冀曉麗，胡 玥，盛云華，唐黎明

(上海市食品藥品檢驗所 藥理毒理室/藥物安全評價中心，國家藥品監(jiān)督管理局化學藥品制劑質(zhì)量分析重點實驗室，上海 201203)

呼吸道體外模型常被用于研究外源性化合物、吸入制劑、空氣污染物、納米顆粒物、煙草制品等暴露誘導(dǎo)的吸入毒性和肺部疾病[1]。目前，體外吸入毒性評價多采用穩(wěn)定傳代的細胞系，如A549、Calu3、16HBE、BEAS-2B等構(gòu)建呼吸道上皮的模型，然而這些細胞系的生理特征與體細胞之間差異較大，對呼吸系統(tǒng)的特征反應(yīng)具有一定局限性[2]。呼吸道上皮細胞是機體呼吸道防御系統(tǒng)的重要屏障，它形成的假復(fù)層纖毛柱狀上皮將人體的內(nèi)環(huán)境與外界環(huán)境有效隔離[3]，呼吸道氣管和支氣管組織表面分布的細胞包括纖毛細胞、分泌黏液的杯狀細胞、無纖毛細胞和基底細胞等[3]。因此，唯有原代培養(yǎng)呼吸道上皮細胞才能在生理功能和結(jié)構(gòu)上更貼近體內(nèi)氣管上皮細胞的自然生長狀態(tài)，成為研究氣管上皮功能和相關(guān)疾病的重要體外模型[4]。

氣液體界面(air-liquid interface，ALI)培養(yǎng)技術(shù)是培養(yǎng)呼吸道上皮細胞的重要方法，ALI培養(yǎng)的研究在國外已有多年的歷史[5]，但目前國內(nèi)也只有少數(shù)實驗室成功建立了該培養(yǎng)平臺，而且不同實驗室采用的方法各異[6]。其中包括原代細胞的分離方法、ALI培養(yǎng)基成份、預(yù)鋪膠原類型的選擇、細胞的接種密度等都各不相同[7-8]。本研究建立的小鼠氣管上皮細胞(mouse tracheal epithelial cells，MTEC)分離和分化培養(yǎng)模型，是從小鼠體內(nèi)分離氣管后，通過ALI培養(yǎng)上皮細胞逐步分化出纖毛，為研究纖毛的形成和氣道上皮發(fā)育的最佳模型[9]。ALI培養(yǎng)方法的優(yōu)點，是可以利用體外暴露裝置將外源性氣溶膠沉積在上皮細胞表面，最大限度地減少各類氣溶膠的變性，從而模擬人體呼吸道暴露環(huán)境致病因素的生物學特性[10]。本研究對該模型培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)、緊密連接的形成及細胞分化纖毛等方面進行了評估，為后續(xù)外源化合物毒性評價提供了成熟的體外吸入暴露模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 C57BL/6小鼠，成年♂，8周齡，體質(zhì)量大于20 g。1只小鼠大約可收集(15-20)萬個細胞。來源：上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0003，動物飼養(yǎng)于上海市食品藥品檢驗所動物房，動物飼養(yǎng)房間的溫度：(20-25) ℃，濕度：40%-70%，本試驗符合實驗動物倫理原則，已通過上海市食品藥品檢驗所實驗動物管理和使用委員會的審查，編號為IACUC-SIFDC19132。

1.1.2試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，批號：11330032)；Ham’s/ F12培養(yǎng)基(Gibco，批號：3175068)；青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin，Gibco，批號：10378016)；胎牛血清(FBS，Hyclone，批號：DBC0520)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Corning，批號：26318001)；平衡鹽溶液(HBSS，Gibco，批號：14175095)；鏈霉蛋白酶(Pronase，Roche，批號：10165921001)；脫氧核糖核酸酶(DNasel，Sigma，批號：DN25)；牛血清白蛋白(BSA，absin，批號：abs9157)、胰島素(Insulin，Sigma，批號：16634，)；轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，Sigma，批號：T1147)；表皮生長因子(EGF，Sigma，批號：E9644)；維甲酸(RA，Sigma，批號：R265)、霍亂毒素(CT，absin，批號：abs8001)；牛垂體提取物(BPE，absin，批號：abs9919)；Ⅳ型膠原(Pure col，BioMatrix，批號：5005)；抗熒光淬滅封片液(Beyotime，批號：P0126)；DAPI(BD，批號：)；Transwell?-Clear培養(yǎng)板(Corning-Costar，批號：3450)PrimariaTM組織培養(yǎng)皿(Corning，批號：353803)。抗體 α-tubulin (abcam,貨號：ab24610)；β-tubulin-Ⅳ(abcam，貨號：ab179509)ZO-1(Cell Signaling Technology，貨號：#13663)；Foxj1(eBiosciences，貨號：14-9965-80)；MUC5AC(Cell Signaling Technology，貨號：#61193)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signaling Technology，貨號：#4412)；Anti-Mouse IgG(Cell Signaling Technology，貨號：#4409)。

1.1.3儀器 Heracell VIOS 160i CO2培養(yǎng)箱(德國Thermo Scientific公司)；BCM-1300A層流超凈臺(Airtech公司)；Vi-cell XR細胞活力測定儀(德國Beckman counter公司)；THUNDER Imager 3D Live Cell(德國 Leica公司)；Olympus IXplore SpinSR10轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)(日本 Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)小室膠原包被 膠原是基膜的主要成分，將細胞培養(yǎng)皿包被膠原，模擬基膜的內(nèi)環(huán)境。將商品化的Ⅳ型膠原3 g·L-1，用無菌水稀釋為30-50 mg·L-1，加入12孔或24孔Transwell過濾膜小室中，每孔加0.5-1 mL。37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育過夜。d 2，吸出膠原蛋白涂層溶液，讓濾膜風干5 min，放置于生物安全柜中，紫外線消毒。再用無菌PBS沖洗小室和基底層3次，去除游離膠原蛋白。包被好的Transwell培養(yǎng)皿在4 ℃條件下，可存放8周左右。

1.2.2增殖培養(yǎng)基及分化培養(yǎng)基的配置 原代氣管上皮細胞的培養(yǎng)基配制是細胞增殖、分化的關(guān)鍵因素，直接影響纖毛分化的成功與否，該研究通過多次分離氣管培養(yǎng)試驗，總結(jié)出細胞增殖與分化的培養(yǎng)基配比成分與濃度。

(1)氣管上皮增殖培養(yǎng)基配制：取475.5 mL DMEM/F12加入7.5 mL HEPES溶液，10 mL谷氨酰胺，2 mL 7.5% NaHCO3溶液，5 mL青霉素/鏈霉素。取45 mL配制好的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基加入5 mL 胎牛血清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，隨后取45.7 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入2.5 mL胎牛血清，50 μL 5μmol·L-1維甲酸，250 μL胰島素溶液，250 μL表皮生長因子，200 μL牛腦垂體提取物，50 μL轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液，50 μL霍亂毒素溶液，過濾消毒后4 ℃保存可使用2 d。具體濃度如Tab 1。

Tab 1 MTEC Plus medium recipe

(2)氣管上皮分化培養(yǎng)基配制：取上一步配制好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基250 mL，添加625 μL胰島素，250 μL轉(zhuǎn)鐵蛋白，62.5 μL霍亂毒素溶液，250μL表皮生長因子,7.5 mg牛腦垂體提取物，2.5 mL BSA，最終容量250 mL，使用前加入 250 μL 5 μmol·L-1維甲酸，過濾消毒后4 ℃保存可使用2 d。具體濃度如Tab 2。

Tab 2 MTEC ALI expansion medium recipe

1.2.3小鼠氣管的分離與消化 d 1：小鼠采用頸椎脫位處死，避免破壞頸部和氣管組織；在組織培養(yǎng)罩與解剖鏡下，取出氣管，去除附著組織，將每根清洗過的氣管放入無菌Ham’s/ F12培養(yǎng)基中，置于冰上。使用眼科剪把每個氣管縱向切開，放入新鮮配制的Pronase中，大約3 mL的Pronase可以覆蓋10-30個氣管。4 ℃孵育過夜，冰箱放置18-24 h，切勿倒置。d 2：取出裝有氣管的Pronase離心管，顛倒5次，室溫放置10 min；加入預(yù)熱37 ℃的FBS，終體積為10%；依次加入Ham’s/ F12培養(yǎng)基，丟棄氣管，留下培養(yǎng)基，4 ℃，500 ×g，離心10 min；吸取上清液，留下細胞沉淀，用DNasel重懸細胞，體積為200 μL/氣管；使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12重懸細胞，采用差速貼壁法，將收獲的原代細胞接種在PrimariaTM組織培養(yǎng)皿中，放置于細胞培養(yǎng)箱4-6 h，使貼壁速度較快的成纖維細胞貼壁，上皮細胞懸??；將懸浮細胞收集在離心管中，4 ℃，500 ×g，離心5 min；室溫下，吸出上清液，加入Table 1配制好的MTEC增殖培養(yǎng)基，采用細胞計數(shù)儀，計算懸液中活細胞數(shù)量，接種細胞在包被好Ⅳ型膠原的Transwell培養(yǎng)皿中，每孔接種細胞數(shù)量參考Tab 3。

Tab 3 Media volumes and cell numbers for MTEC cultures on supported membranes (Transwell?,Corning)

1.2.4免疫熒光標記方法 使用外科手術(shù)刀片從12孔或24孔Transwell細胞培養(yǎng)板中，取下小室的過濾膜，放入干凈的細胞培養(yǎng)板中，直接加入4%多聚甲醛，搖床固定10 min，PBS 清洗2次，每次5 min；(0.2-0.5)% Triton-100 對細胞透化處理30 min，PBS 清洗2次，每次5 min；5% BSA室溫搖床上孵育2 h，PBS 清洗2次，每次5 min。根據(jù)抗體稀釋比例(1 ∶500/1 000)，用一抗稀釋液稀釋抗體，4 ℃搖床孵育過夜；d 2，取出過濾膜，PBS 清洗2次，每次5 min，羊抗鼠 IgG二抗、兔抗鼠 IgG二抗，濕盒內(nèi) 37 ℃孵育 2 h；PBS 清洗兩次，每次5 min；加入預(yù)先配制好的 DAPI，常溫避光在搖床緩慢孵育。染色后用共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5掃描電鏡方法(SEM) MTEC培養(yǎng)d 14-21，收集細胞電鏡拍照。使用外科手術(shù)刀片，取下Transwell小室的過濾膜，放入干凈的細胞培養(yǎng)板中，PBS清洗3遍；加入2.5%的戊二醛，4 ℃冰箱固定過夜；0.1 mol·L-1PBS 漂洗3次，每次10 min；1%餓酸固定液固定1-1.5 h，PBS漂洗3次，每次10 min；梯度脫水，30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，80%乙醇10 min，95%乙醇10 min，100%乙醇(無水硫酸鈉處理)10 min，重復(fù)處理2次；臨界點干燥，在沒有表面張力的條件下干燥，最大程度保存樣品原貌；鍍膜儀噴金，厚度為15 nm左右；通過掃描電子顯微鏡(Quanta 200，F(xiàn)EI，USA)觀察拍照。

1.2.6跨上皮電阻檢測(TEER) 采用Millicell?細胞電阻儀，在MTEC增殖與ALI分化的不同時間，監(jiān)測細胞跨上皮電阻值(TEER)，12孔Transwell培養(yǎng)板，每孔測量 3個有效TEER值，3個孔數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析?？缟掀る娮柚涤靡韵鹿竭M行校正：TEERture(Ωcm2)=(TEERsample-TEERblank)(Ω)×Effective Membrane Area(cm2)。式中：TEERsample:樣品粗測值；TEERblank:空白值；Effective Membrane Area:有效生長面積。

2 結(jié)果

2.1 MTEC培養(yǎng)不同時期細胞形態(tài)特征小鼠氣管分離上皮細胞，均勻鋪板，細胞增殖1-2 d，避免影響貼壁，不做移動。細胞培養(yǎng)3 d后，更換加入新鮮RA的增殖培養(yǎng)基(Tab 1)，通過倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況(Fig 1)，細胞培養(yǎng)2 d后，完全貼壁，細胞形態(tài)拉長變大；細胞增殖3-5 d，數(shù)量增加，鏡下可見團塊狀細胞島；細胞增殖5-7 d，融合度達到100%，測定細胞跨上皮電阻值(Rt)，Rt超過1 000 Ω·cm2后，更換氣液界面培養(yǎng)，記作ALI d 0。從Transwell小室吸出培養(yǎng)基，在基底層加入新鮮無血清培養(yǎng)基(Tab 2),頂層小室保持干燥。隔天換一次基底層培養(yǎng)基，用PBS清洗小室細胞，細胞可在ALI條件下分化，ALI培養(yǎng)d 3-5，細胞變小變圓，呈現(xiàn)立體形態(tài)。ALI培養(yǎng)d 7-14，細胞分化良好，出現(xiàn)鵝卵石樣外觀，鏡下可見纖毛擺動，濾膜表面至少有30%纖毛細胞。

Fig 1 Appearance of MTEC on membranes by light microscopy during culture(×100)

2.2 MTEC緊密連接和細胞極化的形成使用跨上皮電阻儀對MTEC培養(yǎng)過程的不同時期進行TEER值(Rt)的測定，評價細胞間緊密連接的形成情況。試驗結(jié)果顯示(Fig 2)，浸沒式培養(yǎng)細胞5-7 d后，單層細胞接近完全融合，細胞跨上皮電阻值增加，Rt值>1 000 Ω·cm2，轉(zhuǎn)化為氣液界面培養(yǎng)。ALI d 0，Rt值為(1 830±17) Ω·cm2；ALI d 5，Rt值增加到(2 180±169) Ω·cm2；，ALI d 10，Rt值增加到(2 970±242) Ω·cm2。隨著ALI培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸分化，ALI d 15，跨上皮電阻值逐漸降低(1 930±52) Ω·cm2。為了將Rt的增加與基因特異性表達相關(guān)聯(lián)，我們對緊密連接蛋白ZO-1進行了評估。ZO-1的表達也提示了細胞大小和數(shù)量的改變，我們發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)量在培養(yǎng)的第一周內(nèi)明顯增加，免疫熒光檢測各組細胞膜連接中ZO-1在ALI培養(yǎng)不同時間的表達(Fig 3)。

2.3 MTEC分化不同時期纖毛形態(tài)掃描電鏡結(jié)果通過掃描電鏡觀察小鼠氣管上皮細胞表面形態(tài)(Fig 4)。照片顯示，ALI培養(yǎng)d 5-7上皮細胞大而扁平，細胞均勻，有微絨毛，也有少量纖毛。在細胞增殖后，ALI培養(yǎng)過度到上皮細胞分化階段。上皮細胞分化d 14-20后，ALI培養(yǎng)的MTEC表面形態(tài)與小鼠氣管形態(tài)相似。起初上皮細胞外觀，纖毛短且不動，隨著時間延長，纖毛變化長度直到成熟。ALI d 7-14，可以觀察到運動的成簇的纖毛。

Fig 2 TEER assessment of epithelial cells cultured at an air-liquid interface

Fig 3 Expression of ZO-1 in cell membrane junctions detected by immunofluorescence at indicated days

Fig 4 Differentiation of MTEC assessed by scanning EM at indicated days

2.4 MTEC分化不同時期β-tubulin蛋白定位與表達β-微管蛋白-Ⅳ(β-tubulin-Ⅳ)的表達標記纖毛軸絲的形成，藍色熒光為DAPI染色的細胞核，免疫熒光試驗在MTEC氣液界面培養(yǎng)的不同時間，標記纖毛在細胞分化不同時期的形態(tài)特征(Fig 5)。ALI培養(yǎng)6 d β-tubulin標記細胞形態(tài)較大，可見微管蛋白典型特征。ALI d 12，細胞形態(tài)變圓變小，β-tubulin標記可見典型細胞有絲分裂，纖毛軸絲形成。ALI d17，纖毛分化狀態(tài)良好，形態(tài)清晰，成簇狀分布在纖毛細胞的表面，具有纖毛柱狀上皮細胞的特征。通過對纖毛的鑒定，可看出本實驗構(gòu)建的小鼠氣管假復(fù)層柱狀上皮模型的纖毛細胞分化良好。

2.5 MTEC假復(fù)層纖毛上皮相關(guān)蛋白定位與表達氣液界面培養(yǎng)25 d后，上皮細胞已完全分化，細胞邊界更加清晰，排列更加緊密，上層有粘液分泌。初級和運動的纖毛可以用乙?；摩?微管蛋白(α-tubulin)、β-微管蛋白-Ⅳ(β-tubulin-Ⅳ)抗體來標記，分泌的粘液可以用粘液蛋白MUC5AC進行標記，MUC5AC蛋白主要是由上皮細胞中的杯狀細胞分泌和合成的，對MUC5AC的檢測能夠說明杯狀細胞的分化形成。如Fig 6，結(jié)果顯示細胞的纖毛分化狀態(tài)良好，纖毛清晰，成簇狀分布在纖毛細胞的表面，纖毛細胞在上皮中分布均勻且數(shù)量較多，具有纖毛柱狀上皮細胞的特征。綠色熒光分別標記3種抗體，從而在蛋白的水平上證明了纖毛細胞與分泌細胞的分化形成，但杯狀細胞的數(shù)量較纖毛細胞少。

Fig 5 Immunofluorescence and confocal microscopy of β-tubulin at an air-liquid interface

Fig 6 Immunofluorescence and confocal microscopy of ciliated cell cultured at an air-liquid interface

3 討論

原代氣管上皮細胞為假復(fù)層纖毛柱狀上皮，其正常生理功能的實現(xiàn)取決于細胞分化程度以及細胞極性的形成與維持。細胞單層生長的情況下，使用無極性和低分化的原代培養(yǎng)細胞和永生化細胞系對于呼吸道上皮細胞研究來說價值有限，并不能完全反映體內(nèi)生理功能。本研究總結(jié)的小鼠氣管上皮細胞原代培養(yǎng)方法，是將成年小鼠氣管通過蛋白酶消化分離得到上皮細胞，隨后接種到預(yù)先包被膠原的Transwell半透膜中，在氣液界面的條件下進行培養(yǎng)。本文通過對培養(yǎng)基改造(無血清培養(yǎng))和培養(yǎng)皿膠原包被的特殊處理，實現(xiàn)了對小鼠呼吸道上皮細胞穩(wěn)定有效的大量獲取，與其他已有實驗相比，具有獲得細胞數(shù)量穩(wěn)定、可靠、分化程度高等優(yōu)勢[11]。當細胞完全融合后，細胞間形成緊密連接，構(gòu)成完整的生物屏障作用，通過細胞跨上皮電阻檢測和緊密連接蛋白的表達與定位，評價細胞間緊密連接形成與細胞極化分析。細胞在分化培養(yǎng)基中過渡到氣液體界面(air-liquid interface，ALI)培養(yǎng)條件，經(jīng)過一段時間的ALI培養(yǎng)后，上皮細胞經(jīng)過分化后能產(chǎn)生纖毛細胞、杯狀細胞、基細胞等多種細胞，并由細胞分泌的粘液覆蓋，產(chǎn)生類似于體內(nèi)生理結(jié)構(gòu)和功能的假復(fù)層纖毛柱狀上皮組織。氣液界面培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為吸入毒理學的體外研究提供了技術(shù)支持[12]。ALI模型培養(yǎng)的細胞在功能和結(jié)構(gòu)上都貼近體內(nèi)氣管上皮細胞的自然生長狀態(tài)，為研究氣管上皮的功能和相關(guān)疾病奠定了良好的基礎(chǔ)[13]。在呼吸系統(tǒng)疾病研究方面，ALI培養(yǎng)提供了一種有效的細胞模型，被廣泛地應(yīng)用于多種呼吸道病毒的分離培養(yǎng)和致病機制的研究。

本研究結(jié)果顯示，小鼠氣管分離得到上皮祖細胞需要2 d；小鼠氣管、基底細胞在浸沒培養(yǎng)中增殖，直到融合并產(chǎn)生初級纖毛需要5-10 d；細胞融合后，轉(zhuǎn)為氣液界面培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化為多纖毛細胞和其他類型的氣道上皮細胞需要10-14 d；成熟的假復(fù)層纖毛柱狀上皮可以存活40 d左右。纖毛細胞形成開始于ALI培養(yǎng)后2-5 d。在隨后的1周內(nèi)，在其他基底細胞中誘導(dǎo)分化，因此在ALI 培養(yǎng)14 d后，超過30%的上皮細胞是多纖毛細胞。由于在體內(nèi)難以研究活動纖毛的生物作用，且缺乏多纖毛細胞[14]。因此，本研究利用纖毛蛋白的免疫熒光標記，識別和表征纖毛形成途徑的不同階段。在氣管和MTEC中，活動的纖毛發(fā)生是高度不同步的，因此本文描述的細胞培養(yǎng)時間是近似的，在這個過程的大多數(shù)階段，免疫標記的結(jié)構(gòu)與電子顯微鏡鑒定的形態(tài)特征相關(guān)[15]。緊密連接蛋白ZO-1在MTEC增殖與分化的不同時期，表達穩(wěn)定。MTEC細胞呈立體結(jié)構(gòu)，細胞核位置低于細胞表面。因此，觀察小室細胞的結(jié)構(gòu)，用緊密連接蛋白定位比標記細胞核更有利用觀察。

通過實驗表明，MTEC增殖和分化的培養(yǎng)方法和條件較復(fù)雜，各種生長因子，特別是胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子和維甲酸對細胞增殖、纖毛形成和粘液細胞分化至關(guān)重要。本研究參照已有文獻[16]，對已有方法進行優(yōu)化，采用低溫過夜酶消化法，保持了分離到的細胞活性，在無血清的培養(yǎng)環(huán)境中獲得生長和維持分化的上皮細胞。采用差速貼壁法，促進了細胞的增殖，并消除了成纖維細胞的污染，提高了培養(yǎng)細胞的純度；在培養(yǎng)皿中預(yù)鋪Ⅳ型膠原，為細胞提供了生長基質(zhì)，促進細胞的貼壁生長[17]。試驗研究結(jié)果表明，小鼠原代氣管上皮細胞(mouse tracheobronchial epithelial cells，MTEC)模型構(gòu)建成功，后續(xù)可作為外源性化合物毒性篩選、吸入制劑安全性評價及毒性機制研究的最佳模型[18]。