張偉東 徐 陽 鄭 路 蔣 溶 周子娟 王靖宇 董建一

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，大連 116044)(2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，大連 116044)(3. 大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，大連 116044)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病[1]，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉及黏液膿血便，同時可合并包括腸道狹窄、中毒性巨結(jié)腸、穿孔、出血等。近些年來，全球IBD發(fā)病率不斷提高[2]，據(jù)Dubinsky等[3]統(tǒng)計，全球已超過680萬患者患有IBD，中國患病率也不斷提高，該病給患者帶來極大負(fù)擔(dān)。目前，大多學(xué)者認(rèn)為該病與遺傳因素[4]、環(huán)境因素[5]、免疫失衡和腸道微生態(tài)[6]有關(guān)，但具體病因尚未清楚。研究表明腸道菌群在IBD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，正常人體的腸道菌群主要包括：厚壁菌門(Furmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)等。其中厚壁菌門和擬桿菌門是共生菌群的主要成員，在健康組中含量最多。Zheng等[7]研究顯示，IBD患者腸道菌群出現(xiàn)明顯菌群多樣性紊亂，表現(xiàn)為有害菌群如擬桿菌門明顯增加，有益菌如厚壁菌門明顯降低。柚皮苷(Naringin,NG)是葡萄柚皮中含量最豐富的天然黃酮類化合物[8]。Yu等[10]報道，NG不僅具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗應(yīng)激等生物活性，還具有抗菌作用。本研究證實NG顯著影響IBD小鼠模型的腸道菌群，并通過PCR-DGGE技術(shù)對菌群進(jìn)行了分析，探究其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：15只SPF級C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自遼寧長生生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(遼)2015-0001。實驗動物飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可號：SYXK(遼)2018-0007。小鼠隨機分為正常組(對照組)、模型組(IBD模型組)和NG組(NG藥物干預(yù)組)，每組5只。正常組：正常飲水；其余兩組自由飲用4%(m/v)DSS水溶液7 d，建立IBD模型；NG組小鼠在自由飲用4%(m/v)DSS水溶液的第2天灌胃給予劑量為40 mg/kg的NG水溶液，1 mL/只，連續(xù)灌喂7 d。第9天處死，留取結(jié)腸及腸內(nèi)容物。本研究涉及實驗已通過大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批，審批號：AEE20046。

1.1.2試劑與儀器：NG(北京索萊寶科技有限公司，HPLC≥98%，貨號 SN8030)；柳氮黃吡啶(SASP，天津金耀集團(tuán)有限公司)；硫酸葡聚糖鈉(DSS，大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號 MB5535)；磷酸化核因子-κB-p65(p-NF-κB-p65)抗體和GAPDH抗體(萬類生物科技有限公司)，Bcl-2抗體(Abcam，貨號 ab59348)；E.Z.N.A.? Stool DNA kit(Omega，貨號 D4015)；RIPA 裂解液和Bradford 蛋白濃度試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；2×Easytaq PCR SuperMix(+dye)和通用引物515F和806R[寶生物工程(大連)有限公司，貨號 AS111-14]；引物序列為: 515F (5′-3′): GTGCCAGCMGCCGCGGT AA；806R (5′-3′): GGACTACNNGGGTAT CTAAT。主要儀器：Gel DocTM EZ 成像儀(Bio-RAD)，紫外分光光度計(Nanodrop2000)。

1.2 方法

1.2.1IBD活動程度觀察評估：每天記錄小鼠體質(zhì)量、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、飲水量、采食量，并收集新鮮糞便，加入糞便DNA保護(hù)劑于-80 ℃冰箱保存。按表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病活動指數(shù)(DAI)評分。小鼠處死后，沿腹正中線剖開小鼠腹腔，分離盲腸至直腸全段結(jié)腸，測量長度，并進(jìn)行拍照，觀察炎癥損傷狀況。使用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗腸內(nèi)容物后統(tǒng)一取同一部位1 cm左右遠(yuǎn)端結(jié)腸組織固定于4%甲醛中、石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察，并拍照分析結(jié)腸的病理學(xué)變化(見圖2)。

表1 疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2DNA提取、擴增與檢測：嚴(yán)格遵循E.Z.N.A.?Stool DNA kit試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取操作。用PCR擴增腸道菌群多樣性，并用16s rDNA基因V3區(qū)特異序列進(jìn)行PCR-DGGE分析。引物序列為：上游引物(338F)CGCCCG GGGCGC GCCCC GGGCGG GGCGGG GGCACG GGGGGC CTACGG GAGGCA GCAG和下游引物(518R)ATTACCGCGGCTGCTGG。反應(yīng)體系總體積為50 μL：包括25 μL 2×Easytaq PCR SuperMix(+dye)，1 μL 338F(10 pmol/μL)，1 μL 518R (10 pmol/μL)，3 μL DNA模板和20 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：93 ℃持續(xù)預(yù)熱，93 ℃變性5 min，93 ℃、30 s，54.5 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30次持續(xù)循環(huán)，72 ℃、5 min，4 ℃、10 min。反應(yīng)完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并保存在-20 ℃下備用。

1.2.3免疫印跡檢測：從實驗小鼠分離結(jié)腸組織，并立即保存在液氮中?？偟鞍滋崛≡噭┖?KeyGen Biotech)分離總蛋白。Western blot實驗將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，并在4°C輕輕搖動下，用相應(yīng)的抗體孵育過夜，洗膜后二抗37 ℃孵育2 h，使用多光譜成像系統(tǒng)(UVP)檢測和定量條帶。

1.2.4變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)：嚴(yán)格按操作步驟配膠、灌膠、點樣、電泳、染色和凝膠成像進(jìn)行分析，凝膠切割后回收純化并測序得到序列后與NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 疾病癥狀及疾病活動程度

各組小鼠體質(zhì)量變化如圖1A所示：對照組小鼠一般情況表現(xiàn)良好，無明顯變化。模型組小鼠精神活動欠佳，反應(yīng)不靈活，采用4%DSS誘導(dǎo)的動物均在第3天出現(xiàn)腹瀉、血便現(xiàn)象。第3天開始，模型組小鼠體質(zhì)量的變化和正常組比較，明顯下降(P<0.01，t=5.21)，第7天起差異最為顯著(P<0.05，t=12.89)。NG組小鼠在造模后第3天，體質(zhì)量和正常組相比明顯降低(P<0.05，t=7.61)；第6天時，小鼠體質(zhì)量與模型組相比，顯著回升(P<0.05，t=15.85)。各組小鼠DAI評分結(jié)果：第3天，與正常組相比，模型組和干預(yù)組給予4%DSS并自由飲水，小鼠DAI評分進(jìn)行性升高(aP<0.05，at=12.90；bP<0.05，bt=12.51)；與模型組相比，第6天NG組小鼠DAI評分顯著降低(abP<0.05，abt=15.85)，見表2及圖1B。這一結(jié)果說明，4%DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型第3天起癥狀顯著，而NG組小鼠IBD在NG的干預(yù)下得到緩解。

表2 DAI評分

圖1 各組小鼠疾病癥狀及疾病活動程度

2.2 結(jié)腸改變情況及HE染色

第9天，將小鼠處死，觀察結(jié)腸大體形態(tài)。正常組小鼠結(jié)腸外觀光滑、彈性好及腸內(nèi)容物正常；其它兩組小鼠結(jié)腸明顯紅腫、腸黏膜可見有糜爛并腸腔內(nèi)容物伴有黏液膿血。結(jié)腸長度變化如圖1C～1D所示：與正常組相比，模型組結(jié)腸長度顯著縮短(P<0.0001，t=10.49)；與模型組相比，NG組結(jié)腸長度縮短得到了抑制(P=0.0057<0.001，t=3.74)。圖2所示：光鏡下可見，正常組小鼠結(jié)腸黏膜組織完好，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組黏膜組織嚴(yán)重破壞，原有結(jié)構(gòu)消失，并在黏膜層中存有大量炎性細(xì)胞浸潤。NG組黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤較輕，可見點狀黏膜侵蝕。

圖2 結(jié)腸HE染色

2.3 各組小鼠炎癥蛋白和凋亡蛋白的檢測

正常組和NG組小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較為完整，能夠清楚的看到腸上皮細(xì)胞的形態(tài)；模型組結(jié)腸組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象。與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中，p-NF-κB-p65蛋白水平顯著增加(P<0.01，t=4.52)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.01，t=5.826)。與NG組相比，模型組p-NF-κB-p65蛋白水平顯著減少(P<0.01，t=2.75)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.01，t=3.28)，見圖3A～3B。這一結(jié)果表明，DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠NF-κB炎性介質(zhì)生成增多及Bcl-2細(xì)胞凋亡水平顯著下降可能是與其惡化程度相關(guān)，NG組能夠抑制p-NF-κB-p65，促進(jìn)Bcl-2水平回升，對IBD有治療作用。

圖3 各組小鼠炎癥蛋白和凋亡蛋白的檢測

2.4 腸道菌群

細(xì)菌16s DNA V3區(qū)的PCR-DGGE電泳結(jié)果如圖4A所示，三組菌群豐富度無顯著差異。利用Quantity One對DGGE圖譜數(shù)字化處理，然后對各泳道條帶通過非加權(quán)成對算術(shù)平均算法(UPGMA)開展聚類分析。圖4B可見，模型組樣本4～5聚成一簇，正常組和NG組大致聚為一簇，模型組、對照組及NG組菌群結(jié)構(gòu)有差異。對三組小鼠PCR-DGGE圖譜中變化較大的條帶(圖4A箭頭所示)進(jìn)行切膠測序得出表3的結(jié)果：與正常組相比，模型組中HungatellahathewayiWAL-18680菌株含量增多；與模型組相比，NG組MarvinbryantiaformatexigensDSM 14469、PrevotellaoryzaeDSM 17970及HelicobacterpullorumMIT 98-5489含量增多；模型組Muribaculumintestinale相較于正常組和NG組含量增多。

表3 DGGE條帶切膠回收后測序比對結(jié)果

圖4 腸道菌群

3 討論

本研究探討了NG對小鼠IBD的作用及其機制。根據(jù)Li等[11]和Dong等[12]報道，NG作為中藥對多個系統(tǒng)有保護(hù)作用，并且對小鼠IBD有緩解作用。本研究證實，NG改善IBD細(xì)胞浸潤，抑制細(xì)胞凋亡，因此證實NG對DSS誘導(dǎo)的IBD具有治療作用。近年來，隨著對腸道菌群研究的認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)腸道菌群平衡對腸黏膜保護(hù)起著重要作用[13]。改善腸道菌群多樣性，減少腸道致病菌擬桿菌門、變形菌門等豐富度，增加隸屬于厚壁菌門的健康菌乳酸桿菌屬(Lactobaillus)等豐富度。基于此，通過PCR-DGGE技術(shù)檢測NG在DSS誘導(dǎo)小鼠IBD模型的腸道菌群的作用，結(jié)果顯示，模型組擬桿菌門致病菌Muribaculumintestinale相對于其他兩組明顯增多，MarvinbryantiaformatexigensDSM 14469隸屬于健康菌厚壁菌門，相較于模型組，飲用NG水溶液后，菌群豐富度明顯提高，這表明該化合物作為天然黃酮類化合物，具有抑制致病菌，促進(jìn)健康菌豐富度，進(jìn)而改善小鼠IBD，為臨床藥物研發(fā)以及IBD臨床治療提供新治療思路與科學(xué)參考。本研究發(fā)現(xiàn)NG對IBD腸道菌群變化的影響，但該化合物與菌群之間以及菌群與IBD之間作用機制尚未探索，未來將繼續(xù)探討菌群變化對IBD影響的具體機制，為IBD臨床治療貢獻(xiàn)力量。