蘇 波，楊詠梅，劉政海，何 慧

(南華大學(xué) 1.藥物藥理研究所、2.應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

脂過(guò)氧化物酶(adiporedoxin，Adrx)是過(guò)氧化物酶-2(peroxiredoxin-2)家族的新成員，目前對(duì)其生物學(xué)功能知之甚少。Adrx分子結(jié)構(gòu)與過(guò)氧化物酶(peroxiredoxins，PRDXs)和硫氧還蛋白家族(thioredoxins，TRXs)相似[1]。PRDXs和TRXs調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展[2-3]。本實(shí)驗(yàn)研究Adrx對(duì)TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響，證實(shí)它在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附中的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)和人原代單核細(xì)胞株購(gòu)自Lonza Walkersville公司，人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株(THP-1)購(gòu)自ATCC公司。

1.2 試劑TNF-α、KH67熒光染色試劑盒、抗Flag、Adrx和β-actin多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，Total RNA Kit購(gòu)自O(shè)mega公司。Reverse Transcription Kit購(gòu)自Applied Biosystems公司。SYBR熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自ABI公司。VCAM-1和ICAM-1多克隆抗體、羊抗鼠和羊抗兔二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)細(xì)胞。采用電穿孔方式將Flag-Adrx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組分別為Vector+PBS組,Flag-Adrx+PBS組，Vector+TNF-α組，F(xiàn)lag-Adrx+TNF-α組。用PBS或TNF-α(10 μg·L-1)處理HUVEC細(xì)胞8 h，用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)VCAM-1和 ICAM-1 mRNA和蛋白水平。

2.3 細(xì)胞粘附分析按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)單核細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞粘附。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和學(xué)生t-test，比較組間差異。

3 結(jié)果

3.1 過(guò)表達(dá)Adrx對(duì)TNF-α誘導(dǎo)VCAM-1和 ICAM-1表達(dá)的影響與Vector+PBS組比較，Vector+TNF-α組VCAM-1和ICAM-1 mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.01)；與Vector+TNF-α組比較，F(xiàn)lag-Adrx+TNF-α組VCAM-1和ICAM-1 mRNA和蛋白水平下調(diào)(P<0.01)。

3.2 過(guò)表達(dá)Adrx對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的影響Vector+PBS組與Flag-Adrx+PBS組比較，HUVEC細(xì)胞粘附的單核細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。與Vector+PBS組比較，Vector+TNF-α組HUVEC細(xì)胞粘附的單核細(xì)胞數(shù)量增加；與Vector+TNF-α組相比，F(xiàn)lag-Adrx+TNF-α組粘附單核細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(P<0.01)。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是發(fā)生在血管壁的慢性炎癥病變，與心血管疾病密切相關(guān)[4]。促炎細(xì)胞因子TNF-α參與血管內(nèi)皮炎癥損傷[5]。它誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)，使得單核細(xì)胞粘附并遷移至內(nèi)膜下，促進(jìn)局部炎癥與粥樣硬化斑塊發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)Adrx對(duì)TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響，探討其在內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Adrx抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)，同時(shí)HUVEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附數(shù)量明顯減少。Adrx具有與PRDXs和TRXs相似的氨基酸序列[1]。PRDXs 和TRXs負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)、抑制免疫細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，從而發(fā)揮抗炎作用[2-3]。本研究證實(shí)，Adrx下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)、抑制TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附，表明它可能在血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用。