楊 玉，吳貴員，黃 慧，陳 卡，熊 婷

(江西省兒童醫(yī)院、南昌大學(xué)附屬兒童醫(yī)院a.內(nèi)分泌遺傳代謝科;b.中心實(shí)驗(yàn)室，南昌330006)

線粒體糖尿病(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)是一組由于線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化系統(tǒng)功能障礙引起的臨床異質(zhì)性疾病，屬于特殊類型糖尿病，線粒體DNA MT-TL1基因m.3243A>G突變是其最常見的原因，因其具有母系遺傳特征且多伴耳聾故又稱為母系遺傳糖尿病伴耳聾(maternally inherited diabetes and deafness，MIDD)[1]。多系統(tǒng)損害是MDM的臨床特征[2]，通常包括腦、肝臟、骨骼肌、內(nèi)分泌腺和心臟在內(nèi)的依賴能量高的器官都會受到影響。本文通過以下標(biāo)準(zhǔn)篩選線粒體糖尿病家系，分析家系成員臨床表型特征及基因突變情況，為臨床早期診斷以及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例篩查

對江西省兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科2016年1月至2019年12月收治的161例糖尿病患兒進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：1)按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]確診為糖尿病[3]；2)年齡<16歲；3)合并多系統(tǒng)損傷(多系統(tǒng)是指等于或大于3個系統(tǒng))；4)具有明顯的母系遺傳特征。本研究經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)，征得患兒監(jiān)護(hù)人及其他家系成員知情同意。

1.2 先證者病例資料

161例糖尿病患兒中篩查出疑似母系遺傳糖尿病家系1例。先證者，女，13歲8個月，反復(fù)尿糖、尿蛋白陽性1周入院?，F(xiàn)病史：患兒近13年生長緩慢，生長速率不詳。運(yùn)動和智力發(fā)育落后，無聽力、嗅覺障礙，無其他慢性疾病等，多次尿常規(guī)提示“尿糖、尿蛋白陽性”。精神可，食納欠佳，睡眠好，大小便正常。既往史：12歲時因闌尾炎行闌尾切除術(shù)，曾有“外陰炎”病史，眼科體檢異常(具體不詳)。個人史：G2P1，胎齡30周，剖宮產(chǎn)，無產(chǎn)時缺氧窒息史。出生體重2 kg，身長不詳，人工喂養(yǎng)，生長發(fā)育較同齡兒落后，2年前初潮。家族史：父親健康，母親、外婆、舅舅均患糖尿病，外公、阿姨、妹妹目前身體健康，均否認(rèn)近親結(jié)婚。

體格檢查：身高135 cm(-3.9SDS，SDS：標(biāo)準(zhǔn)偏差分?jǐn)?shù))，坐高72 cm，體重29 kg(-2.58SDS)，BMI15.9 kg·m-2，血壓102/65 mmHg(1 mmHg=1.33 kPa)。身材勻稱，皮膚偏黑，無水腫，雙上臂及背部毳毛多(F-G評分6分)，后發(fā)際線低，心、肺、腹部、脊柱、四肢無異常，腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)征(-)，雙乳房B4，腋毛A1，陰毛PH1。

輔助檢查：24 h尿蛋白86 mg·24 h-1(3.2 mg·24 h-1)，尿微量白蛋白58.06 mg·L-1(0～30 mg·L-1)，葡萄糖口服耐量試驗(yàn)2 h血糖 9.29 mmol·L-1(<11.1 mmol·L-1)，HbA1c 5.50%，谷氨酸脫羧酶抗體和抗人胰島素抗體陰性。血?dú)夥治鎏崾敬x性酸中毒，血乳酸 4.5 mmol·L-1↑(正常值0.7～2.1 mmol·L-1)，血氨 38 μmol·L-1(正常值18～72 μmol·L-1)。血常規(guī)、肝腎功能、血脂、甲功五項(xiàng)、皮質(zhì)醇、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3均正常。性激素：黃體生成素(LH)9.90 mU·mL-1，卵泡刺激素(FSH)5.32 mU·mL-1，孕酮(P)0.29 ng·mL-1，雌二醇(E2)249.74 pg·mL-1，泌乳素(PRL)12.33 ng·mL-1，睪酮(T)42.08 ng·dL-1。血串聯(lián)質(zhì)譜正常。染色體：46，XX。腹部彩超未及明顯異常。骨齡(G-P法)：10歲。心電圖正常。

1.3 家系其他成員的病史資料

先證者外公，男，72歲，身高165 cm(-1.26SDS)，體重63 kg(+0.22SDS)，BMI 23.2 kg·m-2，有高血壓病史，在予以降血壓藥物治療(具體藥物不詳)。

先證者外婆，女，70歲，身高144 cm(-3SDS)，體重34 kg(-3.2SDS)，BMI 16.5 kg·m-2。58歲出現(xiàn)雙側(cè)聽力障礙，伴左側(cè)偏盲，65歲診斷糖尿病，偶有左側(cè)偏頭痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測有乳酸酸中毒，現(xiàn)予以口服降糖藥(具體藥物不詳)治療，血糖控制良好。

先證者舅舅，男，40歲，身高156 cm(-2.7SDS)，體重37.7 kg(-3.05SDS)，BMI 15.5 kg·m-2。28歲診斷糖尿病，30歲出現(xiàn)雙側(cè)耳鳴、聽力下降和雙眼視力減低，晨起經(jīng)常神志恍惚，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測有乳酸酸中毒，現(xiàn)予以胰島素皮下注射治療，血糖控制良好。

先證者阿姨，女，36歲，身高152 cm(-1.59SDS)，體重40 kg(-2SDS)，BMI 17.3 kg·m-2，目前身體健康。

先證者父親，男，42歲，身高170 cm(-0.44SDS)，體重67.3 kg(+0.5SDS)，BMI 23.3 kg·m-2，目前身體健康。

先證者母親，女，35歲，身高148 cm(-2.3SDS)，體重34 kg(-3.1SDS)，BMI 15.6 kg·m-2。20歲診斷糖尿病，26歲出現(xiàn)雙側(cè)聽力障礙，伴雙側(cè)視力下降，平時經(jīng)常有中上腹疼痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測有乳酸酸中毒，現(xiàn)予以胰島素皮下注射治療，血糖控制良好。

先證者妹妹，女，12歲，身高136 cm(-2.56SDS)，體重30 kg(-1.3SDS)，BMI 16.2 kg·m-2，智力落后，學(xué)習(xí)能力成績差，余無不適。

1.4 線粒體DNA MT-TL1基因檢測

采集先證者及其家系成員的外周血3 mL。按照試劑盒說明書提取DNA(北京，TIANGEN)，設(shè)計(jì)MT-TL1 3243位點(diǎn)篩查引物：mtDNA3243-F1：5′-TTGGATCAGGACATCCCGATGGTGCAG-3′，mtDNA3243-R1：5′-GTTTTAGGGGCTCTTTGGTGAAGAGT-3′，配制20 μL PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、退火 1 min、72 ℃ 1 min、35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物適量加入提前配置好的2%瓊脂糖凝膠，置于電泳槽中，120 V恒壓電泳30 min后，攝像并觀察電泳條帶。

ApaⅠ酶切PCR產(chǎn)物鑒定家系成員MT-TL1基因m.3243A>G點(diǎn)突變。取所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物各50 μL，送上海生工基因公司檢測MT-TL1基因。

2 結(jié)果

2.1 ApaⅠ酶切電泳結(jié)果

線粒體基因PCR產(chǎn)物經(jīng)ApaI酶切后，含有m.3243A>G點(diǎn)突變的基因會被切成兩條片段，在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯影兩條帶，而不含該位點(diǎn)突變的野生型基因不會被酶切，在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯影一條帶。如圖1所示，先證者及其外婆、舅舅，母親、小姨、妹妹的線粒體基因提示存在突變。

0:未酶切；1：酶切后；a：舅舅；b：父親；c：母親；d：妹妹；e：外公；f：外婆；g：小姨；h：先證者。

2.2 基因測序結(jié)果

先證者及其外婆、舅舅、小姨和母親存在MT-TL1基因m.3243A>G點(diǎn)突變(圖2紅箭頭所示)。

有線粒體3243A>G點(diǎn)突變：Ⅰ2為先證者外婆，Ⅱ1為先證者舅舅，Ⅱ2為先證者小姨，Ⅱ3為先證者母親，Ⅲ1為先證者；無線粒體3243A>G點(diǎn)突變：Ⅰ1為先證者外公，Ⅱ4為先證者父親，Ⅲ2為先證者妹妹。

2.3 該家系成員的主要臨床特征

該家系共3代，母系成員有6人，4人患病，分別為先證者及其外婆、舅舅、母親。先證者Ⅲ1診斷為糖耐量受損；其外婆、舅舅、母親診斷為糖尿病。

主要臨床特征為身材矮小5人(83.3%)，聽力障礙3人(50%)，視力受損4人(66.7%)，智力落后2人(33.6%)，乳酸酸中毒4人(66.7%)；其他表現(xiàn)為腎臟損傷、胃腸道癥狀、偏頭痛、運(yùn)動發(fā)育落后、腎臟損傷、間斷性神志不清各1人。詳見表1。

表1 該家系6位母系成員主要臨床特征

2.4 家系圖譜

該家系圖譜如圖3，顯示先證者家系具有明顯的母系遺傳特征，三代人中共有5人攜帶突變基因，4人發(fā)病。

圖3 家系圖譜

3 討論

MDM即MIDD屬于線粒體疾病，它是由線粒體DNA(mtDNA)基因突變引起的一類疾病，最常見突變類型為m.3243A>G 點(diǎn)突變。由于基因突變，線粒體氧化磷酸化基因的翻譯過程出現(xiàn)異常，造成ATP合成減少；突變致高毒性O(shè)H-物質(zhì)增多，引起DNA破壞，都可能是致病的原因[4]，最終發(fā)生相關(guān)的多種臨床表型。

3.1 MDM的臨床特征

MDM的臨床特征有：1)呈母系遺傳特征，女性患者子代幾乎都攜帶此突變基因，但不一定都患病，男性患者后代一般不攜帶此突變基因；2)糖尿病發(fā)病年齡大部分在40歲之前，大部分發(fā)病于成年期，青少年發(fā)病少見；3)大多數(shù)患者的體形正?；蚱?，平均BMI小于20 kg·m-2[5]；4)胰島自身抗體檢測大部分為陰性；5)糖代謝異常合并多系統(tǒng)損傷表現(xiàn)，如身材矮小、聽力異常、視力下降、腎病、肌病、線粒體腦肌病、心肌病等[6]。

身材矮小在線粒體疾病患者中很常見[7]，下丘腦-垂體軸功能障礙被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制，已有報(bào)道證實(shí)生長激素治療能夠有效地改善一些患者的身高且沒有明顯不良反應(yīng)。在患者中，有75%是感覺神經(jīng)性聽力損失[8]，其機(jī)制是由于ATP生成減少可能導(dǎo)致紋狀血管內(nèi)離子濃度失衡和細(xì)胞死亡，從而造成聲音傳導(dǎo)減少。最常見眼科特征是典型的黃斑部視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良[9]，大多數(shù)黃斑疾病患者都呈現(xiàn)糖尿病病史>5年且年齡>40歲，有人認(rèn)為該癥狀是由于多元醇途徑降低了葡萄糖代謝，異常的葡萄糖耐量增加了色素性視網(wǎng)膜病變的臨床表達(dá)?；颊叩耐砥谀I功能衰竭患病率很高，甚至可能是m.3243 A>G點(diǎn)突變的唯一表現(xiàn)[10]?；颊叩募〔⊥ǔ＠奂八闹思∪?，表現(xiàn)為運(yùn)動引起的肌肉痙攣或無力[11]。神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患病率為10%～27%，而且大部分都是軸突感覺運(yùn)動神經(jīng)病[12]。已報(bào)道的精神疾病，包括反復(fù)發(fā)作的嚴(yán)重抑郁癥、精神分裂癥和各種恐懼癥。胃腸道不適也非常常見，尤其是便秘和假性阻塞[13]，且已證明在這些患者的胃體黏膜中積累了更高水平的m.3243A>G點(diǎn)突變[14]。本研究可見該家系先證者目前主要臨床特征為糖耐量受損、身材矮小、視力受損、智力發(fā)育落后、乳酸酸中毒和腎臟損傷等，雖暫無聽力異常的表現(xiàn)，但需定期監(jiān)測聽力情況；先證者外婆、母親以及舅舅表現(xiàn)有糖尿病、聽力下降及視力受損等，可見該家系的主要表現(xiàn)符合該病的臨床特征。

3.2 MDM的診斷

隨著二代測序技術(shù)的成熟和普及，線粒體基因組測序和異質(zhì)性分析容易進(jìn)行。血液來源的DNA已被廣泛用作多種常見mtDNA突變(例如m.3243A>G點(diǎn)突變)的篩選和診斷工具。但血液中的白細(xì)胞異質(zhì)性低，特別是隨年齡增加異質(zhì)性更低，容易出現(xiàn)假陰性。與血液白細(xì)胞相比，尿中脫落細(xì)胞mtDNA的異質(zhì)分析準(zhǔn)確性更高。肌肉通常具有最高的異質(zhì)水平，但在臨床工作中較難取樣[15]?？谇火つぜ?xì)胞更易于進(jìn)行基因診斷，因?yàn)樗鼈円子诓蓸樱⑶遗c血液相比通常具有高于30%～50%的異質(zhì)性值[16]。因此，選擇合適的檢測樣本對線粒體疾病的診斷至關(guān)重要，當(dāng)臨床考慮線粒體糖尿病時，可采用不同樣本進(jìn)行檢測以提高檢出率。該研究通過采集家系成員的血液樣本進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)先證者及其外婆、母親、舅舅、阿姨均攜帶m.3243A>G點(diǎn)突變，雖然先證者妹妹基因檢測結(jié)果為陰性，但可能由于樣本的異質(zhì)性表現(xiàn)為假陰性，故后期可采集不同樣本進(jìn)行再分析。

3.3 MDM的治療

線粒體糖尿病的降血糖治療應(yīng)個體化，包括一般治療：盡量避免誘發(fā)因素，如感染、過度勞累等；飲食上可不必太嚴(yán)格限制；還可進(jìn)行抗性訓(xùn)練和耐力訓(xùn)練等。藥物治療：1)降糖藥物治療，應(yīng)避免使用二甲雙胍藥物治療[17]；磺脲類藥物及近年來上市的新型降糖藥物可用于控制線粒體糖尿病的血糖[18]。2)針對其他系統(tǒng)的藥物治療以及線粒體功能的藥物治療。此外，目前還有一些基因治療的方法，但仍待進(jìn)一步的研究。同時，線粒體糖尿病家系的遺傳咨詢也非常重要，這有助于無癥狀患者得到早期的診斷和并發(fā)癥的預(yù)防。本研究家系成員中有2人使用胰島素進(jìn)行治療，1人口服降糖藥物治療，先證者目前診斷為糖耐量受損，暫未使用藥物治療。

通過本研究，發(fā)現(xiàn)母系遺傳線粒體糖尿病家系1例。該家系成員的主要表現(xiàn)為身材矮小、聽力障礙、視力受損、智力落后合并乳酸酸中毒，符合該病的臨床特征。經(jīng)線粒體基因測序證實(shí)，該家系成員中有5人攜帶線粒體基因MT-TL1 3243A>G點(diǎn)突變，分別為先證者及其外婆、舅舅、小姨和母親；共4人發(fā)病，分別為先證者及其外婆、舅舅和母親，說明即使攜帶突變基因，但不一定患病。雖然本研究Ⅲ2基因檢測結(jié)果為陰性，但鑒于不同樣本的異質(zhì)性不同，血液樣本檢測結(jié)果可能呈現(xiàn)假陰性。該家系成員的治療主要是口服降糖藥及胰島素注射進(jìn)行降糖治療，先證者目前診斷糖耐量受損，故暫未予藥物治療，但需要密切監(jiān)測。

綜上可見，通過詳細(xì)分析糖尿病患者的臨床特征、體格檢查、家族遺傳病史，并結(jié)合線粒體基因檢測，能夠?yàn)榫€粒體糖尿病的診斷及個體化治療提供依據(jù)，從而延緩并發(fā)癥的發(fā)生。