邵江娟，金 春，彭 珣，蘇 瑩，張 峰，鄭仕中

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，其發(fā)病率是世界前六名，死亡率是惡性腫瘤的前三名。由于HCC早期診斷率低，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是中晚期，目前并無有效方法治愈。因此尋找有效的治療方式，阻斷肝腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，已成為迫切之需。為了遏制腫瘤細(xì)胞的增殖，有研究提出可以用某些手段將細(xì)胞周期永久性阻滯，即誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老[5]，并且衰老的腫瘤細(xì)胞可以被免疫系統(tǒng)識別從而被清除[5]。近年來，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老已成為治療癌癥的一種新思路和策略[5]。

研究表明，某些代謝活動可以調(diào)控細(xì)胞衰老。Li等[6]證實(shí)Sirt6可以通過影響細(xì)胞糖代謝調(diào)控細(xì)胞衰老；Yang等[7]發(fā)現(xiàn)線粒體谷氨酰胺代謝能夠調(diào)控人胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞衰老。Maddocks等[8]研究證實(shí)蛋氨酸循環(huán)代謝為各種反應(yīng)提供甲基單位，在HCC的增殖過程中發(fā)揮著重要作用。HCC具有蛋氨酸依賴，當(dāng)這種依賴被阻斷時，肝癌細(xì)胞不能增殖并且細(xì)胞周期停滯[9]。這些結(jié)果提示我們，可能通過調(diào)控蛋氨酸循環(huán)代謝來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。

為了研究蛋氨酸循環(huán)和細(xì)胞衰老之間的潛在機(jī)制，我們查閱資料發(fā)現(xiàn)，由線粒體溶質(zhì)載體蛋白SLC25A26基因編碼的線粒體S-腺苷蛋氨酸載體(SAMC)可以將S-腺苷蛋氨酸(SAM)攝取到線粒體，維持線粒體的甲基化反應(yīng)，從而參與調(diào)控細(xì)胞生理活動[10]。同時，Menga等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SLC25A26的下調(diào)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。綜上所述，我們推測SLC25A26可能通過調(diào)控蛋氨酸循環(huán)代謝誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。本研究重點(diǎn)探究SLC25A26、蛋氨酸循環(huán)代謝、細(xì)胞衰老以及HCC之間的關(guān)系，其研究結(jié)果為HCC的治療提供新靶點(diǎn)和新思路，對發(fā)現(xiàn)HCC的新治療手段具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞株，購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 胎牛血清FBS(BC-SE-FBS02)購自南京森貝伽生物科技有限公司；培養(yǎng)基DMEM(GibcoTM，11960044)購自上海佰曄生物科技中心；胰蛋白酶(T1300)、牛血清白蛋白BSA(A8020)、核糖核酸酶A(R4875)、碘化丙啶PI(P8080)、核染料DAPI(C0060)購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞裂解液RIPA(AP01L014)購自上海李記生物科技有限公司；PureLinkTMRNA提取試劑盒(12183018A)、DyNAmo HS SYBR Green qPCR 試劑盒(F410L)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(11668027)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；一抗p16(80772T)、p21(2947T)、HMGA1(7777T)、CDK4(12790T)、CDK6(13331T)、CyclinD1(55506T)、CyclinE1(20808S)、β-actin(4970T)以及二抗anti-rabbit IgG(7074P2)購自Cell Signaling Technology公司；ECL化學(xué)發(fā)光液(1122102)、PVDF膜(K1PA9019BK)購自Millipore公司；蛋白Marker(B2787)、苯甲基磺酰氟PMSF(10837091001)、TRIzol(93289)、TritonTMX-100(T8787)、氯仿CHCl3(C2432)、二甲基亞砜DMSO(D2650)、磺基水楊酸(S3147)、庚烷磺酸鈉(H2766)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH(G5262)購自Sigma-Aidrich公司。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州鴻基潔凈科技股份有限公司)；HERAcell 150i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；DM2000萊卡倒置顯微鏡(德國Leica公司)；電泳儀、凝膠成像儀、實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；流式細(xì)胞儀、冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；BKQ-B50II全自動高壓滅菌鍋(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；微量移液器(芬蘭BioHit公司)；UPT?-Ⅰ-5/10/20TN超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；BSA224S-CW電子天平(德國Sartorius公司)；DW-86L728型-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)；AF200AS制冰機(jī)(SCORTSMAN制冰機(jī)系統(tǒng)(上海)有限公司)

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞在無菌培養(yǎng)皿/瓶中接種，加入適量1 ∶9的胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液，用含5% CO2的37 ℃恒溫、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SLC25A26 plasmid與control plasmid購自漢恒生物科技(上海)有限公司。將適量HepG2細(xì)胞均勻接種于24孔板中，待其生長至50%左右時，加入構(gòu)建的質(zhì)粒，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具體操作方法參見轉(zhuǎn)染試劑操作說明書，通過Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 按照PMSF ∶磷酸酶抑制劑 ∶RIPA=1 ∶1 ∶100的比例提取總蛋白，每孔200 μL。用超微量分光光度計測蛋白濃度，根據(jù)濃度計算上樣量。配制10%分離膠和4%濃縮膠，插入梳子形成上樣槽，倒入電泳緩沖液，上樣，每孔30 μg，進(jìn)行電泳，電壓100 V，75 min。轉(zhuǎn)膜，電流350 mA，75 min。將膜置于牛奶中封閉2 h，并在搖床上慢速晃動。一抗封裝，4 ℃冰箱孵育過夜。二抗孵育2 h，結(jié)束后用TBST洗3次。使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.2.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 使用PureLink RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，然后使用智能核酸蛋白檢測儀測定樣本RNA濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得模板cDNA。使用DyNAmo HS SYBR Green qPCR 試劑盒對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用實(shí)時熒光定量PCR儀檢測熒光信號，最終以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因的mRNA相對表達(dá)水平，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences used for Real-time qPCR

1.2.5細(xì)胞周期檢測 收集細(xì)胞(濃度約為1×109/L)，取1 mL單細(xì)胞懸液，棄去上清，加70%乙醇(預(yù)冷)500 μL(固定2 h過夜)，離心(1 000 r·min-1，3 min)。加入500 μL染色工作液(Rnase A ∶PI=1 ∶9，即配即用)，染色30-60 min(避光)。用流式細(xì)胞儀檢測并記錄。

1.2.6免疫熒光檢測 在24孔板中放入載玻片(75%乙醇提前浸泡30 min)，然后每板500 μL 4%多聚甲醛孵育培養(yǎng)生長對數(shù)期細(xì)胞，當(dāng)生長至50%-60%時，給藥24 h，吸去含藥培養(yǎng)液，重新加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。先用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，然后每板500 μL 4%多聚甲醛孵育30 min。每片用500 μL 0.1%的TritonTMX-100通透10 min，然后用200 μL含1% BSA的PBS在室溫條件下封片1 h。用含1% BSA的PBS按1 ∶100的比例配置一抗(兔抗人)，每片200 μL，于4 ℃孵育過夜。用含1% BSA的PBS按1 ∶200的比例配置二抗(兔抗人)，每片100 μL，37 ℃孵育2 h(避光)。每片100 μL DAPI染色，洗滌。取出放在滴有一滴抗熒光淬滅封片液的載玻片上(有細(xì)胞一面和封片液接觸)，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7HPLC檢測蛋氨酸代謝物水平 待測樣品與4%磺基水楊酸1 ∶1混合，12 000 r·min-1離心15 min，取上清過0.22 μm濾膜，裝入進(jìn)樣瓶。超高效液相色譜儀(美國Thermo公司)儀器型號為：UltiMate 3000。色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動相：A(含10 mmol·L-1庚烷磺酸鈉的50 mmol·L-1NaH2PO4，pH 4.38) ∶B(甲醇)=80 ∶20；柱溫30 ℃；波長260 nm；進(jìn)樣量2 μL；運(yùn)行時間10 min。

2 結(jié)果

2.1 蛋氨酸循環(huán)代謝與肝癌細(xì)胞衰老的關(guān)系使用陽性藥Etoposide(2 μmol·L-1)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞衰老，并加入蛋氨酸循環(huán)代謝補(bǔ)充物SAM(0.1 mmol·L-1)促進(jìn)蛋氨酸循環(huán)，作用24 h。首先考察細(xì)胞衰老指標(biāo)p16、p21、HMGA1的表達(dá)，Western blot檢測結(jié)果表明，蛋氨酸循環(huán)代謝的增強(qiáng)降低了Etoposide誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞衰老水平(Fig 1A)；Real-time PCR檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了這個結(jié)果(Fig 1B)。細(xì)胞周期也是評價細(xì)胞衰老的指標(biāo)之一[13]，因此我們用流式細(xì)胞儀檢測促進(jìn)蛋氨酸循環(huán)對HepG2細(xì)胞周期的影響(Fig 1C)，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸循環(huán)代謝的增強(qiáng)使G1期在細(xì)胞周期中的比重降低，說明促進(jìn)蛋氨酸循環(huán)代謝可以抑制肝癌細(xì)胞衰老。綜上，蛋氨酸循環(huán)代謝可以調(diào)控肝癌細(xì)胞衰老。

2.2 SLC25A26能夠介導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老首先通過Western blot檢測過表達(dá)SLC25A26的轉(zhuǎn)染效率(Fig 2A)，然后檢測過表達(dá)SLC25A26對HepG2細(xì)胞衰老指標(biāo)(p16、p21、HMGA1)的影響(Fig 2B)，結(jié)果表明SLC25A26可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞衰老；進(jìn)一步采用免疫熒光法檢測過表達(dá)SLC25A26對HepG2細(xì)胞衰老指標(biāo)的影響(Fig 2C)，同樣證實(shí)了這一結(jié)論。綜上，SLC25A26能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。

2.3 SLC25A26調(diào)控蛋氨酸循環(huán)代謝進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老采用高效液相色譜法(HPLC)構(gòu)建了蛋氨酸循環(huán)代謝物 SAM、SAH(S-腺苷-L-高半胱氨酸)的檢測方法，F(xiàn)ig 3A為 SAM、SAH 標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品的檢測圖譜。結(jié)果表明，過表達(dá)SLC25A26降低了胞質(zhì)中蛋氨酸循環(huán)代謝物SAM、SAH 水平 (Fig 3B)；由于蛋氨酸循環(huán)代謝過程需要ATP的參與才能生成 SAM，我們采用試劑盒檢測了細(xì)胞ATP含量，結(jié)果表明過表達(dá)SLC25A26使得細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降(Fig 3C)；這些結(jié)果均提示過表達(dá)SLC25A26抑制了HepG2細(xì)胞中蛋氨酸循環(huán)代謝的活性。最后，我們考察了SAM對SLC25A26誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞衰老的影響，通過Real-time PCR檢測細(xì)胞衰老指標(biāo)(p16、p21、HMGA1)；結(jié)果提示，補(bǔ)充外源性SAM部分抵消了過表達(dá)SLC25A26誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞衰老作用(Fig 3D)。綜上，SLC25A26能夠通過調(diào)控蛋氨酸循環(huán)代謝誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。

Fig 1 Regulation of methionine cycle on HCC cell senescence (,n=3)A：Effect of SAM on protein expression of senescence indicators (p16,p21,HMGA1) by Western blot;B：Effect of SAM on mRNA levels of senescence indicators (p16,p21,HMGA1) by Real-time PCR;C：Effect of SAM on cell cycle by flow cytometry.*P<0.05,**P<0.01 vs Etoposide.

Fig 2 Effect of SLC25A26 on HCC cell senescence (,n=3)A：Transfection efficiency of SLC25A26 overexpression plasmid by Western blot;B：Effect of SLC25A26 overexpression on protein expression of senescence indicators (p16,p21,HMGA1) and cyclin (CDK4,CDK6,CyclinD1,CyclinE1) by Western blot;C：Effect of SLC25A26 overexpression on senescence indicators (p16,p21,HMGA1) by immunofluorescence.*P<0.05,**P<0.01 vs control vector.

Fig 3 Effect of SLC25A26 on HCC cell senescence by regulating methionine cycle metabolism (,n=3)A：Detection on SAM and SAH concentration of standards and samples by HPLC;B：Effect of SLC25A26 overexpression on SAM and SAH levels by HPLC.*P<0.05,**P<0.01 vs control vector;C：Effect of SLC25A26 overexpression on mitochondrial ATP level by kit.*P<0.05 vs control vector;D：mRNA levels of cell senescence indexes (p16,HMGA1,p21) by real-time PCR.*P<0.05,**P<0.01 vs pcDNA SLC25A26.

3 討論

HCC是最常見的原發(fā)性肝癌，預(yù)后差，目前尚無有效的治愈方案[14]。細(xì)胞衰老是一種細(xì)胞周期停滯的永久狀態(tài)，是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法之一[15]。很多研究表明，癌細(xì)胞內(nèi)的某些代謝可以影響細(xì)胞衰老水平，如Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體谷氨酰胺代謝調(diào)節(jié)人胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞的衰老。曾紅靜等[16]在探究蛋氨酸依賴和蛋氨酸代謝關(guān)系時，表明蛋氨酸依賴僅在腫瘤細(xì)胞中可見，蛋氨酸循環(huán)代謝在腫瘤細(xì)胞中也異常活躍。

首先，為了明確蛋氨酸循環(huán)代謝是否能夠影響細(xì)胞衰老水平，我們用陽性藥Etoposide誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老、加入SAM促進(jìn)蛋氨酸循環(huán)代謝，用Western blot和Real-time PCR檢測了肝癌細(xì)胞衰老指標(biāo)(p16、p21、HMGA1)，并用流式檢測肝癌細(xì)胞周期變化，證實(shí)了促進(jìn)蛋氨酸循環(huán)代謝可以削弱Etoposide誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞衰老，反向說明削弱蛋氨酸循環(huán)代謝可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。

Cianciulli等[10]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體溶質(zhì)載體蛋白SLC25A26基因編碼的SAMC可以將蛋氨酸循環(huán)產(chǎn)生的SAM轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)，表明SLC25A26與蛋氨酸循環(huán)代謝密切相關(guān)。Menga等[12]的研究表明，SLC25A26的下調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，聯(lián)系上文蛋氨酸循環(huán)代謝可以調(diào)控肝癌細(xì)胞衰老，我們推測SLC25A26可能介導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。為了驗(yàn)證這一推論，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)SLC25A26，利用Western blot和免疫熒光法檢測肝癌細(xì)胞衰老水平，結(jié)果表明過表達(dá)SLC25A26可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞衰老。

最后，為了證實(shí)SLC25A26可能通過蛋氨酸循環(huán)代謝調(diào)控肝癌細(xì)胞衰老，我們先用HPLC法檢測過表達(dá)SLC25A26對胞質(zhì)SAM、SAH水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SLC25A26削弱了蛋氨酸循環(huán)代謝。接著又用Real-time PCR檢測細(xì)胞衰老指標(biāo)(p16、p21、HMGA1)，結(jié)果證實(shí)了SLC25A26可以通過調(diào)控蛋氨酸循環(huán)代謝來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。

蛋氨酸循環(huán)代謝近年來引起學(xué)術(shù)界的高度重視，本文從蛋氨酸循環(huán)代謝與肝癌細(xì)胞衰老的角度出發(fā)，探究了SLC25A26通過調(diào)控蛋氨酸循環(huán)代謝誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老這一課題，為HCC的研究提供新靶點(diǎn)和新思路，對發(fā)現(xiàn)HCC的新治療手段具有重要的意義。