徐 延，鄒桂昌，左 欣，熊 偉

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230022)

維生素C(vitamin C，VC)也稱(chēng)抗壞血酸，可以通過(guò)血腦屏障或細(xì)胞膜上的2型鈉離子依賴(lài)性維生素C轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium-dependent vitamin C transporter-type 2，SVCT2)進(jìn)入腦內(nèi)及神經(jīng)細(xì)胞中，并且腦中VC的濃度水平高于其它器官中VC的濃度水平[1]，這說(shuō)明了VC可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的生物學(xué)意義。如VC可以影響神經(jīng)元的發(fā)育和髓磷脂的形成，另外有研究指出VC對(duì)Ⅰ型多巴胺受體、Ⅱ型多巴胺受體以及N-甲基-D天冬氨酸受體等多種膜蛋白的功能都有影響[1-3]。

神經(jīng)系統(tǒng)中有兩種重要的抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，分別為甘氨酸(glycine，Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[4]。其中，Gly特異性的受體——甘氨酸受體(glycine receptor，GlyR)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛且大量存在于脊髓、腦干中。GlyR主要由兩種亞基構(gòu)成，分別為α和β，到目前為止發(fā)現(xiàn)α亞基存在多種亞型，而β亞基只有一種亞型。根據(jù)組成GlyR的α亞基的亞型不同，可以將GlyR分為4種亞型，分別為α1、α2、α3、α4亞型(GlyRα1、GlyRα2、GlyRα3、GlyRα4)[5-6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多物質(zhì)都可以調(diào)節(jié)GlyR的功能，例如大麻素、酒精、鋅離子等[7]。然而，目前尚無(wú)VC對(duì)GlyR調(diào)節(jié)作用的報(bào)道。鑒于兩者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要性，本實(shí)驗(yàn)采用電生理技術(shù)，探究VC對(duì)GlyR所介導(dǎo)的電流的影響，以期闡明VC與GlyR之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料NaCl、KCl、CaCl2、Glucose、HEPES、MgCl2、Vitamin C、Glycine均購(gòu)于Sigma。DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Media)、胎牛血清購(gòu)于HyClone。胰酶購(gòu)于Life Technologies。LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen。玻璃電極B15024F購(gòu)于武漢微探科學(xué)儀器有限公司。

1.2 溶液配制細(xì)胞外液(mmol·L-1)：140 NaCl,5 KCl,2 CaCl2,1 MgCl2,10 Glucose、10 HEPES，pH用NaOH調(diào)至7.4。電極內(nèi)液(mmol·L-1)，140 CsCl,4 MgCl2,10 EGTA,10 HEPES,0.5 Na-GTP、2 Mg-ATP，pH用CsOH調(diào)至7.2。含血清細(xì)胞培養(yǎng)基：體積占比0.9的DMEM，體積占比0.1的純胎牛血清，體積占比0.01的雙抗(青霉素，鏈霉素)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞為HEK-293T，細(xì)胞培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[8-9]和實(shí)驗(yàn)室以往經(jīng)驗(yàn)，使用含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃，5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒前，挑選細(xì)胞生長(zhǎng)密度合適的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將1 μg編碼GlyR(野生型或突變型)和1 μg編碼綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的質(zhì)粒以共轉(zhuǎn)的形式轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。細(xì)胞處理6 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后2 d，便可進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 單細(xì)胞膜片鉗記錄在進(jìn)行電生理記錄前2 h，將細(xì)胞用胰酶處理成單個(gè)懸浮細(xì)胞后，加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞重新貼壁后使用。電生理記錄過(guò)程中需要將細(xì)胞置于細(xì)胞外液中，并向電極中加入適量的電極內(nèi)液，電極(外徑1.50 mm，內(nèi)徑0.84 mm)是在MODEL P-1000電極拉制儀中拉制而成，拉制后的電極需保證入水電阻在3-4 MΩ之間。膜片鉗實(shí)驗(yàn)在OLYMPUS倒置熒光顯微鏡的觀(guān)察下進(jìn)行，使用電極封接吸破細(xì)胞形成全細(xì)胞記錄方式后，需要將細(xì)胞從皿底抬升至適當(dāng)高度，然后使用Warner公司的步進(jìn)電極驅(qū)動(dòng)的給藥系統(tǒng)為細(xì)胞施加藥物，然后使用Axopatch 200B放大器在全細(xì)胞模式下記錄GlyR在Gly刺激下所介導(dǎo)的電流大小，整個(gè)全細(xì)胞模式的記錄過(guò)程中，細(xì)胞膜電位鉗制在-60 mV(在上述參數(shù)和條件下記錄到的電流一般為氯離子電流[10-12])，最后使用軟件pClamp 10.4獲取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 維生素C對(duì)甘氨酸受體不同亞型功能的增強(qiáng)效果首先，我們分別在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)GlyR的不同亞型(GlyRα1、GlyRα2、GlyRα3)的cDNA質(zhì)粒以及表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的cDNA質(zhì)粒，然后我們對(duì)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行電生理記錄。實(shí)驗(yàn)中我們首先記錄GlyR在Gly刺激下所誘發(fā)的氯離子電流大小(glycine-activated chloride current，IGly)，Gly的濃度為可以激活GlyR介導(dǎo)的最大電流2 %的濃度(concentration for 2% of maximal effect，EC2)。隨后，我們?yōu)榧?xì)胞孵育1 μmol·L-1的VC，每孵育1min，記錄一次IGly，共記錄5 min，然后改為孵育細(xì)胞外液以洗脫VC，每孵育1 min，記錄一次IGly，共記錄3 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1 μmol·L-1VC的作用下GlyRα1所介導(dǎo)的電流大小顯著增強(qiáng)(P<0.05)(Fig1A，B)。而GlyRα2所介導(dǎo)的電流大小在1 μmol·L-1VC的作用下無(wú)顯著性變化(Fig 1C，D)。GlyRα3所介導(dǎo)的電流大小在1 μmol·L-1VC的作用下顯著增強(qiáng)(P<0.05)(Fig 1E，F(xiàn))。

接下來(lái)，我們對(duì)GlyRα1、GlyRα2和GlyRα3介導(dǎo)的電流大小隨時(shí)間的變化率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。隨著VC孵育時(shí)間的增加，GlyRα1和GlyRα3介導(dǎo)的電流逐漸增大。此外，我們發(fā)現(xiàn)1 μmol·L-1VC對(duì)GlyRα3的功能影響最明顯，對(duì)GlyRα1的功能影響次之，而對(duì)GlyRα2功能無(wú)明顯作用。在停止孵育VC改為施加細(xì)胞外液后，這一效果有所下降(Fig 2)。

Fig 1 Effects of 1 μmol·L-1 vitamin C on glycine-activated currents (IGly) in HEK-293T cellsA-F.Representative trace currents and average values of IGly in HEK-293T cells expressing GlyR α1 (A-B),α2 (C-D) and α3 subunits (E-F),n=6.Data are represented as .*P<0.05,**P<0.01 vs control(Time=0 min) based on unpaired t-tests.

Fig 2 Time course of average percentage potentiation of IGly induced by 1 μmol·L-1 vitamin C during a 5-min period of continuous incubation and a 3-min period of drug wash out in HEK-293T cells transfected with GlyR α1,α2 and α3 subunits(,n=6).**P<0.01 vs α2 group,##P<0.01 vs α1 group.

以上結(jié)果表明，1 μmol·L-1的VC可顯著增強(qiáng)GlyRα1亞基和GlyRα3亞基的功能，而對(duì)GlyRα2亞基功能的作用十分微弱。并且GlyRα3亞基對(duì)VC的作用最為敏感。

2.2 維生素C對(duì)甘氨酸受體功能的增強(qiáng)效果的量效關(guān)系我們首先記錄轉(zhuǎn)染了GlyR不同亞型的細(xì)胞在孵育VC前的IGly，然后分別對(duì)細(xì)胞孵育不同濃度的VC，同時(shí)記錄IGly。結(jié)果表明，GlyRα1所介導(dǎo)的電流大小在不同濃度VC的作用下均有不同程度的增強(qiáng)(Fig 3A)，并且VC濃度越高，VC對(duì)GlyRα1功能的增強(qiáng)效果越明顯(Fig 3B)。GlyRα3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GlyRα1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似，但VC對(duì)GlyRα3功能的增強(qiáng)效果明顯大于對(duì)GlyRα1功能的增強(qiáng)效果，如在0.01 μmol·L-1VC作用下，VC對(duì)GlyRα1功能的作用十分微弱，統(tǒng)計(jì)數(shù)值為(2.5±4.5)%，而VC對(duì)GlyRα3功能的增幅已經(jīng)達(dá)到了(109.1±12.3)%(Fig 3E，F(xiàn))。與GlyRα1，GlyRα3不同的是，VC為10 μmol·L-1時(shí)，才對(duì)GlyRα2功能表現(xiàn)出微弱的增強(qiáng)效果，增幅為(44.9±8.6)%(Fig 3C，D)。

以上結(jié)果顯示，VC對(duì)GlyR功能的增強(qiáng)效果存在著量效關(guān)系。與上述結(jié)果類(lèi)似的是，GlyRα3亞基對(duì)VC的作用更為敏感。

2.3 孵育磺吡酮不影響維生素C對(duì)甘氨酸受體的增強(qiáng)效果研究表明，VC可以通過(guò)細(xì)胞膜上的SVCT2進(jìn)入細(xì)胞中。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中我們參考前人的實(shí)驗(yàn)方法[13]，對(duì)轉(zhuǎn)染了GlyRα3的細(xì)胞施加1 mmol·L-1SVCT2的特異性抑制劑磺吡酮(sulfinpyrazone，SE)以抑制SVCT2的功能，防止VC進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后再孵育10 μmol·L-1的VC，并記錄IGly。我們發(fā)現(xiàn)，孵育SE并不會(huì)影響VC對(duì)GlyR功能的增強(qiáng)效果(Fig 4B)。

2.4 維生素C對(duì)甘氨酸受體突變體的作用為了尋找VC作用于GlyR的具體位點(diǎn)，我們對(duì)GlyR不同亞型的跨膜序列進(jìn)行了比對(duì)，根據(jù)VC對(duì)不同亞型GlyR功能增強(qiáng)效果的不同(VC對(duì)GlyRα1,GlyRα3功能存在增強(qiáng)效果，而對(duì)GlyRα2無(wú)增強(qiáng)效果)，我們最終在GlyR第3跨膜結(jié)構(gòu)域找到了相應(yīng)位點(diǎn)，即第296位的氨基酸(在該位點(diǎn)α1，α3為絲氨酸S296，α2為丙氨酸A296)(Fig 5A)。為了驗(yàn)證該位點(diǎn)是否的確是VC的作用位點(diǎn)，我們以GlyRα3為例，將其第296位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?GlyRα3 S296A)，并將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞中，然后再孵育10 μmol·L-1的VC，并記錄IGly。結(jié)果顯示，與野生型GlyRα3相比，10 μmol·L-1VC對(duì)突變體GlyRα3 S296A介導(dǎo)的電流大小的增強(qiáng)效果明顯下降(P<0.05)(Fig 5B，C)。

Fig 3 Effects of different concentrations of vitamin C on function of various subtypes of GlyRs(A-F) Trace records of IGly activated by EC2 glycine and bar graphs of VC induced potentiating effect on IGly in HEK-293T cells expressing GlyR α1 (A-B),α2 (C-D) and α3 subunits (E-F) before and after a 5-min continuous incubation with VC at different concentrations,n=6.**P<0.01 vs control(VC=0.01 μmol·L-1),##P<0.01 vs control(VC=0.1 μmol·L-1).

Fig 4 Effects of SVCT2 blocker sulfinpyrazone on vitamin C induced potentiation of GlyRs(A-B) Trace records of IGly activated by EC2 glycine (A) and bar graphs of VC induced potentiating effect on IGly (B) in HEK-293T cells expressing GlyR α3 subunits with or without preincubation of 1 mmol·L-1 sulfinpyrazone,a SVCT2 inhibitor,n=6.

Fig 5 Effects of S296A mutation on vitamin C potentiation of GlyRα3A.Amino acid alignment of the TM3 region flanking S296 (α3) or equivalent residues in the α1 and α2 subunits.(B-C) Trace records of IGly activated by EC2 glycine (B) and bar graphs of VC induced potentiating effect on IGly (C) in HEK-293T cells expressing wild-type (WT) and S296A mutant GlyR α3 subunits,n=6.**P<0.01 vs WT group.

以上結(jié)果表明，VC可能作用在GlyR的跨膜片段上，且第3跨膜片段的第296位的氨基酸在該相互作用中起關(guān)鍵作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在人工培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)GlyR的cDNA質(zhì)粒，獲得細(xì)胞膜上含有GlyR的HEK-293T細(xì)胞，然后采用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄GlyR所介導(dǎo)的電流大小。實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染GlyR的HEK-293T細(xì)胞系，細(xì)胞膜邊緣清晰、完整且細(xì)胞立體感強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)良好。電生理記錄過(guò)程中，微玻璃電極與細(xì)胞膜之間易形成高阻封接，封接電阻平均大于1 GΩ，說(shuō)明膜片鉗封接穩(wěn)定，所得電生理數(shù)據(jù)可靠。

GlyR是大型Cys-loop超家族的成員。激活后，GlyR可以選擇性的通透氯離子，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元超極化和介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性的神經(jīng)信號(hào)傳遞[6,14]。GlyR功能正常與否對(duì)生物體有著巨大的影響，如家族性驚厥的患者中，GlyR均有不同程度的功能紊亂，這將引起患者肌肉反復(fù)抽搐或類(lèi)似癲癇的癥狀[15]。

VC對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種離子通道的功能都有調(diào)節(jié)作用，如研究發(fā)現(xiàn)VC可以降低N-甲基-D-天冬氨酸受體激活后對(duì)神經(jīng)元興奮性的影響；VC可以通過(guò)清除胞外的谷氨酸進(jìn)而降低谷氨酸受體激活后對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用；VC還可以抑制多巴胺受體的功能[1]。但目前VC與GlyR之間的聯(lián)系還尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，VC可以增強(qiáng)GlyR的功能，且這一效果與VC濃度之間存在量效關(guān)系，這說(shuō)明VC水平紊亂可能會(huì)引起GlyR功能的障礙，反之，通過(guò)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中VC的濃度水平來(lái)得以緩解。

綜上所述，VC可以增強(qiáng)GlyR的功能，其增強(qiáng)效果對(duì)于不同亞型的GlyR都各不相同，并且這一作用可能并非是由于VC進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生的。本工作有助于加深對(duì)VC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中生物學(xué)意義的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步研究VC與GlyR之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。