張 曼 彭麗娜 高則發(fā) 徐汪節(jié) 王朝霞

(上海交通大學(xué)實驗動物中心，上海 200240)

隨著生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及實驗動物科學(xué)的發(fā)展，實驗動物的應(yīng)用范圍日益廣泛，且相關(guān)技術(shù)逐漸成為生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要支撐條件。實驗小鼠是生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究中最為重要的模式動物之一，其質(zhì)量優(yōu)劣可直接反映出科學(xué)實驗水平的高低。SPF級實驗動物是目前國際公認的健康實驗動物，用其進行科學(xué)研究可避免因疾病或病原微生物對實驗結(jié)果造成的影響[1-2]。

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》14922.2-2001，2001年實驗小鼠取消普通級，按其微生物學(xué)劃分為清潔級、SPF級和無菌級。如何凈化被微生物污染的實驗小鼠以盡快提高實驗動物微生物等級，成為研究較多的課題。生物凈化的方式有兩種：一種是剖宮產(chǎn)手術(shù)。醫(yī)學(xué)研究表明胎盤具有屏障作用，可阻止病原微生物入侵，切斷母仔縱向傳播疾病。采用無菌剖宮產(chǎn)手術(shù)，可阻斷非垂直傳播病原體對仔鼠的影響，也可保持原種群的特性，是小鼠進行生物凈化提高種群微生物級別最為簡單、有效的途徑[3-6]；另外一種生物凈化方式是體外受精-胚胎移植。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，體外受精(IVF)和胚胎移植技術(shù)廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物、生物凈化等諸多領(lǐng)域[7-8]。由于其成本高，更適用于因飼養(yǎng)環(huán)境、自身生理條件或年齡因素導(dǎo)致的雄性繁殖障礙小鼠的擴繁及品系保種或感染可通過胎盤垂直傳播的病原微生物的轉(zhuǎn)基因小鼠的生物凈化。實驗動物剖宮產(chǎn)代乳的凈化方法在悉生動物的培育和維持中發(fā)揮重要的作用，是小動物進行生物凈化維持種群微生物級別簡單、經(jīng)濟且有效的方法。在實際工作中，上述兩種生物凈化方式可以相輔相成、互為補充。

因科研需要，學(xué)校每年引進的實驗小鼠模型種類繁多、來源復(fù)雜且微生物等級參差不齊。為了阻止病原體通過這類小鼠傳染給飼養(yǎng)在屏障設(shè)施內(nèi)的其他動物，造成屏障內(nèi)動物的污染，根據(jù)學(xué)校IACUC要求，所有微生物等級不達標(biāo)的外來小鼠進入SPF級繁育房間必須經(jīng)過生物凈化。

本實驗采用剖宮產(chǎn)的方式，以本中心基因工程小鼠為研究對象，進行生物凈化。實驗中優(yōu)化實驗步驟，初步探討剖宮產(chǎn)技術(shù)在小鼠生物凈化中的應(yīng)用及提高其凈化效率的方法。

1 材料和方法

1.1 主要設(shè)備與試劑

高壓蒸汽滅菌器(上海一恒科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(HH-S26,金壇市大地自動化儀器廠)；生物安全柜(新加坡ESCO Class II BSC)；恒溫加熱臺(EH20B，北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；解剖剪、解剖鑷、組織剪、止血鉗、醫(yī)用紗布、棉簽、無菌傳遞盒、2%過氧乙酸、1%聚潔及無菌水。

1.2 實驗動物

本研究所用實驗動物為飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施(溫度：20～26℃，相對濕度：40%～70%，明暗交替12 h/12 h)，實驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2018-0028，隔離檢疫區(qū)隔離包內(nèi)經(jīng)蘇州西山生物技術(shù)有限公司檢測確認不符合SPF級標(biāo)準(zhǔn)，但不含有垂直傳播病原體需凈化的基因工程小鼠?；蚬こ绦∈?09只，來自上海交通大學(xué)相關(guān)課題組；代乳母鼠為飼養(yǎng)于本中心SPF屏障內(nèi)的ICR小鼠，71只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級，8周齡，25～30 g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。本實驗已通過上海交通大學(xué)福利倫理審查委員會審查，編號：A2017012。

1.3 實驗方法

1.3.1剖宮產(chǎn)時間 :待凈化小鼠1∶1合籠后，次日檢栓，見栓當(dāng)天標(biāo)記為0.5 d。從小鼠妊娠第17天開始，每天摸胎觸診，根據(jù)孕鼠子宮內(nèi)胎鼠的大小和胎頭的位置、羊水量、陰道口潮紅充血等綜合判定妊娠時間。當(dāng)胎鼠的頭部和軀干長度相似，且頭向下，孕鼠子宮內(nèi)羊水量減少，能夠清晰地摸到仔鼠的四肢且陰道口充血時作為剖宮產(chǎn)的最佳手術(shù)時間。

1.3.2剖腹產(chǎn)手術(shù):121 ℃、35 min高壓滅菌。術(shù)前準(zhǔn)備：剪刀、鑷子、止血鉗、滅菌紗布及醫(yī)用棉簽，分別配制體積為400 mL 的2%過氧乙酸消毒水和1%聚潔消毒水各一份，并放入電熱恒溫水浴鍋內(nèi)加熱到37 ℃。消毒水擦拭手術(shù)操作臺后，紫外燈照射時間不少于30 min，實驗室紫外消毒時間不少于2 h。手術(shù)過程：在生物安全柜內(nèi)采用頸椎脫臼的方法快速將待剖宮產(chǎn)母鼠處死后放入37 ℃、2%的過氧乙酸消毒水中浸泡8～10 s，取出置于解剖盤中，打開腹腔，暴露子宮，用無菌止血鉗夾住與陰道交界處的子宮頸口，快速剪斷子宮與陰道及子宮與卵巢連接處，將離體子宮先在37 ℃、1%的聚潔消毒水中浸泡3～5 s后在第二臺生物安全柜內(nèi)，將其轉(zhuǎn)入37 ℃無菌水中洗去子宮外表面的消毒水，放于37 ℃恒溫加熱臺的滅菌紗布上，吸干表面殘留水分。鈍性剝離子宮壁、卵黃囊和羊膜，取出胎鼠，然后用棉簽快速將仔鼠口鼻處及身上的羊水擦拭干凈，輕輕按摩心肺及四肢刺激其呼吸，待仔鼠能夠自主呼吸后，剪斷臍帶，放入無菌轉(zhuǎn)運盒中。

1.3.3代乳 :術(shù)前將代乳母鼠與仔鼠分開，將能夠正常呼吸的仔鼠由無菌傳遞盒中轉(zhuǎn)至代乳籠中，保留代乳母鼠的仔鼠2～3只，其余的全部淘汰。將代乳母鼠的尿液涂抹在剖宮產(chǎn)仔鼠身上或用代乳母鼠籠盒中的墊料撒在剖宮產(chǎn)仔鼠身上，使其沾染代乳母鼠的氣味，然后將代乳母鼠放回籠盒中，并觀察其代乳情況。確定代乳母鼠正常代乳后，將該母鼠所生的仔鼠全部淘汰。

1.3.4凈化后小鼠微生物學(xué)檢測：根據(jù)仔鼠的發(fā)育情況，21 d后離乳，并做好離乳記錄。根據(jù)國標(biāo)GB 14922.2—2011《實驗動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》要求，隨機從每籠剖宮產(chǎn)小鼠中抽取一只進行微生物檢測。

2 結(jié)果

2.1 剖宮產(chǎn)手術(shù)開始時間對仔鼠的影響

用手指觸摸胎鼠，以胎鼠頭朝下、能清晰辨別出四肢且頭部和軀干長度相似作為剖宮產(chǎn)手術(shù)開始的判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄為C；胎鼠軀體蜷曲或胎位向上時實施剖宮產(chǎn)手術(shù)，仔鼠帶有未吸收的羊水，體質(zhì)孱弱，早于標(biāo)準(zhǔn)點，記錄為C，詳細見表1。

表1 不同時間實施剖宮產(chǎn)手術(shù)對仔鼠的影響

2.2 代乳母鼠分娩后至開始代乳時間間隔對仔鼠的影響

選用分娩后不同時間間隔的母鼠進行代乳，觀察并記錄代乳仔鼠的成長情況，結(jié)果見表2。

表2 代乳母鼠分娩后至開始代乳不同時間的結(jié)果

2.3 剖宮產(chǎn)生物凈化結(jié)果

對近期完成的16個品系的小鼠剖宮產(chǎn)手術(shù)數(shù)據(jù)分析，剖宮產(chǎn)手術(shù)平均成功率為(97.9±8.25)%，仔鼠的平均離乳率為(88.6%±12.7)%，見表3。

表3 剖宮產(chǎn)手術(shù)結(jié)果

2.4 凈化后小鼠微生物學(xué)檢測

凈化后的小鼠在達到離乳天數(shù)時，從每窩剖宮產(chǎn)仔鼠中隨機抽取一只送蘇州西山生物技術(shù)有限公司進行SPF項目全檢。結(jié)果顯示，送檢小鼠中均未發(fā)現(xiàn)SPF級動物需排除的細菌：沙門氏菌(Salmonellosisspp.)、泰澤病原體(Tyzzer organism)、支原體(Mycoplasmaspp.)、鼠棒狀桿菌(Corynebacteriummurus)、嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，病毒：仙臺病毒(Sendai virus，SV)、鼠痘病毒(Mouse pox virus，MPV)、小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)、小鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice，PVM)、呼腸孤病毒(Mouse reovirus type 3，Reo-3)及小鼠細小病毒(Mouse parvovirus，MPV)，凈化后的小鼠全部符合SPF級要求。

3 討論

小鼠因其特殊的生理特性，妊娠周期短(18.5～19.5)d，分娩前24 h是胎鼠發(fā)育的旺盛期[9-10]，故剖宮產(chǎn)凈化中分娩期判斷準(zhǔn)確與否是手術(shù)成敗的關(guān)鍵之一。手術(shù)時間過早，則胎鼠可能尚未發(fā)育成熟，剖出的仔鼠無法自主呼吸，而時間過晚，孕鼠可能在術(shù)前已經(jīng)分娩，無法進行凈化操作。

單一的陰道檢栓方法很難準(zhǔn)確判斷孕鼠妊娠時間，也存在漏檢和假陽性的現(xiàn)象，并不能準(zhǔn)確判斷小鼠的分娩時間。作為觸摸胎鼠的輔助方法，根據(jù)陰道栓檢出的時間，在小鼠妊娠第17天，開始觸摸胎鼠，根據(jù)胎鼠的發(fā)育情況來判斷孕鼠分娩時間[11]，兩種方法相結(jié)合，不僅能夠顯著提高孕鼠分娩時間判斷的準(zhǔn)確性，而且提高剖宮產(chǎn)的手術(shù)成功率。觸摸胎鼠需具有熟練的觸診技術(shù)，避免因操作不當(dāng)對孕鼠造成應(yīng)激反應(yīng)或因判斷不準(zhǔn)確造成手術(shù)失敗。

實驗初期，經(jīng)驗不足，部分小鼠因基因改造或個體因素，導(dǎo)致胎鼠發(fā)育情況不一致，觸診時不能準(zhǔn)確判斷胎鼠發(fā)育情況。當(dāng)觸摸到胎鼠頭部朝下時即開始手術(shù)，此時剖出的部分仔鼠帶有未被吸收完全的羊水，這類仔鼠多為早產(chǎn)，發(fā)育不成熟，常為心肺復(fù)蘇時不能自主呼吸或后期代乳時不能正常哺乳而死亡。當(dāng)胎位轉(zhuǎn)向后，胎鼠頭部和軀干長度相似，四肢清晰可辨時進行手術(shù)，剖出的仔鼠發(fā)育成熟，心肺復(fù)蘇后小鼠很快可以自主呼吸，全身呈肉粉色，代乳結(jié)束后能夠正常繁殖。超過這一時期的孕鼠大都在術(shù)前自然分娩，個別小鼠因胎仔鼠少，胎兒個體過大而難產(chǎn)逾期，這類仔鼠如及時手術(shù)都可以成活。

另外，剖宮產(chǎn)手術(shù)操作時間的長短對仔鼠的成活也很重要，操作時間過長易發(fā)生仔鼠窒息或心肺復(fù)蘇失敗，一般從孕鼠處死到仔鼠取出時間控制在2～3 min內(nèi)，心肺復(fù)蘇到仔鼠可以自主呼吸控制在10～15 min。另外，新生仔鼠對溫度敏感，操作需在37 ℃恒溫臺上完成。心肺復(fù)蘇時動作要輕柔，避免因力度過大傷到仔鼠。

選擇母性較好的代乳母鼠，并在手術(shù)開始前將代乳母鼠與其親生仔鼠分開。實驗中選用代乳母鼠手術(shù)前24 h內(nèi)分娩的剖宮產(chǎn)仔鼠的窩離乳率為100%，術(shù)前分娩時間24～48 h的窩離乳率為95.65%，24 h內(nèi)和24～48 h之間代乳母鼠的窩離乳率差異不顯著(P>0.05)。實驗中也選用了分娩48 h以上的母鼠作為代乳鼠，最長時間間隔為5 d。與前兩組數(shù)據(jù)相比，可知隨著分娩后時間的延長，代乳母鼠的窩離乳率降低，代乳過程中拒絕哺乳或食仔的現(xiàn)象增加。為提高仔鼠的成活率，代乳母鼠最好選擇凈化小鼠手術(shù)前0～2 d內(nèi)自然分娩的為佳，最長不宜超過5 d。代乳母鼠開始代乳的第一周不換底籠，以免代乳母鼠受到驚嚇而出現(xiàn)食仔行為。為保證剖宮產(chǎn)仔鼠正常發(fā)育，代乳母鼠在孕期及代乳過程中，需補充營養(yǎng)。本實驗中為保證母鼠的營養(yǎng)，在代乳母鼠孕期及代乳過程中使用高繁飼料，并每周添加適量瓜子[12]。

剖宮產(chǎn)凈化是為阻斷母鼠攜帶的病原微生物傳染給后代，以通過手術(shù)的方法提高仔鼠的微生物級別，故手術(shù)環(huán)境要求無菌。手術(shù)中所用到的器械及材料必須經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，手術(shù)操作臺和實驗室需嚴格消毒，為避免交叉污染，手術(shù)操作在兩個生物安全柜中由不同人員合作完成，每做一例手術(shù)需更換一套無菌手術(shù)器械和器皿，且每次手術(shù)完成后都要用2%過氧乙酸對手術(shù)環(huán)境進行噴霧消毒。

綜上所述，通過陰道檢栓法推算剖宮產(chǎn)母鼠的預(yù)產(chǎn)期，結(jié)合觸診方法，準(zhǔn)確判斷剖宮產(chǎn)的時間，并優(yōu)化剖宮產(chǎn)手術(shù)中的各個環(huán)節(jié)，顯著提高剖宮產(chǎn)生物凈化的成功率，為提高基因工程小鼠的剖宮產(chǎn)生物凈化成功率奠定基礎(chǔ)。