，隨著鋁脅迫濃度升高，苜蓿根尖的胼胝質(zhì)含量逐漸升高。No. 3、No. 21和No. 22苜蓿的根尖胼胝質(zhì)含量在中、高濃度(200、500mol/L)鋁脅迫時(shí)雖有升高，但差異不顯著(>0.05)，可能是對(duì)鋁脅迫產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。

2.4 根尖的顯微觀察

苜蓿經(jīng)鋁脅迫處理后，根尖橫切面的細(xì)胞變化明顯(圖3)。對(duì)照(0mol/L)的苜蓿根尖細(xì)胞排列規(guī)則且均勻飽滿，各組織結(jié)構(gòu)清晰可辨。經(jīng)鋁脅迫處理后，細(xì)胞排列紊亂，表層細(xì)胞大量脫落，且隨脅迫濃度增加而更加明顯。在500mol/L鋁脅迫下,細(xì)胞排列不規(guī)則且干癟，皮層薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁形態(tài)異常。

圖2 鋁脅迫對(duì)根尖胼胝質(zhì)含量的影響

圖3 根尖橫切片(200×)

2.5 綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)分析法對(duì)8份苜蓿材料的耐鋁性進(jìn)行評(píng)價(jià)(表4), 結(jié)果表明，在鋁濃度為50mol/L時(shí),苜蓿耐鋁性的排序?yàn)? No. 12>No. 18>No. 27>No. 22> No. 3>No. 11>No. 5>No. 21；當(dāng)濃度為100mol/L時(shí)，排序?yàn)? No. 12>No. 18>No. 27>No. 22>No.3> No. 11>No. 5>No. 21；當(dāng)濃度為200mol/L時(shí)，排序?yàn)? No. 12>No. 18>No. 27>No. 22>No. 3>No. 11> No. 21>No. 5; 當(dāng)濃度為500mol/L時(shí), 排序?yàn)? No. 12>No. 18>No. 22>No. 27>No. 11>No. 3>No. 21> No. 5?？梢?jiàn)，No. 12和No. 18苜蓿的表現(xiàn)較好，No. 21和No. 5苜蓿的表現(xiàn)較差。

3 結(jié)論和討論

3.1 鋁脅迫抑制苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育

生物量是植株生長(zhǎng)狀況的直觀反應(yīng)，可作為篩選耐性品種的重要依據(jù)指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果表明,隨鋁脅迫濃度增加，苜蓿生長(zhǎng)受到抑制，耐受性減弱，地上、地下部分生物量減少。但脅迫濃度在一定范圍內(nèi)，生物量的變化趨于平緩，No. 3、No. 21苜蓿在100mol/L濃度脅迫時(shí)地上部分生物量的下降幅度比50mol/L的小(表2)；No. 11、No. 18苜蓿在200mol/L脅迫時(shí)的地上部分生物量的下降幅度比100mol/L的小(表3)。逆境環(huán)境下，植物可通過(guò)改變生理適應(yīng)機(jī)制及其形態(tài)策略來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫[19]，其生長(zhǎng)受抑制程度會(huì)趨于平緩，但當(dāng)超過(guò)該限度時(shí),便會(huì)影響植物正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。嚴(yán)重鋁脅迫會(huì)阻礙植物代謝，從而影響植物正常生長(zhǎng)，減少生物量的累積，這與前人[20–22]的研究結(jié)果一致。

表4 苜蓿耐鋁毒性的隸屬值

3.2 鋁脅迫降低光合色素含量

本試驗(yàn)中，鋁脅迫下8份苜蓿材料葉片的Chl和Car含量均比對(duì)照下降，且Chl a含量比Chl b含量減少得更多。肖祥希等[23]對(duì)鋁脅迫下龍眼()生長(zhǎng)影響的研究也有相同結(jié)論。Al3+會(huì)破壞苜蓿葉片的光合色素系統(tǒng)，使光合色素合成受阻或加速降解，導(dǎo)致光合色素含量降低，但不同苜蓿對(duì)Al3+的耐受性存在差異，因而對(duì)不同濃度的鋁脅迫敏感性不同。No. 3、No. 5苜蓿葉片的Chl b含量呈先升后降的變化(圖1)，這與李貞霞等[24]報(bào)道辣椒()對(duì)鋁脅迫響應(yīng)結(jié)果一致,低濃度鋁脅迫可能促進(jìn)Chl b的合成，或者是物種對(duì)低濃度鋁脅迫反應(yīng)不敏感，然而隨脅迫濃度加大，則表現(xiàn)出不耐受反應(yīng)。植物葉片中Car能猝滅不穩(wěn)定的三線態(tài)葉綠素的功能，并具有強(qiáng)氧化作用，對(duì)光合膜有潛在作用的單線態(tài)氧，從而達(dá)到保護(hù)受光激發(fā)的葉綠素免遭光氧化破壞的效果，以減少光合膜受單線態(tài)氧的損傷[23]。有研究表明[19,25–26],當(dāng)植物處于逆境脅迫環(huán)境時(shí)，會(huì)使體內(nèi)的Car含量升高。一般認(rèn)為，抗逆性較好的植物葉片的Car含量普遍較高。但在本試驗(yàn)中，鋁脅迫下8份苜蓿材料的Car含量均比對(duì)照下降，這與張永鋒等[26]的研究結(jié)果不一致，這可能是由于植物的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的抵抗修復(fù)能力存在一定閾值[27]，如果逆境脅迫超過(guò)該閾值，其抗氧化保護(hù)系統(tǒng)也會(huì)降低或喪失保護(hù)功能，因此鋁脅迫將導(dǎo)致苜?？鼓嫘缘慕档汀?/p>

3.3 鋁毒害誘導(dǎo)苜蓿根尖胼胝質(zhì)形成

鋁作為一種酸性土壤中較為常見(jiàn)的礦質(zhì)逆境元素，對(duì)植物的毒害在外觀上主要表現(xiàn)為根系伸長(zhǎng)受抑制[28]，質(zhì)外體和細(xì)胞壁作為植物最早與鋁接觸的部位，鋁可被表皮或皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁強(qiáng)烈吸附[29]，因此，鋁毒害會(huì)影響纖維素的合成，繼而誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成[30–31]，并且隨著鋁脅迫濃度的升高，胼胝質(zhì)含量也增加。這已在多種植物中報(bào)道,如燕麥()[32]、小麥()[28,33]、大麥()[30]、玉米()[34–35]、煙草()[36]、菜豆()[37]和挪威云杉()[38]。本研究中，苜蓿材料均在遭受低濃度鋁脅迫時(shí)迅速在根尖累積胼胝質(zhì)，并隨著鋁脅迫濃度升高，胼胝質(zhì)含量逐漸增高，也有部分苜蓿材料在高濃度鋁脅迫時(shí)，根尖胼胝質(zhì)含量變化不顯著(>0.05)。有研究表明[39–41]，植物在受到機(jī)械損傷、生理逆境或病菌感染時(shí)，胼胝質(zhì)合酶催化大量合成胼胝質(zhì)；并且，鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成是一個(gè)迅速而又敏感的生理反應(yīng)[42]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。鋁誘導(dǎo)根尖胼胝質(zhì)的形成比根伸長(zhǎng)的研究更可靠，因此被廣泛應(yīng)用在植物耐鋁性機(jī)制的研究中。

3.4 鋁脅迫導(dǎo)致苜蓿根尖細(xì)胞排列紊亂

一般認(rèn)為，根尖是鋁毒害的最初作用部位，于外表現(xiàn)在根尖形態(tài)的變化，于內(nèi)則表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。本試驗(yàn)中，8份苜蓿材料根尖細(xì)胞隨鋁脅迫濃度增加而變化明顯，細(xì)胞排列紊亂且表皮細(xì)胞受損嚴(yán)重，這與Delhaize等[29]對(duì)小麥鋁耐性研究結(jié)果一致，植物對(duì)鋁毒的敏感程度與根系中的鋁含量呈正相關(guān)。由于Al3+在根尖細(xì)胞壁中大量積累造成破壞，使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)、排列發(fā)生改變。

綜合分析表明，No. 12和No. 18苜蓿在鋁脅迫處理中的表現(xiàn)均較好，有較高的耐受性；其次為No. 27、No. 22、No. 3和No. 11；No. 21和No. 5苜蓿，耐受性較低。

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Physiological Response and Comprehensive Evaluation of Alfalfa Seedlings to Aluminum Stress

SUN Wen-jun1, YANG Wei2, XU Wen-hua1, REN Jian1, HAN Bo1, ZHANG Ran1, MA Xiang-li1*

(1. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China; 2. Kunming Cigarette Factory of Hongyunhonghe Group,Kunming 650202, China)

In order to understand the effects of aluminum on growth and physiological characteristics of alfalfa () seedlings, the above- and under-ground biomass, contents of leaf chlorophyll and callus in root tips were measured, the structure of root tips was observed, and the aluminum resistance of alfalfa was evaluated using membership function analysis. The results showed that with increment of aluminum concentration, the above- and under-ground biomass of alfalfa decreased, which significantly decreased under low and high aluminum concentrations (<0.05). With increment of aluminum stress, the chlorophyll content of alfalfas dropped, while the accumulation of calluses increased, particularly under middle and high aluminum stress. Under aluminum stress, the cells of root tip had a big changes, which collapsed and in disorder under high aluminum stress. According to comprehensive evaluation, the aluminum resistance of No. 12 and No. 18 was better than that of others, suggesting that they could be applied in acid aluminized soil in southern China.

; Aluminum stress; Biomass; Chlorophyll; Seedling; Physiology

10.11926/jtsb.4238

2020–04–23

2020–07–05

云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(2019FB044); 云南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018BB001-03); 云南省重大科技專項(xiàng)-綠色食品國(guó)際合作研究中心項(xiàng)目(2019ZG009)資助

This work was supported by the General Program of Basic Research Plan in Yunnan (Grant No. 2019FB044); the Project of Key Research and Development Plan in Yunnan (Grant No. 2018BB001-03); and the Yunnan Eco-friendly Food International Cooperation Research Center Project of Yunnan Provincial Key Programs (Grant No. 2019ZG009).

孫文君(1992~ ), 女，在讀博士，研究方向: 草地生態(tài)與環(huán)境。E-mail: 276384152@qq.com

E-mail: xfmaxiangli@126.com