管福琴，單 宇，陳 雨，王奇志，李林蔚，佟海英，馮 煦,

(1.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所/中山植物園，江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所/中山植物園，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014)

自2000年以來(lái)，肝癌的發(fā)病率和致死率出現(xiàn)明顯的上升態(tài)勢(shì)，成為威脅人類健康的重要因素[1]。信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)參與調(diào)控腫瘤的細(xì)胞凋亡、增殖分化、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避，其中STAT3和STAT5的研究最多[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，60%左右的肝癌組織中存在p-STAT3高表達(dá)，且其與肝癌的病理分級(jí)和臨床分期相關(guān)[3]。含 SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SH2-containing protein tyrosine phosphatase，SHP)屬于非受體蛋白酪氨酸磷酸酶家族，是許多信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。已有研究證實(shí)，SHP-1和SHP-2可使STAT3蛋白705位酪氨酸殘基去磷酸化從而抑制STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，并在多種腫瘤中發(fā)揮作用[4]。在抗腫瘤藥物研究中，天然產(chǎn)物取得了顯著的療效。海蓬子皂苷甲(bigelovii A，BA)是一種30-降齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，該化合物是本課題組前期從海蓬子中分離并鑒定得到的[5]。研究結(jié)果表明，BA能夠促使人乳腺癌細(xì)胞MCF7和人白血病細(xì)胞HL-60發(fā)生細(xì)胞凋亡[6-7]，誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬[8]，同時(shí)BA還具有治療脂多糖引起的急性肺損傷的潛力[9]。本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討B(tài)A抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，及其對(duì)STAT和SHP信號(hào)通路的影響，為開發(fā)利用海蓬子奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑BA，純度>98%，由本課題組分離得到；胎牛血清，蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基和蛋白酶抑制劑，Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)四唑藍(lán)(Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、放射免疫沉淀法(Radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、預(yù)染蛋白Marker等均購(gòu)自碧云天公司；白介素6(interleukin-6，IL-6)，Peprotech公司；過(guò)釩酸鈉Sigma公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色試劑盒,美國(guó)BD公司；抗體和ECL發(fā)光液,美國(guó)Cell Signaling公司。

1.3 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo 6500，美國(guó)Thermo公司)、生物安全柜(NapFLOW 1200，美國(guó)Thermo公司)；離心機(jī)(5804R，德國(guó)Eppendorf公司)；熒光倒置顯微鏡(IX51，日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(Infinite M200，美國(guó)Tecan公司)；流式細(xì)胞儀(Accuri C6，美國(guó)BD公司)；化學(xué)發(fā)光儀(5200Multi，天能)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞存活率測(cè)定將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以5×107個(gè)·L-1密度接種于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)孔100 μL。然后用BA(5、10、20、40 μmol·L-1)處理，每組設(shè)置3次重復(fù)。24、48、72 h后，向各孔中加10 μL MTT(5 g·L-1)，培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清，加入DMSO振搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570。

通過(guò)細(xì)胞增殖抑制率公式，計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/% =(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/細(xì)胞對(duì)照組OD值)×100%

2.3 PI單染法定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞6×105個(gè)接種于6孔板，用BA(10、20、40 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h，并用PBS洗滌。隨后收集細(xì)胞，然后邊振搖邊滴加70%預(yù)冷乙醇，共1 mL，4 ℃固定過(guò)夜。3 000 r·min-1、5 min，離心收集細(xì)胞。加500 μL PI重新懸浮細(xì)胞，37 ℃ 培養(yǎng)箱避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析。

2.4 Western blot法檢測(cè)STAT和SHP信號(hào)通路蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按照5×105個(gè)/孔接種于6孔板，CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。檢測(cè)STAT3和STAT5蛋白表達(dá)時(shí)，次日用IL-6刺激細(xì)胞15 min，加入不同濃度的BA(10、20、40 μmol·L-1)處理5 h或用20 μmol·L-1BA處理1、2、4、6、8 h。檢測(cè)是否有磷酸酶參與時(shí)，次日用過(guò)釩酸鈉(25、50、100 μmol·L-1)和20 μmol·L-1BA同時(shí)處理HepG2細(xì)胞5 h，再用IL-6刺激細(xì)胞15 min。檢測(cè)SHP-1和SHP-2蛋白表達(dá)時(shí)，次日用20 μmol·L-1BA處理0.5、1、2、4、6 h。然后均提取細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉1 h，一抗4 ℃ 孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h后，ECL發(fā)光液顯色，于化學(xué)發(fā)光儀中掃描。

3 結(jié)果

3.1 BA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡以HepG2細(xì)胞作為人肝癌細(xì)胞的模型，研究不同濃度的BA(5-40 μmol·L-1)作用不同時(shí)間(24、48、72 h)對(duì)HepG2的細(xì)胞毒作用。結(jié)果顯示，隨著BA濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸上升，且呈現(xiàn)很好的時(shí)間依賴關(guān)系(Fig 1)。PI單染檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 2)，20和40 μmol·L-1BA作用HepG2細(xì)胞24 h，sub-G1峰的比例升高，與對(duì)照組相比，有明顯差異，表明細(xì)胞產(chǎn)生了凋亡。

Fig 1 Cell growth of HepG2 cells inhibited by BAHepG2 cells were treated with 5,10,20 and 40 μmol·L-1 BA for 24,48 and 72 h,and then subjected to MTT assay.**P<0.01 vs control.

Fig 2 Apoptosis of HepG2 cells induced by BAHepG2 cells were treated with 10,20 and 40 μmol·L-1 BA for 24 h,after which the cells were analyzed for DNA content by flow cytometry.

3.2 BA抑制STAT3和STAT5磷酸化激活I(lǐng)L-6是一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能使細(xì)胞中STAT3和STAT5磷酸化激活。如Fig 3所示，25 μg·L-1的IL-6刺激HepG2細(xì)胞15 min，可誘導(dǎo)p-STAT3 和p-STAT5表達(dá)，其中p-STAT3表達(dá)更高；采用10、20、40 μmol·L-1BA作用5 h后，BA可同時(shí)抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3和STAT5的磷酸化；而采用20 μmol·L-1BA作用1、2、4、6、8 h后，BA時(shí)間依賴性地抑制了IL-6誘導(dǎo)的STAT3和STAT5磷酸化。對(duì)于STAT3的磷酸化，BA作用6 h后效果明顯；對(duì)于STAT5的磷酸化，僅作用1 h即可抑制，作用6 h幾乎完全抑制。

Fig 3 IL-6-induced activation of STAT3 and STAT5 suppressed by BA A and C:HepG2 cells were treated with 10,20 and 40 μmol·L-1 BA for 5 h.B and D:HepG2 cells were treated with 20 μmol·L-1 BA for various lengths of time.After induced by IL-6 for 15 min,whole-cell extracts were processed for Western blot analysis.

3.3 BA抑制SHP-1和SHP-2BA單獨(dú)作用HepG2細(xì)胞顯著抑制了IL-6誘導(dǎo)的STAT3的磷酸化，但當(dāng)BA與酪氨酸磷酸酶抑制劑過(guò)釩酸鈉同時(shí)作用HepG2細(xì)胞后，BA對(duì)STAT3磷酸化的抑制作用被過(guò)釩酸鈉逆轉(zhuǎn)(Fig 4A)。以上結(jié)果提示BA可能激活了酪氨酸磷酸酶，從而抑制STAT3的磷酸化。SHP-1和SHP-2是酪氨酸磷酸酶，參與調(diào)控STAT3蛋白去磷酸化。Fig 4B結(jié)果表明，20 μmol·L-1的BA作用HepG2細(xì)胞0.5 h，即可激活SHP-1和SHP-2的表達(dá)，且SHP-2的激活時(shí)間能夠持續(xù)4 h。該結(jié)果表明BA通過(guò)激活SHP-1和SHP-2，從而使p-STAT3表達(dá)下降。

Fig 4 SHP-1 and SHP-2 in HepG2 cells activated by BA A:HepG2 cells were pretreated with 25,50,100 μmol·L-1 sodium pervanadate and 20 μmol·L-1 BA for 5 h,then induced by IL-6 for 15 min,after which whole-cell extracts were processed for Western blot analysis.B:HepG2 cells were pretreated with 20 μmol·L-1 BA for various lengths of time,after which whole-cell extracts were prepared and analyzed for SHP-1 and SHP-2.

4 討論

五環(huán)三萜皂苷在自然界種類繁多，分布廣泛，資源豐富。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些五環(huán)三萜皂苷具有很好的抗腫瘤作用，呈現(xiàn)多部位、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[10]。本研究以人肝癌 HepG2 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討五環(huán)三萜化合物BA抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤效應(yīng)。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BA對(duì)人肝癌 HepG2 細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用；流式單染凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BA能夠誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞出現(xiàn)亞二倍體峰，具有劑量依賴性。上述結(jié)果表明，BA通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

STAT 活化表達(dá)于肝臟腫瘤細(xì)胞中，參與調(diào)控肝臟腫瘤的形成、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等諸多環(huán)節(jié)，是若干致癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的匯合點(diǎn)，與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[2]。白介素6(IL-6)是一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)STAT3信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[11]。一些已知的植物來(lái)源的天然化合物可有效抑制STAT3的激活，如熊果酸[12]、吳茱萸堿[13]、牛蒡子苷元[14]。本研究結(jié)果顯示，隨著BA濃度增高，IL-6活化的p-STAT3、p-STAT5 蛋白的表達(dá)量明顯減少，說(shuō)明BA可能是通過(guò)下調(diào)STAT 信號(hào)通路中 STAT3、STAT5的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的。

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BA抑制STAT3和STAT5的作用涉及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。許多PTPs與STAT信號(hào)相關(guān)，包括SHP-1、SHP-2、T-cell PTP、PTEN、PTP-1D、CD45、PTPe[15]。SHP-1和SHP-2可以負(fù)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，BA刺激SHP-1和SHP-2蛋白表達(dá)增加與STAT3、STAT5磷酸化下調(diào)相關(guān)。除了蛋白酪氨酸磷酸酶，STAT3激活負(fù)調(diào)控也通過(guò)其他機(jī)制，這些機(jī)制包括SOCS、PIAS、泛素依賴的蛋白酶體降解和Smad4[17]。這些抑制蛋白是否參與BA誘導(dǎo)的STAT3去磷酸化需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，BA通過(guò)激活SHP-1/SHP-2，下調(diào)STAT3/STAT5信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。另外，SHP-1/SHP-2 和STAT3/STAT5軸參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞凋亡這一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，完善了對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的理解，提供了肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。