鄭維維，錢 程，鄒 偉，楊春媚，張 珊，王愛云,2，陸 茵,2，吳媛媛,2

(南京中醫(yī)藥大學 1．藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2． 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

免疫檢查點主要包括細胞程序性死亡受體-1(programmed cell death receptor 1，PD-1)和細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(cytotoxic lymphocyte antigen 4，CTLA-4)。免疫檢查點作為免疫穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，可下調機體免疫反應應答并參與外周耐受,而上調免疫檢查點信號通路可使得腫瘤細胞免受免疫細胞監(jiān)視[1]。因而免疫檢查點受體及其配體是理想的抗腫瘤治療靶點。但有研究發(fā)現(xiàn)通過阻斷PD-1治療肝癌患者，緩解率約為15%-20%[2-3]。

由于腫瘤細胞快速分裂增殖，血液供應與活性代謝無法滿足要求，導致腫瘤微環(huán)境缺氧和酸中毒。低氧誘導腫瘤細胞和基質細胞分泌促血管生成因子，從而打破了促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡，血管生成途徑被激活，導致血管不成熟，且呈現(xiàn)迂回、滲漏的狀態(tài)，腫瘤灌注不良。但抗血管生成藥物會過度削減血管導致腫瘤組織缺氧加重，其中涉及到諸多相關蛋白或信號通路，而單一靶標的藥物干預其靶點，往往會造成其他血管生成因子代償性現(xiàn)象，從而恢復腫瘤血管新生，這些都是導致抗血管生成藥物療效不佳的原因[4]。Yasuda等[5]發(fā)現(xiàn)ICI和抗血管生成藥物在治療小鼠結腸癌具有協(xié)同作用。隨后Wu等[6]證實ICI聯(lián)合抗血管生成藥物可以有效地延長乳腺癌小鼠的總生存期(overall survival，OS)。

本文對抗血管生成療法作用機制、腫瘤血管生成對ICI治療的影響以及ICI聯(lián)合抗血管生成藥物研究進展進行綜述。希望通過本文能夠加深對ICI聯(lián)合抗血管生成藥物治療腫瘤的認識，并為后期的研究提供參考。

1 抗血管生成療法

實體瘤會分泌多種促血管生成因子，例如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)以及apelin等等，其中VEGF介導內皮細胞過度增殖使其在血管生成中發(fā)揮著核心作用。VEGF主要與其受體VEGFR2 結合，發(fā)揮生物學功能。一方面，VEGF-VEGFR2通過激活下游PLCγ-PKC-Raf-MAPK和Grb2-Gab1-MAPK / PI3K-Akt信號通路來促進血管性血友病因子(von Wilebrand Factor，vWF)的表達和內皮細胞的過度增殖和遷移[7]；另一方面，VEGF-VEGFR2可以通過激活VEGFR2-TSAD-SRC-cadherin和PI3K-AKT-eNOS-NO信號通路導致血管滲漏[8]。

1.1 抗血管生成：從抑制血管生成到腫瘤血管正常化正常生理條件下，功能性血管的形成需要經歷內皮細胞之間緊密連接，基底膜形成和周細胞包被新生血管等過程[9]。但腫瘤微環(huán)境中VEGF的持續(xù)分泌，導致腫瘤血管結構異常。Juda Folkman教授于1971年率先提出腫瘤生長和轉移都依賴于腫瘤的血管，認為抑制腫瘤血管生成能夠作為抑制腫瘤生長和延長帶瘤生存期的治療法則，但抗血管生成藥物后期會導致腫瘤細胞轉化為缺氧可耐受表型，導致它的侵襲性和轉移能力增加[10]。

抗血管生成藥物聯(lián)合其他療法顯著抑制腫瘤生長[11]。但使用抗血管生成藥物的同時，將會抑制藥物和氧氣的運輸。由此，Jain[12]建立了一個模型來描述抗血管生成藥物治療時腫瘤血管的瞬時狀態(tài)：血管正?；Ｔ谠撃Ｐ椭?，當抗血管生成因子與促血管生成因子達到一定的平衡，異常結構和功能的腫瘤血管會逐漸轉變?yōu)檎Ｑ艿谋硇?。Huang等[11]通過研究抗血管生成劑量與療效之間的關系，發(fā)現(xiàn)使用高劑量(120或150 mg·kg-1)的VEGFR2抑制劑雖然能顯著抑制腫瘤血管生成，但會加速惡性腫瘤的轉移，而在使用低劑量(10、20 mg·kg-1)或常規(guī)劑量(40 mg·kg-1)時，則具有抑制血管數(shù)量的作用，較低劑量的抗血管生成藥物在誘導腫瘤血管正?；矫鎯?yōu)于較高劑量的療效，血管正?；癄顟B(tài)取決于給藥時間和劑量。

此外，apelin是血管緊張素受體樣蛋白J(angotensin protein J，APJ)受體的內源性配體，作為一種促血管生成肽，在多種腫瘤細胞以及腫瘤內皮細胞中APLN/APLNR途徑均被上調，且其與腫瘤治療的不良預后相關[13]。Iris等[14]發(fā)現(xiàn)在肺癌和乳腺癌模型中，敲除apelin可以彌補抗血管生成療法因缺氧帶來的耐藥相關性問題。

1.2 血管正?；纳颇[瘤免疫微環(huán)境腫瘤血管正?；瘜τ谀[瘤微環(huán)境具有調節(jié)作用，能夠將免疫抑制狀態(tài)重編程為免疫支持狀態(tài)。異常的腫瘤血管新生上調髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)還有腫瘤細胞的PD-L1的表達水平，抑制效應T細胞對腫瘤的浸潤并促進腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)極化為免疫抑制性M2樣表型，形成低氧、酸性的腫瘤微環(huán)境。此外，缺氧還可以上調免疫抑制生長因子，例如轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGFβ)。當給藥時間和劑量都適宜時，抗血管生成療法能夠促進腫瘤血管正?；?，增加效應T細胞的浸潤、減少Treg細胞以及MDSC募集，緩解的缺氧優(yōu)先誘導TAM極化為M1樣表型[15]。此外，低氧誘導的免疫抑制性信號如PD-L1通過血液灌注的改善也得以下調[16]。另外，抗VEGF藥物可阻斷DC分化的抑制信號并降低腫瘤微環(huán)境中MDSC數(shù)量[17]。

2 腫瘤血管生成對ICI治療的影響

2.1 腫瘤浸潤淋巴細胞的狀態(tài)決定ICI療效對于ICI治療，尤其是抗PD-1 / PD-L1抑制劑干預，腫瘤微環(huán)境中存在腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是有效治愈腫瘤的必要條件。根據(jù)已存在的TIL狀態(tài)，將腫瘤微環(huán)境分為3種類型：①免疫炎癥類型，功能性CD8+T細胞密集浸潤；②無浸潤類型，異常的血管生成和免疫抑制微環(huán)境阻止T細胞的浸潤；③免疫低下類型[18]。已經證實，屬于免疫炎癥型的腫瘤比其他兩種類型的腫瘤對ICI治療更敏感[19]。因此，提高腫瘤組織T細胞浸潤程度能夠增強ICI療效。

2.2 血管生成促進免疫抑制微環(huán)境的形成在腫瘤免疫過程中，抗原呈遞決定特異性T淋巴細胞的生成。有特定T細胞受體(T cell receptor，TCR)的T細胞浸潤到腫瘤，才能進行抗原識別并殺傷腫瘤。實體瘤內的血管生成亢進通過多種途徑影響免疫抑制微環(huán)境的形成。VEGF和血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)，可直接或間接作用內皮細胞以及先天性和適應性免疫細胞發(fā)揮免疫抑制作用。一方面，VEGF和Ang-2增強內皮細胞中PD-1和PD-L1的表達，導致表達PD-1的細胞毒性T細胞功能喪失。其次，VEGF下調腫瘤血管細胞粘附分子-1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達，進而抑制T細胞穿越內皮層滲入腫瘤。而且，由于Treg細胞中的FLICE抑制蛋白(cellular FLICE/caspase-8 inhibitory protein，CFLIP)高表達，腫瘤內皮細胞(endothelial cells，EC)Fas配體能夠選擇性觸發(fā)表達Fas的CD8+T細胞凋亡[15]。最后，EC還通過上調CLEVER-1 / stabilin-1募集免疫抑制性Treg細胞。所有這些途徑誘導有效屏障的形成，導致細胞毒性T細胞不能浸潤腫瘤[15]。另一方面，VEGF通過免疫細胞中的VEGFR2信號進行傳導。首先，它可以上調樹突狀細胞PD-L1中的表達，并由于其抗原呈遞能力受損而抑制樹突狀細胞的成熟和功能。其次，VEGF / VEGFR2信號傳導抑制效應T細胞的增殖，增加并促進Treg的腫瘤歸巢，這種作用取決于neuropilin-1(nrp-1)。而且除了PD-1、CTLA-4外，VEGF還可以上調T細胞其它負性免疫檢查點受體，導致T細胞衰竭。最后，高水平VEGF、Ang-2以及其他腫瘤分泌因子會促進TAM、MDSC和未成熟樹突狀細胞的募集和增殖。此外，這些免疫細胞群所分泌的細胞因子會促進腫瘤血管生成和免疫抑制微環(huán)境的形成[15]。

2.3 免疫細胞調節(jié)血管生成一方面，免疫抑制細胞群如Treg、MDSC和M2型TAM，有助于腫瘤免疫逃逸，通過分泌基質細胞衍生因子1和胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)促進腫瘤血管生成。另一方面，TAM和MDSC通過表達基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)，以降解細胞外基質去誘導腫瘤血管生成。Rolny等[20]發(fā)現(xiàn)富組氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein，HRG)通過抑制巨噬細胞FcγR受體，下調其衍生的PIGF，誘導M2樣TAM極化為M1樣表型，從而促進腫瘤血管正?；蜏p緩腫瘤的生長與轉移。此外，活化的CD11b+Gr1loF4/80+Siglec-F+嗜酸性粒細胞促進腫瘤血管正常化并有助于CD8+T細胞對腫瘤的殺傷作用。但其確切機制尚不明確，可能是通過嗜酸性粒細胞來源的干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)使得TAM極化為M1樣表型，導致VEGF的表達降低[21]。

此外，Huang等[22]發(fā)現(xiàn)單獨使用ICI通過激活效應T細胞達到促進腫瘤血管正?；男Ч鸞22]。腫瘤血管正?；軠p輕腫瘤微環(huán)境免疫抑制的過程，促進效應T細胞浸潤。免疫微環(huán)境重編程與腫瘤血管正?；g的這種正反饋調節(jié)相互加強，促進免疫介導的腫瘤根除[22]。

3 ICI聯(lián)合抗血管生成藥物的研究進展

活化的T細胞通過分泌IFN-γ作用于腫瘤血管內皮細胞上的IFN-γ受體上，直接促進使腫瘤血管正?；痆22]?；谀[瘤免疫與血管生成之間的相互作用，推測抗血管生成藥物可能增強ICI的療效。除了降低腫瘤微環(huán)境間質壓并改善T細胞浸潤外，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療也與其它機制相關。

3.1 阻斷VEGFR2誘導的免疫檢查點表達Dan等[23]進行肝癌小鼠模型研究。構建原位移植或誘導HCC模型，分為6組(Ⅰ)IgG；(Ⅱ)抗PD-1 單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)：RMP-014；(Ⅲ)抗VEGFR2 mAb：DC101 10 mg·kg-1；(Ⅳ)抗VEGFR2 mAb：DC101 40 mg·kg-1；(Ⅴ)抗PD-1 mAb +抗VEGFR2 mAb：DC101 10 mg·kg-1；(Ⅵ)抗PD-1 mAb +抗VEGFR2 mAb：DC101 40 mg·kg-1。其中聯(lián)合治療組具有最佳療效。為了證實VEGFR2對免疫檢查點表達的影響，采用體外3-D培養(yǎng)，構建異型腫瘤類器官。使用DC101后，類器官中腫瘤細胞和基質細胞中PD-L1表達明顯上調。隨后磁珠分選VEGFR2+細胞探究VEGFR2阻斷后PD-L1上調的具體機制，表明DC101靶向內皮細胞中VEGFR-2上調HCC細胞PD-L1這一過程，部分由內皮細胞表達的IFN-γ所介導[23]。

此外，Voron等[24]觀察到抗VEGF可以選擇性抑制腫瘤內CD8+T細胞免疫檢查點的表達。VEGF可以通過激活VEGFR2-PLCγ-calcineurin-NFAT信號通路來上調PD-1的表達。因此聯(lián)合療法能有效阻斷PD-1/PD-L1軸，抑制腫瘤生長，特別是VEGF分泌較高的腫瘤。

3.2 誘導高內皮小靜脈形成Allen等[25]研究抗PD-L1 mAb：B20S和抗VEGFR2 mAb：DC101在胰腺神經內分泌腫瘤、乳腺癌和膠質母細胞瘤的小鼠模型中聯(lián)合治療的療效。在胰腺神經內分泌腫瘤和乳癌中，聯(lián)合療法在腫瘤體積和總生存期方面比單一療法顯示出優(yōu)勢，對于膠質母細胞瘤而言，聯(lián)合療法優(yōu)勢更顯著。聯(lián)合治療2周后，僅50%膠質母細胞瘤中IFN-γ+CD8+T細胞略微增加，而胰腺神經內分泌腫瘤和乳腺癌中IFN-γ+CD8+和IFN-γ+CD4+T細胞水平增加了兩倍。胰腺神經內分泌腫瘤和乳腺癌中的血管除了完整的周細胞覆蓋之外，由肥大的內皮細胞而不是扁平的內皮細胞增厚，表現(xiàn)出高內皮小靜脈(high endothelial venules，HEV)特征[26]。HEV與淋巴細胞歸巢有關，淋巴毒素β受體(lymphotoxin beta receptor，LTβR)信號通路對維持HEV表型至關重要，聯(lián)合治療通過激活LTβR信號通路有效殺死膠質母細胞瘤細胞。

3.3 抑制IFN-γ介導的負反饋調節(jié)Schmittnaegel等[27]發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體A2V同時靶向VEGF和ANG2的阻斷要比單一療法有更好的治療效果，且聯(lián)合抗PD-1治療能進一步增強雙重阻斷的療效。在這項臨床前研究中，采用多種荷瘤小鼠模型，包括轉基因或移植性乳腺癌、胰腺神經內分泌癌、黑色素瘤和結直腸癌模型。A2V處理后，腫瘤微環(huán)境中多種抗腫瘤免疫細胞數(shù)量增加，如成熟DC、M1樣表型TAM、IFN-γ+/ CD69+CD8+T細胞等，但由于IFN-γ所介導的負反饋調節(jié)機制，致使腫瘤血管周圍的CD8+T細胞增加且腫瘤細胞PD-L1的高表達。而抗PD-1和A2V的聯(lián)合治療能夠抑制IFN-γ介導的負反饋調節(jié)并增強免疫反應，與A2V療法相比，接受聯(lián)合治療的超過30%的小鼠OS延長。

3.4 ICI聯(lián)合抗血管生成藥物的臨床研究

3.4.1抗CTLA -4 mAb聯(lián)合抗VEGF mAb NCT00790010是一項I期臨床試驗[28]，旨在探討易普利姆瑪(抗CTLA-4 mAb)和貝伐單抗(抗VEGF mAb)在轉移性黑色素瘤患者中的作用。所有46名入選患者均被分為4組，并接受了不同劑量的聯(lián)合治療。該治療方案顯著上調腫瘤血管內皮細胞的CD31、E-選擇素、VCAM-1和其他粘附分子的表達，增加細胞毒性T細胞和成熟DC浸潤。與之前的研究結果相比，接受聯(lián)合治療的患者在預后方面占有很大優(yōu)勢。

進一步的研究表明，聯(lián)合治療的有利優(yōu)勢可能源于誘導galectin-1(Gal-1)的免疫反應[28]。Gal-1參與腫瘤細胞增殖、侵襲、免疫逃逸和血管生成等過程。收集患者的血漿樣品以檢測抗Gal-1抗體的濃度，結果表明，聯(lián)合治療后62.5%完全緩解/部分緩解患者中抗Gal-1抗體滴度增加≥1.5倍，36.4%病情穩(wěn)定患者和23.1%病情惡化患者治療后抗Gal-1抗體滴度略微增加。對聯(lián)合療法的不同反應歸因于不同的抗Gal-1免疫反應。一方面，抗VEGF mAb上調Gal-1的表達，另一方面，抗CTLA-4 mAb增加T細胞克隆的表型。這兩個因素提高了抗原呈遞細胞識別Gal-1的可能性。此外，另外兩項臨床試驗(NCT02210117和NCT01950390)正在研究易普利姆瑪聯(lián)合貝伐單抗分別治療轉移性腎癌和III-IV期黑色素瘤患者的療效。

3.4.2抗PD- L1 mAb聯(lián)合抗VEGF mAb Wallin等[29]受到抗CTLA-4 mAb和抗VEGF mAb聯(lián)合治療作用顯著的啟發(fā)，開展抗PD-L1 mAb聯(lián)合抗VEGF mAb的臨床研究。NCT01633970是一項旨在研究阿特珠單抗(抗PD-L1)聯(lián)合貝伐單抗或化療的安全性和藥理學作用的1b期臨床實驗。

10名腎細胞癌轉移性患者接受1周期的貝伐單抗單藥治療后，實施聯(lián)合治療方案，直至疾病向不良方向發(fā)展。結果10名患者中有8名患者病情得以控制。此外，與貝伐單抗單藥治療后患者的腫瘤樣品相比，聯(lián)合治療后CD8、PD-L1以及主要組織相容性復合物-I的表達顯著增加[29]。

3.4.3抗PD-L1 mAb聯(lián)合抗血管生成藥物TKI 到目前為止，臨床研究中的聯(lián)合方案多由ICI和抗血管生成藥物貝伐單抗組成。2018年，Choueiri等[30]首先報道了阿維魯單抗(抗PD-L1 mAb)聯(lián)合阿昔替尼(TKI)在晚期腎透明細胞癌(JAVELIN Renal 100)中的臨床實驗(NCT02493751)。55名患者中，除一名患者由于磷酸肌酸激酶異常增加，其余54名患者都接受阿維魯單抗聯(lián)合阿昔替尼治療。在近一年的隨訪期內，58%的患者對聯(lián)合治療表現(xiàn)出完全緩解或部分緩解，20%的患者病情相對穩(wěn)定。此外，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達沒有顯著影響治療效果[30]，見Tab 1。

Tab 1 Clinical trials investigating efficacy of ICI plus anti-angiogenesis therapy

4 總結與展望

免疫檢查點抑制劑和抗血管生成藥物單獨使用均有各自的局限性，而臨床前和臨床研究表明抗血管生成藥物聯(lián)合ICI治療腫瘤的作用相互增強。一方面，抗血管生成劑通過增加抗/促腫瘤免疫細胞的比例和降低多個免疫檢查點的表達抑制負性免疫應答；另一方面，ICI治療可以重塑免疫微環(huán)境并促進血管正?；?。此外，血管正常化能夠提高藥物遞送效率，使得較小劑量的ICI就能發(fā)揮較大治療效果，避免大劑量ICI帶來的不良反應。但目前需要解決的主要問題是如何在聯(lián)合治療中優(yōu)化抗血管生成劑的給藥時間和劑量，擴大血管正?；翱诓@得最長的生存期?？傊?，ICI聯(lián)合抗血管生成藥物將是克服治療耐藥性并改善患者預后的有效策略。