詹冬梅 朱晨，2 周承哲，2 黃雪婷 賴鐘雄，2 郭玉瓊，2

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/茶產(chǎn)業(yè)研究院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

植物中存在大量輔轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其包含輔抑制因子和輔激活因子，能夠輔助控制植物基因表達(dá)、調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抵御不利環(huán)境影響［1-3］。Groucho/Thymidine uptake 1（Gro/Tup1）家族是其中一類重要的輔轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Gro/Tup1蛋白缺乏獨(dú)立與DNA結(jié)合能力，只能通過被轉(zhuǎn)錄因子招募來(lái)輔助調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［4］。Gro/Tup1包含兩個(gè)亞家族，分 別 為 TPL/TPR（TOPLESS/TOPLESS-related） 和LUG/LUH（LEUNIG/LEUNIG HOMOLOG）。兩個(gè)亞家族成員都具有N端富含谷氨酰胺的lissencephaly homology（LisH） 結(jié) 構(gòu) 域（PF08513） 和 C端 的WD40結(jié)構(gòu)域（PF00400），區(qū)別在于兩個(gè)家族成員的蛋白質(zhì)互作區(qū)域結(jié)構(gòu)不同，TPL/TPR具有CTLH結(jié)構(gòu)域（PF10607），而LUG/LUH結(jié)構(gòu)中央具有更多的谷氨酰胺（Q）富集區(qū)域（Q-rich）［5-7］。

目前，在擬南芥［8］、番茄［9］、玉米［10］等植物中已對(duì)Gro/Tup1家族基因進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明，在外源MeJA噴施處理下，玉米嫩枝ZmTPL3表達(dá)水平上調(diào)，ZmLUG2，ZmLUG5，ZmLUG6表達(dá)水平下調(diào)。在蛋白水平上同樣驗(yàn)證了Gro/Tup1家族參與多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如TPL蛋白亞型可與大多數(shù)Aux/IAA蛋白相互作用，在缺乏生長(zhǎng)素的情況下，AUX/IAA蛋白通過招募TPL來(lái)抑制生長(zhǎng)素應(yīng)答基因表達(dá)［11］。TPL通過與AFP蛋白相互作用參與ABA信號(hào)通路，而ABA與JA信號(hào)通路在干旱時(shí)協(xié)同抑制植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量［12］。TPL蛋白還可以與JAZ以及NINJA蛋白形成JAZ-NINJA-TPL蛋白復(fù)合物抑制JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的MYC2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)［13］，而LUH正向調(diào)控依賴于MYC2的JA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄［14］。大量研究表明Gro/Tup1參與植物應(yīng)激反應(yīng)，如擬南芥TPL相互作用組的研究表明，TPR3和TIR-NB-LRR SNC1蛋白之間相互作用，且TPL/TPR家族參與非生物脅迫響應(yīng)［15］。擬南芥lug突變體的全基因組轉(zhuǎn)錄組比較研究發(fā)現(xiàn)，一些非生物脅迫基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化［16］。HOS15、LUH和TPR1的相關(guān)研究也證明植物Gro/Tup1參與應(yīng)答鹽脅迫、滲透調(diào)節(jié)及凍害防御過程［17-19］。

由此可見，在基因水平和蛋白水平上都證明Gro/Tup1家族成員在植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)及抵御外界不良環(huán)境影響過程中都具有重要作用。茶樹（Camellia sinensis）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要作用［20］，隨著茶樹栽培面積的擴(kuò)大，由干旱、寒冷等環(huán)境脅迫引起的茶芽萌發(fā)遲、長(zhǎng)勢(shì)差，營(yíng)養(yǎng)積累困難等問題增加，導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降［21-22］。目前在茶樹中尚未見Gro/Tup1家族相關(guān)報(bào)道，而茶樹基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的發(fā)布有利于從全基因組水平對(duì)茶樹Gro/Tup1家族成員進(jìn)行鑒定分析［23-27］，基于茶樹基因組所進(jìn)行的基因家族鑒定的研究已有許多［28-29］。本研究利用茶樹基因組數(shù)據(jù)［30］，鑒定茶樹中所有的Gro/Tup1基因，明確在茶樹中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與進(jìn)化特征，通過實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）分析其在多種外源植物激素（MeJA，GA3和ABA）和非生物脅迫（干旱和低溫）處理下的表達(dá)模式，以期探究該基因家族成員在茶樹中的作用機(jī)制，同時(shí)為進(jìn)一步研究Gro/Tup1家族基因在茶樹激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年11月，以8年生盆栽鐵觀音茶樹為供試材料，置于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度70%、光暗周期為14 h/10 h的人工氣候箱中培養(yǎng)。隨后參考Zhou等［31］的方法，對(duì)茶樹進(jìn)行外源激素、低溫和干旱處理。在對(duì)照未處理、外源激素處理和低溫處理后的0、3、6、12、24 h分別收集茶樹第二葉位為試驗(yàn)材料。上述取樣進(jìn)行3次重復(fù)，所有處理樣品采集后迅速用液氮固樣，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待用。具體處理如下：

（1）激素處理：將若干盆茶樹分為4組，其中3組分別對(duì)茶樹葉片噴灑1 mmol/L MeJA、1 mmol/L GA3和100 μmol/L ABA新鮮制備的工作溶液，剩余一組不做處理，對(duì)照組。

（2）低溫處理：其他條件保持不變，將盆栽茶樹移入保持在4℃的人工氣候室中。

（3）干旱處理：若干盆栽茶樹分成4組，分別在正常供水（土壤水分含量為19.50%；CK）、輕度干旱脅迫（土壤水分=15.20%；T1）、中度干旱脅迫（土壤水分= 10.17%；T2）和重度干旱脅迫（土壤水分= 5.54%；T3）下培養(yǎng)10 d后，收集葉片。

1.2 方法

1.2.1 茶樹Gro/Tup1基因家族成員鑒定 在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù) TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥Gro/Tup1氨基酸序列，從TPIA（http：//tpia.teaplant.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載茶樹基因組數(shù)據(jù)。用已鑒定出的擬南芥Gro/Tup1氨基酸序列為種子序列，利用本地BLASTP對(duì)茶樹基因組進(jìn)行對(duì)比搜索（E-value≤ 10-5），得到候選茶樹Gro/Tup1成員氨基酸序列。利用HMMER 3.0軟件對(duì)Gro/Tup1在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能域（PF08513）隱馬可夫模型進(jìn)行鑒定。最后通 過 CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/St-ructure/cdd/wrpsb.cgi?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/） 驗(yàn) 證 候 選 蛋 白結(jié)構(gòu)域，以確定其含有LisH（PF08513）和WD40（PF00400）保守結(jié)構(gòu)域。利用Proparam（https：//www.expasy.org/）工具對(duì)茶樹Gro/Tup1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；通過WoLF PSORT Web網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 茶樹Gro/Tup1基因家族進(jìn)化分析 從phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥（Arabidopsis thalian）、番 茄（Solanum lycopersicum）、 水 稻（Oryza sativa）的Gro/Tup1氨基酸序列，從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（TPIA）下載茶樹Gro/Tup1氨基酸序列。利用ClustalW對(duì)上述物種和茶樹Gro/Tup1蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，通過MEGA X軟件構(gòu)建上述物種系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹構(gòu)建方法為鄰近法（neighbor-joining，NJ），校驗(yàn)參數(shù)為Bootstrap=1 000，并在iTOL網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行可視化處理。

1.2.3 茶樹Gro/Tup1基因家族結(jié)構(gòu)分析 利用MEGA X軟件構(gòu)建茶樹和擬南芥Gro/Tup1系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)同1.2.2；利用MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析茶樹Gro/Tup1家族成員的保守基序，基序數(shù)量設(shè)置為10；從TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載茶樹基因結(jié)構(gòu)注釋文件（GFF3）；最后通過TBtools軟件對(duì)Gro/Tup1系統(tǒng)進(jìn)化樹、基序分布以及內(nèi)含子-外顯子分布進(jìn)行可視化處理。

1.2.4 茶樹Gro/Tup1基因家族順式作用元件分析 通過Tbtools軟件提取茶樹Gro/Tup1家族成員起始密碼子上游2 000 bp的基因序列，利用啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtoo-ls/plantcare/html/）對(duì)其順式元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.5 茶樹Gro/Tup1基因家族表達(dá)分析 使用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司）提取樣品總RNA；使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit（上海翊圣生物科技有限公司）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；使用Primer Premier v6.0軟件設(shè)計(jì)Gro/Tup1的特異性引物，并使用DNAMAN 9軟件進(jìn)行驗(yàn)證，引物序列見表1。以CsSAND作為干旱處理組樣品的內(nèi)參基因，Csβ-actin作為低溫和激素處理組的內(nèi)參基因。利用LightCycler 480（Roche應(yīng)用科學(xué)公司）儀器進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司）試劑盒的方法，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。用2-△△Ct算法計(jì)算Gro/Tup1基因相對(duì)表達(dá)量。用EXCEL 2013、GraphPad Prism v6.01和SPSS v22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 茶樹Gro/Tup1基因家族鑒定

根據(jù)擬南芥Gro/Tup1蛋白的序列信息，在茶樹基因組中檢索并分析，最終獲得13個(gè)茶樹Gro/Tup1基因。通過CCD和Tbtools軟件對(duì)所獲得的蛋白序列進(jìn)行分析（圖1），所有的候選蛋白的N端都含有LisH結(jié)構(gòu)域，C末端含有WD40或WD40 superfamily結(jié)構(gòu)域，而CsTPL1-9在LisH結(jié)構(gòu)域后還含有CTLH。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的分布以及前人研究，將茶樹Gro/Tup1分為TPL/TPR和LUG/LUH兩個(gè)亞家族。

圖1 茶樹Gro/Tup1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布Fig. 1 Conserved domains of CsGro/Tup1 proteins in C. sinensis

根據(jù)scaffold 編號(hào)順序和結(jié)構(gòu)域組成，將其以CsLUG1-4、CsTPL1-9的方式進(jìn)行命名（表2）。分析表明，CsGro/Tup1氨基酸長(zhǎng)度在540-1 319aa，分子量在60.182-145.850 kD，等電點(diǎn)在6.08-8.17。其中CsTPL1、3、4、6和9共5種蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其余8種蛋白質(zhì)指數(shù)均大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。CsGro/Tup1家族蛋白均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsLUG1位于質(zhì)體，CsTPL6位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，CsTPL4和CsTPL8位于葉綠體中，其余的9種蛋白質(zhì)均位于細(xì)胞核，推測(cè)Gro/Tup1家族蛋白主要分布于茶樹細(xì)胞核中。

表2 茶樹Gro/Tup1蛋白質(zhì)序列特征Table 2 Feature of CsGro/Tup1 protein in C. sinensis

2.2 茶樹Gro/Tup1家族進(jìn)化及結(jié)構(gòu)分析

為了解Gro/Tup1蛋白在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA X軟件對(duì)茶樹（13）、擬南芥（12）、番茄（17）以及水稻（11）中共53個(gè)Gro/Tup1氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2）。結(jié)果表明53個(gè)Gro/Tup1成員被分成兩組：TPL/TPR和LUG/LUH兩個(gè)亞家族。雙子葉植物茶樹、擬南芥及番茄的大部分Gro/Tup1成員聚在同一分支上，單子葉植物水稻的Gro/Tup1大部分成員單獨(dú)聚為一個(gè)小分支。其中單子葉植物中未鑒定到TPL/TPR成員，僅有11個(gè)LUG/LUH成員；雙子葉植物中TPL/TPR成員數(shù)量多于LUG/LUH，如擬南芥具有9個(gè)TPL/TPR，3個(gè) LUG/LUH， 番 茄 具 有 10個(gè) TPL/TPR，7個(gè)LUG/LUH，茶樹具有9個(gè)TPL/TPR，3個(gè)LUG/LUH。與玉米Gro/Tup1基因家族研究一致，雙子葉植物的TPL/TPR成員數(shù)量多于LUG/LUH，單子葉植物反之［10］。

圖2 茶樹、擬南芥、番茄和水稻Gro/Tup1蛋白的進(jìn)化關(guān)系與分類Fig. 2 Phylogenetic relationships and classification of Gro/Tup1 proteins from C. sinensis，A. thaliana，S. lycopersicum，and O. sativa

為進(jìn)一步分析Gro/Tup1家族成員進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA X軟件構(gòu)建13條茶樹Gro/Tup1蛋白和12條擬南芥Gro/Tup1蛋白的進(jìn)化樹（圖3-A），結(jié)果顯示，茶樹與擬南芥的Gro/Tup1蛋白都存在3個(gè)分支，茶樹中CsLUG1-4為一支，CsTPL4和5為一支，剩余CsTPL成員為一支。通過在線軟件MEME分析茶樹Gro/Tup1蛋白序列的10個(gè)基序（圖3-B）發(fā)現(xiàn)，motif 8和10是其中較為典型的保守基序，存在于大部分Gro/Tup1家族成員和全部LUG/LUH亞家族中。在TPL/TPR亞家族中，motif 1-10均較為保守，但CsTPL4和CsTPL5的保守基序與其他CsTPL成員差異大。CsTPL4和CsTPL5的氨基酸長(zhǎng)度更短，CsTPL4只具有motif 1、5、8和10，CsTPL5只具有motif 8。綜上，推測(cè)LUG/LUH和TPL/TPR兩個(gè)亞家族的作用功能可能不同，CsTPL4和CsTPL5蛋白可能功能不同于其它CsTPL/TPR蛋白。

基因結(jié)構(gòu)與植物的進(jìn)化關(guān)系密切，為進(jìn)一步了解Gro/Tup1基因特征，對(duì)其外顯子及內(nèi)含子長(zhǎng)度和數(shù)量進(jìn)行分析。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（圖3-C）結(jié)果表明，擬南芥Gro/Tup1基因長(zhǎng)度在5 000 bp左右，與擬南芥相比，茶樹Gro/Tup1長(zhǎng)度更長(zhǎng)，其基因長(zhǎng)度最短的為CsTPL2，除比AtTPL5略短些，都長(zhǎng)于剩余擬南芥Gro/Tup1。茶樹Gro/Tup1家族成員的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量差異很大，外顯子數(shù)量從6個(gè)到30個(gè)不等。與茶樹TPL/TPR亞家族相比，LUG/LUH亞家族成員間外顯子數(shù)量差異較小，在16-19個(gè)之間，說明LUG/LUH亞家族在基因結(jié)構(gòu)上比TPL/TPR亞家族更保守。

圖3 茶樹和擬南芥的Gro/Tup1Fig. 3 Gro/Tup1 in C. sinensis and A. thaliana

利用在線軟件STRING v10.5將所有茶樹Gro/Tup1蛋白與擬南芥的同源序列進(jìn)行比對(duì)，建立Gro/Tup1蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4）。結(jié)果表明，擬南芥中CsLUG1、2與LUH同源；CsLUG3、4與LUG同源；CsTPL1、2、9與WSIP2同源；CsTPL3與TPL同源；CsTPL6、7、8與T21F11.18同源。其中，WSIP2與LUG、LUH，TPL與LUH、LUG之間存在較強(qiáng)的互作，它們可能共同表達(dá)或形成蛋白復(fù)合體以輔助抑制或激活靶基因的表達(dá)。

圖4 Gro/Tup1蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 Interaction network of Gro/Tup1 proteins

2.3 茶樹Gro/Tup1啟動(dòng)子順式作用元件分析

為進(jìn)一步分析茶樹Gro/Tup1家族成員潛在的應(yīng)答機(jī)制，使用在線軟件 PlantCARE預(yù)測(cè)茶樹Gro/Tup1基因起始密碼子上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，結(jié)果表明，其啟動(dòng)子區(qū)域富集大量與植物激素響應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（圖5）。茶樹Gro/Tup1基因中具有10種植物激素響應(yīng)元件（CGTCA-motif、ABRE、TGACG-motif、P-box、TATC-box、TCA-element、GARE-motif、TGA-element、TGA-box和AuxRR-core），其數(shù)量和種類最多；5種脅迫響應(yīng)元件（LTR、ARE、GC-motif、MBS 和 WUN-motif）；3種植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件（Circadian、MSA-like和CAT-box）；2種次生代謝相關(guān)元件（MBSI和CCAAT-box）。其中 CGTCA-motif 和 TGACG-motif元件與JA響應(yīng)有關(guān)，P-box、TATC-box和GARE-motif元件與GA響應(yīng)有關(guān)，ABRE元件與ABA響應(yīng)有關(guān)，MBS元件與干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)，LTR元件與低溫響應(yīng)相關(guān)。所有Gro/Tup1基因都響應(yīng)激素或脅迫中的一個(gè)或多個(gè)，推測(cè)可能在激素響應(yīng)和脅迫應(yīng)對(duì)方面的作用更為突出。

圖5 茶樹Gro/Tup1啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)Fig. 5 Prediction of the cis-acting regulatory elements in the promoters of CsGro/Tup1

2.4 茶樹Gro/Tup1在不同組織中表達(dá)模式

為進(jìn)一步了解茶樹Gro/Tup1家族成員在茶樹不同組織的表達(dá)模式，對(duì)‘鐵觀音’不同組織部位（根、莖、花、果、頂芽、幼葉、成熟葉和老葉）的茶樹Gro/Tup1成員表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果（圖6）表明，大部分Gro/Tup1家族成員在葉組織上表達(dá)量較高，不同成熟度葉組織成員表達(dá)水平有所差異；在根組織上表達(dá)水平較低。具體如下：除CsLUG1、CsTPL6和CsTPL9外，其余基因均在成熟葉與老葉高表達(dá)；CsLUG4、CsTPL2、CsTPL3、CsTPL4、CsTPL5 和CsTPL7在幼葉表達(dá)量較高；CsLUG2和CsLUG3在頂芽較高表達(dá)；CsLUG2、CsTPL2、CsTPL6和CsTPL9在 果 上 較 高 表 達(dá) ；CsLUG1、CsLUG2、CsLUG3、CsTPL3、CsTPL4和CsTPL8在花上表達(dá)水平較高；CsLUG1、CsTPL1和CsTPL6在莖部位上較高表達(dá)。

圖6 Gro/Tup1家族成員在‘鐵觀音’組織部位的表達(dá)譜Fig.6 Expression profiles of CsGro/Tup1 family genes in the tissues of ‘Tieguanyin’ cultivar

2.5 茶樹Gro/Tup1在外源激素處理和非生物脅迫下表達(dá)模式

基于順式作用元件預(yù)測(cè)分析，通過實(shí)時(shí)熒光定量分析茶樹Gro/Tup1在干旱、低溫、GA3、ABA和MeJA處理下相對(duì)表達(dá)量（圖7），結(jié)果表明茶樹Gro/Tup1在不同處理下呈多種表達(dá)模式。

圖7 干旱、低溫、GA3、ABA和MeJA處理下茶樹Gro/Tup1相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Expression pattens of CsGro/Tup1 in C. sinensis under drought，cold，GA3，ABA，MeJA treatment

干旱處理下，CsLUG3和CsLUG4表達(dá)水平在重度干旱時(shí)（T3）上調(diào)，而CsTPL2表達(dá)水平在干旱時(shí)受到抑制，CsTPL8和CsTPL9相對(duì)表達(dá)量穩(wěn)定，不受干旱調(diào)控。在低溫（4℃）處理下，CsTPL1的表達(dá)水平穩(wěn)定，不受低溫調(diào)控，CsTPL8和CsTPL9基因表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到峰值。

外源GA3處理下，CsLUG1基因表達(dá)量最高，與CsLUG3、CsTPL1、CsTPL2、CsTPL8基因都呈上調(diào)趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到峰值。外源ABA處理下，CsLUG1基因表達(dá)水平最高，與CsTPL1、CsTPL8、CsTPL9均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)趨勢(shì)。外源MeJA處理下，CsLUG1、CsLUG3、CsLUG4、CsTPL1、CsTPL3、CsTPL5、CsTPL8和CsTPL9基因表達(dá)均受到極顯著抑制。

3 討論

3.1 茶樹Gro/Tup1家族的進(jìn)化特征

Gro/Tup1是茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一類重要的輔轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多重要環(huán)節(jié)，從而響應(yīng)逆境脅迫。本研究在茶樹基因組中鑒定出13個(gè)Gro/Tup1基因家族成員，在系統(tǒng)進(jìn)化分類中，茶樹Gro/Tup1家族成員被劃分為兩個(gè)亞家族，與擬南芥［8］和番茄［9］的研究結(jié)果一致，與玉米研究結(jié)果有所不同，它將LUG/LUH亞家族細(xì)分為L(zhǎng)UG/LUH和LUG/LUH-like，并認(rèn)為L(zhǎng)UG/LUH-like可能具有與LUG/LUH蛋白行使不同功能［10］。值得注意的是，茶樹的CsTPL4和CsTPL5在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與TPL/TPR成員分離，聚在另一個(gè)小分支，其保守基序和基因結(jié)構(gòu)也與其余Gro/Tup1成員存在顯著差異。CsTPL4缺少motif 3和motif 6，外顯子數(shù)目最少且布局分散，CsTPL5缺少motif 1、motif 3、motif 5和 motif 6，外顯子布局分散。蛋白互作預(yù)測(cè)結(jié)果表明，茶樹中CsTPL4和CsTPL5分別與AT5G43920和SMU1同源，這兩個(gè)蛋白與其他蛋白不存在互作關(guān)系，推測(cè)CsTPL4和CsTPL5蛋白質(zhì)在茶樹中的作用可能與其余Gro/Tup1成員作用不同。前人研究表明基因功能發(fā)生分化和產(chǎn)生新功能基因的主要原因是基因復(fù)制，包括全基因復(fù)制、片段復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制以及轉(zhuǎn)座復(fù)制［32］，CsTPL4和CsTPL5是否具有不同功能以及功能分化的原因是否與其基因復(fù)制相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。CsTPL8和CsTPL9的外顯子數(shù)量都為26個(gè)，CsTPL8和CsTPL9的氨基酸長(zhǎng)度相近，基序構(gòu)成及分布都極其相似，氨基酸序列相似度為72.98%，其啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)結(jié)果表明兩者響應(yīng)元件類型與數(shù)量相近，最后發(fā)現(xiàn)CsTPL8和CsTPL9在干旱處理、脫落酸和茉莉酸甲酯分別處理下的表達(dá)模式類似，據(jù)此推測(cè)兩者可能存在功能冗余。

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)單位，也是功能單位，即功能區(qū)域。在本研究中，所有的Gro/Tup1都與擬南芥中的一致，具有保守的N端LisH結(jié)構(gòu)域，高度保守的C端WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域以及相對(duì)保守性差的中間結(jié)構(gòu)域。每個(gè)WD40域是由40個(gè)氨基酸殘基組成，序列一定間隔會(huì)特征性出現(xiàn)一個(gè)色氨酸（W）和天冬氨酸（D）殘基，該重復(fù)序列能夠介導(dǎo)Gro/Tup1與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用［33］。LisH主要是促進(jìn)蛋白質(zhì)之間相互作用，能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)二聚化［34］。LUG是植物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Gro/Tup1成員，除上述特點(diǎn)外，它有一個(gè)LUFS結(jié)構(gòu)域，其內(nèi)含LisH基序。LUFS結(jié)構(gòu)域是LUG/LUH蛋白與接頭蛋白SEUSS相互作用被招募到轉(zhuǎn)錄因子的必需結(jié)構(gòu)域，此外它還能夠與轉(zhuǎn)錄因子YABBY直接作用［35］。TPL/TPR是Gro/Tup1的另一個(gè)亞家族，具有TPD結(jié)構(gòu)域，其包含了LisH和CTLH位點(diǎn)，該結(jié)構(gòu)域是其與轉(zhuǎn)錄因子WUS相互作用位點(diǎn)，是通過組蛋白脫乙?；瘜?shí)現(xiàn)的［7］。此外，TPL的TPD結(jié)構(gòu)域能夠與接頭蛋白NINJA的EAR基序相互作用，與JAZ轉(zhuǎn)錄因子共同作用抑制JA靶標(biāo)基因表達(dá)［13，36-37］。

通常，真核蛋白編碼基因序列都具有內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)含子是基因內(nèi)部不編碼區(qū)域，不出現(xiàn)在成熟mRNA中［38］。過去內(nèi)含子常常被認(rèn)為是 “垃圾序列”，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子是分子進(jìn)化過程中不可或缺的推動(dòng)者，是基因表達(dá)中的調(diào)控者［39］。研究表明在整個(gè)基因組水平上，內(nèi)含子數(shù)量和內(nèi)含子長(zhǎng)度均與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，在內(nèi)含子數(shù)目極少（不超過5個(gè)）和內(nèi)含子長(zhǎng)度較短的情況下，二者與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)，內(nèi)含子過多、過長(zhǎng)會(huì)造成轉(zhuǎn)錄能量浪費(fèi)，只有在內(nèi)含子數(shù)量和長(zhǎng)度適中時(shí)才最有利于基因表達(dá)［40］。在進(jìn)化過程中，外顯子是較為穩(wěn)定，而內(nèi)含子的序列和長(zhǎng)度是迅速隨機(jī)突變的，對(duì)于種群量相當(dāng)大的物種來(lái)說，其內(nèi)含子數(shù)量是在進(jìn)化過程中經(jīng)過優(yōu)化，其基因內(nèi)含子數(shù)目變化大。Gro/Tup1家族廣泛存在于真菌、動(dòng)物和植物中，是一個(gè)古老的基因家族，其基因的結(jié)構(gòu)差異大。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，茶樹Gro/Tup1的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性，主要表現(xiàn)在內(nèi)含子數(shù)量差異很大，從5個(gè)到29個(gè)不等。LUG/LUH亞家族成員平均內(nèi)含子數(shù)目為16.25，數(shù)量最少的為15（CsLUG3）， 最 多 的 為 18（CsLUG3）；TPL/TPR亞家族成員平均內(nèi)含子數(shù)目為20.34，數(shù)量最少為5（CsTPL4），數(shù)量最多為29（CsTPL3）。表明茶樹Gro/Tup1家族成員基因結(jié)構(gòu)多樣化，能夠使茶樹在遭受不利環(huán)境影響時(shí)做出高效有利的反應(yīng)，使其存活下來(lái)。

3.2 茶樹Gro/Tup1家族成員響應(yīng)外源激素及非生物脅迫

基因轉(zhuǎn)錄往往受到精細(xì)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件上的結(jié)合位點(diǎn)作用而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率。啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，茶樹Gro/Tup1家族成員的表達(dá)受多種激素及逆境脅迫調(diào)控，其在MeJA、ABA、GA3響應(yīng)及干旱和低溫下的表達(dá)模式，證實(shí)茶樹中Gro/Tup1參與激素響應(yīng)，與茶樹的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。在MeJA處理下茶樹Gro/Tup1基因表達(dá)水平均顯著被抑制，與玉米研究中嫩梢的ZmLUG2、ZmLUG5和ZmLUG6表達(dá)在JA處理后下調(diào)［10］結(jié)果類似。前人研究表明，Gro/Tup1蛋白的兩個(gè)亞家族分別在茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的不同階段起到不同的作用。在靜息階段，JAZ蛋白招募輔抑制因子TPL，繼而和NINJA共同形成三元復(fù)合物抑制JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中轉(zhuǎn)錄因子myelocytomatosis2（MYC2）靶基因的表達(dá)；在激活階段，LUH通過Q-rich域與MED25蛋白相互作用，從而將LUH和HAC1招募到MYC2靶基因啟動(dòng)子上，該過程中LUH能夠促進(jìn)MED25和HAC1相互作用以及MED25和MYC2相互作用，最后激活MYC2靶基因表達(dá)，即 JA 應(yīng)答基因表達(dá)［13-14，41］。GA3處理的Gro/Tup1基因表達(dá)水平均在12 h和24 h顯著上調(diào)，ABA處理的Gro/Tup1基因表達(dá)水平均在3 h和6 h顯著上調(diào)，MeJA處理的Gro/Tup1基因表達(dá)水平均顯著被抑制，表明Gro/Tup1基因能夠應(yīng)答GA3、ABA和MeJA，對(duì)ABA和JA應(yīng)答更快。

非生物脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量穩(wěn)定的主要威脅，許多植物研究表明Gro/Tup1家族成員參與了許多非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)，例如擬南芥的LUH和HOS15已被證明分別參與鹽、凍害防御［17-18］，玉米中TPL和LUG都對(duì)干旱和低溫進(jìn)行應(yīng)答［10］。在本研究中，茶樹Gro/Tup1家族成員在干旱和低溫處理下的表達(dá)量均表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。CsLUG3和CsLUG4基因表達(dá)量均在重度干旱（T3）時(shí)顯著上調(diào)，TPL2表達(dá)水平則顯著被抑制，表明LUG和TPL基因?qū)Ω珊荡碳さ膽?yīng)答模式不同。在低溫處理下，CsTPL2和CsTPL3基因表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)TPL基因是應(yīng)答低溫刺激的主要基因，且與應(yīng)答干旱時(shí)的表達(dá)模式相反。這意味著這些基因的蛋白在茶樹抗旱及抵御低溫方面發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

Gro/Tup1基因家族在進(jìn)化上是保守的，其中個(gè)別基因如CsTPL4和CsTPL5可能在進(jìn)化過程中發(fā)展出不同的功能，CsTPL8和CsTPL9的功能冗余，其具體功能有待進(jìn)一步研究。同其他植物一樣，茶樹Gro/Tup1家族成員能夠響應(yīng)非生物脅迫及外源激素，其基因應(yīng)答呈現(xiàn)不同表達(dá)譜，表明不同脅迫下Gro/Tup1基因應(yīng)答方式不同，其具體生物學(xué)功能有待一進(jìn)步研究。