李佳容，繆順莉，趙舷宏，鄧海霞，陳更新

(廣州中醫(yī)藥大學a.第二臨床醫(yī)學院，廣州 510405；b.第二附屬醫(yī)院脾胃病科，廣州 510120)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是指源于胃十二指腸區(qū)域的，以餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛或上腹燒灼感為特征癥狀，且經檢查排除可引起這些癥狀的器質性、全身性或代謝性疾病的臨床癥候群，是臨床常見的功能性胃腸疾病[1]。據流行病學研究[2]報道，FD的全球綜合患病率為21.8%。因其病情反復的特點，FD對患者的生活質量及社會經濟造成了較大的影響[3]。FD的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為可能與胃腸運動功能障礙、胃腸激素異常、內臟高敏感性、精神心理因素、幽門螺桿菌感染及飲食等相關[4]。治療上，西醫(yī)以抑酸、促胃腸動力、根除幽門螺桿菌、調節(jié)飲食等對癥治療為主，雖有一定療效，但復發(fā)率高[5]。

根據FD的癥狀表現，將其歸屬于中醫(yī)學“痞滿”“胃脘痛”“積滯”等范疇，祖國醫(yī)學在治療FD上也展現出了不良反應小、療效顯著的優(yōu)勢[6]。木香-砂仁是《古今名醫(yī)方論》中香砂六君子湯的經典藥對，二藥相配行三焦之滯氣，暢脘腹之膹郁，臨床上此二者常用于治療脘腹脹滿、食積不消等癥?，F代眾多醫(yī)家認為，FD患者以脾胃氣虛型者居多，治療上多以健脾理氣為主，常用方劑有香砂六君子湯、香砂平胃散等[7]。木香-砂仁作為香砂六君子湯等方劑中的重要藥對，在治療功能性消化不良中發(fā)揮關鍵作用[8]?，F代藥理研究[9]提示，木香不僅具有促進胃動力作用，還可以發(fā)揮抗病原微生物的作用，例如抑制幽門螺桿菌的生長。砂仁也被證實有助于促進胃排空和胃蠕動[10]。目前關于木香-砂仁藥對治療功能性消化不良分子機制的相關研究較少，需進一步探索木香-砂仁藥對發(fā)揮作用的物質，從系統(tǒng)的角度了解其作用機制。

網絡藥理學通過多學科的交叉應用和整體生物網絡的分析與再整合，可以揭示藥物與作用靶點間的相互關系，闡釋中藥活性成分間協同作用的機制[11]。在計算機模擬藥物設計的過程中，分子對接逐漸發(fā)展為一種重要手段。分子對接技術主要用于研究配體與受體間的相互作用，預測其結合方式及親合力的一種理論模擬方法[12]。本研究通過網絡藥理學的方法探討木香-砂仁藥對治療功能性消化不良的作用機制，構建“單位藥-活性成分-作用靶點”網絡，并進行通路富集分析；運用分子對接軟件對化合物、靶點進行分子對接，探討活性成分與靶蛋白的結合能力和結合模式，為臨床應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 木香-砂仁藥對相關信息的收集與整理

木香、砂仁的藥物成分信息從TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)、ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)數據庫中檢索獲得。TCMSP以OB(口服生物利用度)≥20%和DL(類藥性)≥0.10作為篩選原則獲取中藥化學成分；整合從ETCM、TCMID中獲得的藥物活性成分信息，同時獲取成分對應的PubChem CID，去除重復項。并根據已發(fā)表的文獻補充化合物。最后，再通過是否滿足類藥性五原則對收集到的所有成分進行篩選得到最終結果。將符合條件的化合物通過PubChem(https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫進行確證，得到其對應的SMILES。把從PubChem數據庫中獲得的化合物SMILES導入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫中進行交叉驗證，將物種設置為人類，檢索出化合物的潛在靶點信息。

1.2 疾病靶點的獲取

與FD相關的人類基因從OMIM(https://www.omim.org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)在線數據平臺中得到。以“functional dyspepsia”“dyspepsia”“gastrointestinal disorders”“indigestion”作為關鍵詞，在3個數據庫中分別進行檢索及篩選。最后將GeneCards數據庫中Relevance score≥20的納入此次研究，整合3個數據庫的信息，去除重復基因和假基因，得到與FD相關的靶點信息。

1.3 獲取木香-砂仁藥對和FD的交集靶點

使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)線上作圖工具，將藥物潛在靶點和疾病相關靶點導入該平臺，進行匹配和映射，并繪制韋恩圖，獲得兩者的交集靶點。

1.4 構建蛋白相互作用網絡

將“1.3”中得到的交集靶點數據輸入string數據庫(https://string-db.org/)，將研究物種設置為人類，獲得交集靶點的蛋白相互作用關系，把結果以TSV文件導出。將所得數據導入Cytoscape軟件進行可視化，設置節(jié)點大小對應degree的大小，獲得最終的蛋白相互作用網絡。

1.5 構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡

整理交集靶點、藥物活性成分和藥物之間的關系，把信息匯總生成網絡圖準備文件，其中包括節(jié)點間的關系文件和節(jié)點屬性文件，將它們導入Cytoscape中，構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖，并對該網絡進行拓撲學分析。

1.6 關鍵靶點基因本體(GO)富集分析和基因相互作用(KEGG)通路分析

利用Bioconductor平臺(http://www.bioconductor.org)和R語言對交集基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集結果包括生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)、細胞組分(cellular component)3個部分，將各部分中P值排名最小的前10個terms繪制柱狀圖展示結果。通路富集分析，以P<0.05作為篩選條件，將P值排名最小的前20條結果通過氣泡圖進行可視化。

1.7 潛在活性成分-靶蛋白分子對接

為了進一步驗證靶點預測結果的可靠性，了解活性成分與靶蛋白的結合方式，對“藥物-活性成分-作用靶點”網絡中degree值排名較高的化合物及部分靶點進行分子對接驗證。通過PubChem(https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得化合物的3D結構的SDF文件，通過OpenBabel3.0軟件將其轉換為mol2文件格式。通過sailvina2.0軟件將化合物批量進行加氫、加電荷、能量最小化等處理，并保存為pdbqt格式文件。通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)找到相應靶點的PDB ID，并下載pdb文件，運用Pymol2.5軟件對靶蛋白進行去水、提取化合物等處理，通過插件獲取對接盒子參數，保存為pdb后綴的文件。運用AutodockTools軟件給靶蛋白加氫、加電荷，轉成pdbqt文件。使用Vina對化合物和靶蛋白進行對接。結合能<0 kcal·mol-1說明可以自發(fā)結合，結合能的負絕對值越大，說明配體與受體的對接親合力越大，同時也說明小分子與受體結合的活性越高。把對接結果較好的靶蛋白和化合物通過Pymol進行結合方式展現。

2 結果

2.1 木香砂仁藥對的活性成分和潛在靶點

通過搜索及篩選得到木香活性成分72個，砂仁43個；木香活性成分作用的潛在靶點320個，砂仁185個。

2.2 木香砂仁藥對和FD的交集靶點

匯總檢索結果后，GeneCards數據庫以Relevance score≥20為篩選原則可獲得782個與FD相關基因；OMIM數據庫獲得635個；TTD數據庫獲得4個。將3個數據庫信息進行整合去重，最終得到1355個疾病相關基因。將木香(MX)-砂仁(SR)藥對潛在作用靶點和功能性消化不良(Disease)的相關靶點進行匹配映射，最終得到37個交集靶點，制成韋恩圖(圖1)。

圖1 木香-砂仁藥對與疾病靶點交集韋恩圖

2.3 蛋白互作網絡的構建及分析

將藥物疾病交集的37個靶點信息輸入到string數據庫中進行分析，剔除掉在網絡中的孤立靶點，最終納入34個蛋白，并獲得它們的相互作用關系，利用Cytoscape軟件繪制蛋白互作網絡圖(圖2)。圖中共涉及節(jié)點34個，邊115條。節(jié)點的大小代表degree值，節(jié)點越大，degree越大。其中度值排名前15的蛋白為NR3C1、PTGS2、EGFR、DRD2、ESR1、AR、SLC6A4、CYP19A1、PIK3CA、DRD4、ACHE、CNR1、F2、MAOA、GABRB2，表明這些蛋白在網絡中的地位重要。

圖2 交集靶點的蛋白互作網絡

2.4 “藥物-活性成分-作用靶點”網絡構建與分析

將兩味藥物、活性成分、作用靶點導入Cytoscape軟件，構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡(圖3)。該圖有148個節(jié)點，包括活性成分111個，靶點34個，以及538條邊。從圖中可看到木香-砂仁藥對中存在不同化合物作用于同一靶點的現象，這體現了中藥多成分多靶點之間協同作用的機制。網絡中節(jié)點的大小表示度值，由圖可知，度值排名前15位的靶點分別是CYP19A1、AR、PTGS2、ACHE、CYP17A1、F2、ESR1、SLC6A4、DRD2、ESR2、EGFR、SLC6A2、NR3C2、HMOX1、FLT3，為網絡中的關鍵節(jié)點。作用于上述部分靶點的成分，在網絡中也有較高的度值，如quercetin(槲皮素)、Ambrosin(豚草素)、Stigmasterol(豆甾醇)、Santamarine(裂葉苣莢萊內酯)等，其中，豆甾醇是木香、砂仁的共同成分。以上說明這些靶點和成分可能在木香-砂仁藥對治療FD的過程中發(fā)揮了重要的作用。

圖中節(jié)點大小代表degree值，degree值越大，節(jié)點越大。其中，藍色圓形節(jié)點表示靶點，棕色方形節(jié)點表示木香化合物，綠色菱形節(jié)點表示砂仁化合物，黃色四邊形節(jié)點表示木香砂仁共同的化合物，淺綠色三角形表示砂仁，橙色三角形表示木香。

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

通過R軟件進行功能富集分析，并將生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)各取P值最小的前十條結果繪制柱狀圖(圖4)。

圖4 交集靶點的GO分析柱狀圖

KEGG通路富集分析結果，并將P值排名最小的20條通路可視化(圖5)。其中涉及到神經活性配體-受體相互作用、泌乳素信號通路、尼古丁成癮、5-羥色胺能突觸、GABA能突觸、嗎啡成癮、可卡因成癮、多巴胺能突觸、內分泌抵抗、卵巢類固醇生成、雌激素信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等信號通路。木香-砂仁藥對很可能通過這些通路對功能性消化不良發(fā)揮作用。

圖5 交集靶點KEGG富集分析的前20條通路

2.6 活性成分-靶蛋白分子對接分析

一般認為，配體與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。根據網絡圖拓撲值結果，將槲皮素(PubChem CID：5280343)、豚草素(PubChem CID：92119)、豆甾醇(PubChem CID：5280794)、裂葉苣莢萊內酯(PubChem CID：188297)這4個成分和ACHE(PDBID：4EY5)、CYP19A1(PDBID：5JKW)、EGFR(PDBID：2RGP)、PTGS2(PDBID：5KIR)、DRD2(PDBID：6CM4)、ESR1(PDBID：1ERR)、ESR2(PDBID：1X7B)、NR3C1(PDBID：6EL6)這8個靶蛋白進行分子對接。結果發(fā)現，這4種化合物與8個靶蛋白的結合能均<0 kcal·mol-1，說明活性成分化合物與篩選出來的靶點發(fā)生作用的可能性較大，驗證了預測結果的可靠性，見表1。最后，將每個蛋白質與化合物對接分數最佳的結合方式用PYMOL進行展示，見圖6。

表1 木香-砂仁藥對活性化合物與部分靶點分子對接的結合能 kcal·mol-1

A：ACHE與槲皮素結合方式；B：CYP19A1與豆甾醇結合方式；C：EGFR與豆甾醇結合方式；D：PTGS2與槲皮素結合方式；E：DRD2與豆甾醇結合方式；F：ESR1與槲皮素結合方式；G：ESR2與裂葉苣莢萊內酯結合方式；H：NR3C1與槲皮素結合方式。

3 討論

近年來越來越多的研究認為FD是一種身心疾病，FD患者常合并焦慮、抑郁情緒，可見精神、心理因素在FD的發(fā)生發(fā)展及轉歸中具有重要作用[13]。中醫(yī)認為，本病的發(fā)病部位在胃，與肝脾密切相關，肝郁和脾虛是發(fā)病的關鍵病機，在治療方面，當以疏肝健脾理氣為法，木香砂仁兩藥合用，共奏疏肝健脾、行氣寬中、溫中止痛之效。

根據“藥物-活性成分-作用靶點”網絡、PPI網絡及分子對接結果，發(fā)現NR3C1、PTGS2、ACHE、ESR1、ESR2、CYP19A1等在網絡中具有重要的地位，推測木香-砂仁藥對可能通過這些靶點起到治療FD的作用。下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)作為神經內分泌免疫網絡的樞紐，在中樞神經系統(tǒng)對胃腸道運動功能的調控中意義重大，其不僅能維持人體內環(huán)境的穩(wěn)定，還能對外界環(huán)境的刺激作出應答，在應激中發(fā)揮著重要作用[14]。有研究[15]發(fā)現，應激可引起HPA軸的活動異常，導致胃內蛋白酶及激素等分泌紊亂，進而誘發(fā)消化系統(tǒng)炎性反應、免疫應答以及腸神經系統(tǒng)重塑，使內臟處于高動力狀態(tài)，這是患者產生長時間疼痛等不適癥狀的原因之一。NR3C1是糖皮質激素受體，主要參與應激時誘導的腎上腺分泌糖皮質激素的HPA軸的負反饋調節(jié)。據報道[16]，當患者處于長期抑郁或其他慢性應激狀態(tài)時，下丘腦及垂體NR3C1表達下降，導致HPA軸的負反饋機制失調，從而影響胃腸運動。因此推測木香-砂仁藥對可能通過影響NR3C1，調節(jié)糖皮質激素分泌，調控HPA軸進而發(fā)揮治療FD的作用。此外，有研究[17-18]發(fā)現，FD患者的胃十二指腸黏膜存在多種炎性細胞浸潤，與黏膜屏障功能受損相關。VANORMELINGEN等[19]通過動物實驗發(fā)現，存在胃腸道黏膜炎癥反應的大鼠，其胃底肌肉松弛能力減弱，胃容受性功能受損，這提示炎癥與FD的發(fā)病機制有重要關聯。PTSG2(COX2)是一種在細胞內外刺激作用下激活，參與組織炎癥過程及細胞的分化增殖過程的誘導酶，抑制PTGS2的活性可以減少前列腺素E2的生成，進而起到抗炎作用[20]。ESR1、ESR2是雌激素受體的2個亞型，存在于大多數組織中，并且在胃底胃竇以及十二指腸等消化系統(tǒng)組織、免疫系統(tǒng)的細胞中也可以被檢測到，這提示ESR1、ESR2可能具有潛在的調節(jié)胃腸道的功能的效果[21]。有研究[22]發(fā)現，在胃腸道炎癥性疾病中，ESR1、ESR2受體具有幾乎相同的DNA結合域，都通過與相同的內質網反應元件結合激活轉錄，并且都能拮抗NF-κB功能活性，進而發(fā)揮抗炎作用。CYP19A1是雄激素轉化為雌激素的關鍵限速酶，會直接影響人體內雌激素的水平，而雌激素可以通過作用于神經內分泌細胞和胃腸神經顯著抑制胃排空，改變胃動力及節(jié)律，還可抑制胃酸分泌[23]。但目前國內尚未有研究提示CYP19A1與FD之間存在直接關聯，這可能可以成為未來的研究方向。乙酰膽堿(ACH)是一種存在于胃腸道興奮神經元中的胃腸動力興奮性遞質，可以促進胃及十二指腸運動、加速胃排空，對胃腸平滑肌的收縮起著重要作用。ACH從突觸前神經元釋放到突觸間隙，與乙酰膽堿受體結合，影響胃運動或被乙酰膽堿酯酶(ACHE)滅活，現代西醫(yī)治療FD胃腸運動障礙使用的藥物如依托必利、新斯的明等就是乙酰膽堿酯酶抑制劑，這說明胃動力可以通過抑制ACHE活性來調節(jié)[24]。因此本研究推測，木香-砂仁藥對可能通過作用于ACHE、ESR1、ESR2等靶點，通過調節(jié)胃腸道的運動改善FD的癥狀進而發(fā)揮治療作用。

GO分析結果提示，大多數靶點富集到的重要生物學過程主要涉及對激素刺激的反應、神經系統(tǒng)過程等，總體而言，基因本體分析得到的生物學過程條目與炎癥、免疫以及神經遞質水平調節(jié)有密切聯系。通過對靶點的KEGG通路富集發(fā)現，前20條通路與神經調節(jié)、免疫炎癥、內分泌調節(jié)等相關。其中，內分泌抵抗、雌激素信號通路值得引起關注，通過上文可知雌激素會影響胃腸功能，流行病學報告顯示，女性在FD方面有更高的患病率[2]。孕產婦以及圍絕經期女性因體內雌激素水平波動較大，較容易出現功能性消化不良的臨床癥狀，這更加說明雌激素與FD之間存在聯系。此外，雌激素可調節(jié)多種神經遞質如5-羥色胺(5-HT)等，而且與抑郁情緒、情感障礙之間也有復雜的關聯，而抑郁情緒可以通過腦腸肽等神經遞質影響植物神經系統(tǒng)功能，不僅導致消化液的分泌異常，還會干擾消化系統(tǒng)的動力[23]。這也進一步提示，木香-砂仁藥對可能通過作用于雌激素信號通路及內分泌抵抗信號通路發(fā)揮治療FD的作用。通路富集結果中的5-羥色胺能突觸、GABA能突觸、神經活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮等通路與抑郁障礙密切相關，而FD患者經常合并有精神心理異常，抑郁情緒、應激狀態(tài)等又會反向加重臨床癥狀[25]。由此推測木香-砂仁藥對可能通過作用于以上通路，改善患者的情緒及精神狀態(tài)，起到治療FD的效果。

本研究通過網絡藥理學和分子對接技術對木香-砂仁藥對治療FD的潛在物質基礎和分子機制、作用通路進行了探討，體現了其多成分、多靶點、多途徑治療的特點，為進一步深入探究木香-砂仁藥對的藥理作用機制提供了新思路，但其結果仍需后續(xù)的基礎研究進行驗證。