王歡禹 常昊宛 章崇祺 金衛(wèi)林 魏芳

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

嵌合抗原受體T細(xì)胞治療（chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR T cell therapy）是目前較為有效的腫瘤免疫治療方法，主要是通過(guò)慢病毒等方式改造病人外周血中分離的T細(xì)胞，獲得表達(dá)特異性嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的T細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的特異性治療［1］。嵌合抗原受體是將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）的單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv）、跨細(xì)胞膜錨定序列以及T細(xì)胞的活化序列在體外進(jìn)行基因重組而成的人工融合基因。它能夠?qū)⒖贵w對(duì)腫瘤抗原的高親和性和T淋巴細(xì)胞的殺傷機(jī)制相結(jié)合，使其能特異性地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞［2］。與T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）不同，CAR可以不依賴于主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的識(shí)別，高度特異性地靶向抗原［3］。迄今為止，CAR T細(xì)胞在血液惡性腫瘤的治療療效顯著。2017年8月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)使用靶向CD19的CAR（Kymriah）治療小兒復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）；同年10月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了另一種靶向CD19的CAR（Yescarta）用于治療成人復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤。此外，歐洲藥品管理局（EMA）也于2018年6月批準(zhǔn)了這兩種藥物的使用。然而對(duì)實(shí)體瘤的CAR T細(xì)胞治療的療效尚待進(jìn)一步的研究及提高［4］，而決定這一療法成功與否的關(guān)鍵因素之一就是選擇合適的腫瘤標(biāo)志性抗原為靶點(diǎn)。目前在實(shí)體瘤中在實(shí)驗(yàn)及臨床前對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的靶向CAR T治療［5-6］。隨著人們對(duì)不同腫瘤類型的更深入了解，更多靶向腫瘤特異抗原的CAR T也在不斷涌現(xiàn)。這些靶向腫瘤特異的標(biāo)志性抗原的新型CAR-T細(xì)胞，需要使用敏感的CAR分子檢測(cè)方法對(duì)CAR-T細(xì)胞染色及鑒定以確定其有效性。

當(dāng)前最常見(jiàn)的CAR分子檢測(cè)方法包括熒光染色流式細(xì)胞檢測(cè)［7］、與CAR蛋白共表達(dá)的熒光蛋白流式細(xì)胞檢測(cè)［8］、qPCR檢測(cè)CAR載體在基因組中整合的頻率等［9］。但這3類檢測(cè)方法之間的敏感性和適用性的系統(tǒng)性比較研究目前尚不多見(jiàn)。同時(shí)對(duì)處于研發(fā)階段的新型CAR分子中單鏈可變區(qū)部分的輕鏈重鏈排布的順序和靶向同一位點(diǎn)的不同CAR分子是否會(huì)對(duì)不同檢測(cè)方法的結(jié)果有所影響，以及檢測(cè)方法的選擇還需在同一水平進(jìn)行試驗(yàn)，提供系統(tǒng)化的參考。

因此，本文使用多種CAR分子（包括正在研發(fā)階段的4種新型CAR分子）對(duì)這些方法之間的敏感性和適用性進(jìn)行比較。對(duì)6種分別靶向多種腫瘤過(guò)表達(dá)的間皮素（mesothelin）及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子 受 體（mesenchymal-epithelial transition factor，MET），膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）廣譜點(diǎn)突變蛋白［10］（IDH1 R132H）（基于靶向同一位點(diǎn)R132H兩種不同scFv序列），以及原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）過(guò)表達(dá)的 IL-4Rα［11-12］（包含同一scFV的輕重鏈不同排列順序，即HL代表N端-重鏈-輕鏈-C端，LH代表N端-輕鏈-重鏈-C端）的CAR分子在Jurkat細(xì)胞的表達(dá)水平逐一評(píng)估，為后續(xù)新型CAR分子鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)菌株Stbl3；人外周血T淋巴細(xì)胞Jurkat細(xì)胞系；慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑及儀器 去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；胎牛血清購(gòu)自Biological Industries公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基和Opti-MEM購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司 ；BamH I、Xba I、Sal I、Avr II和T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；Biotin-protein L購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司；Biotin-SP Goat Anti-Mouse IgG、Biotin-SP Rabbit Anti-Human IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司；PE-Streptavidin購(gòu)自BD公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；BSA購(gòu)自生工生物；引物合成和測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司上海分公司完成；實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、C6流式細(xì)胞儀、qPCR儀、低溫冷凍離心機(jī)、搖床等。

1.2 方法

1.2.1 六種新型CAR分子表達(dá)載體構(gòu)建 構(gòu)建Meso-BBζ（靶向 Mesothelin）、Met-BBζ（靶向 Met）、CAR1-2-BBζ-GFP（ 靶 向 IDH1 R132H）、CAR2-4-BBζ-GFP（ 靶 向 IDH1 R132H）、Dupixent HL-BBζ-GFP（靶向 IL-4Rα）、Dupixent LH-BBζ-GFP（靶向IL-4Rα）6種CAR分子表達(dá)載體。

1.2.2 慢病毒包裝及感染 將表達(dá)6種CAR的載體DNA與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液，高速離心濃縮。使用24 h和48 h的病毒感染Jurkat細(xì)胞系，得到穩(wěn)定表達(dá)CAR的6種Jurkat細(xì)胞。

1.2.3 流式抗體染色及檢測(cè)［7］取1 × 106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷的 1 × PBS（含 4% BSA）洗 3次，100 μL重懸，加入0.5 μg Biotin-protein L（Biotin-SP Goat Anti-Mouse IgG/Biotin-SP Rabbit Anti-Human IgG 5 μg），4℃，45 min；預(yù)冷的1 × PBS（含4% BSA）洗3次，50 μL 重懸，加入 2 μL PE-Streptavidin，避光 4℃，15 min；預(yù)冷的1 × PBS（含4% BSA）洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 絕對(duì)定量［13］：選擇CAR載體上WPRE（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）基因?yàn)槎繖z測(cè)基因，ALB（albumin）基因?yàn)閮?nèi)參基因。制備標(biāo)準(zhǔn)品的基因片段，標(biāo)準(zhǔn)品PCR引物：ALB，F(xiàn)- AGGCCATATTCAGTAGAAAAAGATG，R-TGGGGAGGCTATAGAAAATAAGG；WPRE，F(xiàn)-ACAGCCACCAAGGACACCTAC，R-GAAGGAAGGTCCGCTGGATTGA。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品基因片段濃度，將標(biāo)準(zhǔn)品成比例稀釋成4個(gè)梯度，計(jì)算每微升標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度濃度稀釋，取4個(gè)不同稀釋比例（102-108拷貝）的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)胞基因組樣品同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品梯度和每一個(gè)樣品均設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的循環(huán)閾值，計(jì)算循環(huán)閾值的平均值。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算獲得待測(cè)樣品的WPRE 和Alb的拷貝數(shù)［13］。從而計(jì)算每個(gè)細(xì)胞整合的慢病毒數(shù)目，計(jì)算公式為：每個(gè)細(xì)胞CAR分子的拷貝數(shù)=（WPRE基因拷貝數(shù)均值/ALB基因均值）×2，進(jìn)而推測(cè)CAR分子表達(dá)水平。相對(duì)定量：以Jurkat-Dupixent-HL-GFP細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)品，將Jurkat-Dupixent-HLGFP細(xì)胞用Jurkat細(xì)胞混合稀釋成不同綠色熒光蛋白表達(dá)比例的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品，選擇綠色熒光蛋白表達(dá)比例分別為0（Jurkat）、20%、40%、60%的標(biāo)準(zhǔn)品梯度。每一個(gè)梯度和樣品細(xì)胞分別取1.5×106個(gè)細(xì)胞提取基因組，進(jìn)行WPRE基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，內(nèi)參基因是ALB，每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品梯度和每一個(gè)樣品均設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的循環(huán)閾值，計(jì)算循環(huán)閾值的平均值。計(jì)算得到WPRE相對(duì)于ALB基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)GFP比例和WPRE基因的相對(duì)表達(dá)量繪制曲線，將待測(cè)樣品的WPRE基因的相對(duì)表達(dá)量代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定CAR是否在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以及大致表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 特異靶向間皮素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、IDH1突變蛋白及IL-4Rα的CAR載體的構(gòu)建

成功構(gòu)建6種帶有CAR分子的慢病毒載體。后4種CAR分子為新型的CAR分子，故構(gòu)建其與綠色熒光蛋白GFP通過(guò)T2A系統(tǒng)同時(shí)表達(dá)的載體（圖1）。對(duì)CAR載體進(jìn)行雙酶切（圖2）及測(cè)序驗(yàn)證，確證其構(gòu)建的正確性（圖3）。

圖2 CAR載體酶切圖Fig. 2 Map of restriction enzyme digestion of CAR vectors

圖3 CAR分子scFv段測(cè)序圖譜（部分）Fig. 3 Sequencing profiles of scFv segments in CAR molecules（partial）

2.2 流式細(xì)胞法檢測(cè)CAR分子的表達(dá)

包裝慢病毒并感染Jurkat細(xì)胞，獲得表達(dá)不同CAR分子的Jurkat細(xì)胞，即Jurkat-Meso，Jurkat-Met，Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP 和 Jurkat-Dupixent-LH-GFP。流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同染色方法所示的CAR表達(dá)水平（圖4）。分別計(jì)算IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L染色平均熒光強(qiáng)度（MFI），如圖5所示。從平均熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率來(lái)看，兩種方法的配對(duì)t檢驗(yàn)分析，均有顯著性差異（P值均為0.031 3），IgG抗體染色較優(yōu)。表明IgG抗體染色較蛋白質(zhì)L染色陽(yáng)性峰偏移程度更高，對(duì)CAR分子的反應(yīng)靈敏性更高，染色效果好。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR表達(dá)結(jié)果Fig. 4 Results of CAR expression detected by flow cytometry

圖5 兩種染色方法平均熒光強(qiáng)度及陽(yáng)性率比較Fig. 5 Comparison of two staining methods shown as average fluorescence intensity and positive percentage

對(duì)于Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LH-GFP四種細(xì)胞，IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L染色法檢測(cè)效率低，靶向同一位點(diǎn)的不同scFv序列以及同一scFv序列的不同輕重鏈排布的樣品均沒(méi)有顯示染色優(yōu)勢(shì)。對(duì)熒光法染色檢測(cè)不可行的CAR分子，GFP共表達(dá)的水平可體現(xiàn)編碼CAR分子的慢病毒在細(xì)胞的感染效率。

2.3 絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法qPCR檢測(cè)編碼CAR分子的病毒轉(zhuǎn)染效率

PCR得到ALB和WPRE基因片段（圖6）。在絕對(duì)定量法中，建立標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和循環(huán)閾值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）。標(biāo)準(zhǔn)品（按100倍稀釋）WPRE拷貝數(shù)與循環(huán)閾值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-4.016 9x+40.018（R2為0.995 4）；標(biāo)準(zhǔn)品（按100倍稀釋）ALB拷貝數(shù)與循環(huán)閾值作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-4.071x+38.493（R2為0.994 9）。根據(jù)樣品循環(huán)閾值計(jì)算得到樣品WPRE和ALB基因的拷貝數(shù)，繼而得到每個(gè)細(xì)胞整合CAR拷貝數(shù)。其中，無(wú)法用IgG抗體和蛋白質(zhì)L染色法檢測(cè)的表達(dá)4種新型CAR分子Jurkat細(xì) 胞 ：Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LHGFP中每個(gè)細(xì)胞平均整合的CAR分子拷貝數(shù)分別為0.36、0.66、3.50、3.29。

圖6 PCR片段DNA標(biāo)準(zhǔn)品的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoresis profile of the standard DNA samples by PCR

圖7 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（絕對(duì)定量法）Fig. 7 Standard curve diagrams of standard samples（absolute quantitative method）

在相對(duì)定量法中，Jurkat-Dupixent-HL-GFP細(xì)胞按綠色熒光蛋白表達(dá)比例加入對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)品梯度，與樣品同時(shí)提取基因組，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，建立不同綠色熒光蛋白表達(dá)比例和WPRE相對(duì)表達(dá)量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖8），得到R2為0.997 7的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.988 9x+0.239 8。根據(jù)樣品基因組中WPRE相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算得到綠色熒光蛋白表達(dá)比例（CAR分子表達(dá)比例），可以推測(cè)CAR分子的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖8 HL-GFP百分比與WPRE相對(duì)表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（相對(duì)定量法）Fig. 8 Standard curve of the percentage of HL-GFP and the relative expression of WPRE（relative quantitative method）

2.4 五種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果比較

將定量qPCR法與GFP共表達(dá)的結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)兩種不同策略之間有一定的對(duì)應(yīng)性，且進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析，相對(duì)定量法與綠色熒光蛋白共表達(dá)法的結(jié)果沒(méi)有明顯差異，即在標(biāo)準(zhǔn)曲線所示的范圍內(nèi)，WPRE基因含量越高，編碼CAR分子的病毒轉(zhuǎn)染效率越高。由此樣品基因組中WPRE基因含量在一定程度上反映了編碼CAR分子的病毒轉(zhuǎn)染效率（圖 9）。

圖9 四種新型CAR分子3種不同檢測(cè)方法的比較圖Fig. 9 Comparison of 3 different methods in detecting 4 novel CAR molecules

從適用性、直觀性等方面比較5種實(shí)驗(yàn)方法（表1），綠色熒光蛋白與CAR分子共表達(dá)的流式細(xì)胞檢測(cè)法、相對(duì)定量和絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)法可適用于所有的CAR分子檢測(cè)；IgG抗體和蛋白質(zhì)L染色的流式細(xì)胞檢測(cè)法均可以直接反應(yīng)CAR分子的表達(dá)比例。通過(guò)將CAR分子與不同顏色的熒光蛋白共表達(dá)，以及通過(guò)檢測(cè)CAR分子上特定的序列來(lái)檢測(cè)CAR分子的相對(duì)定量和絕對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)法可間接反應(yīng)CAR分子表達(dá)。

表1 五種方法CAR檢測(cè)方法的優(yōu)劣比較表Table 1 Comparison of the five methods in detecting CAR moleculars

此外，IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L染色的流式細(xì)胞檢測(cè)適用于檢測(cè)一部分CAR分子上的單鏈抗體片段，可直觀反應(yīng)能被染色CAR分子的表達(dá)比例，但是無(wú)法適用于本文中的4個(gè)新型CAR分子。

3 討論

本研究以感染6種CAR分子（包括正在研發(fā)階段的4種新型CAR分子）的Jurkat-Meso，Jurkat-Met，Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LH-GFP細(xì)胞為樣本，通過(guò)5種最常見(jiàn)的嵌合型抗原受體檢測(cè)方法來(lái)比較這幾種方法的優(yōu)劣。

目前存在多種通過(guò)流式染色鑒定嵌合抗原受體表達(dá)的方法［14］，其中比較常用的兩種CAR分子檢測(cè)方法是通過(guò)IgG抗體和蛋白質(zhì)L結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的CAR分子。這兩種方法因IgG抗體和蛋白質(zhì)L可能與細(xì)胞表面非CAR蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)可能引入假陽(yáng)性。此外，對(duì)于一個(gè)細(xì)胞上表達(dá)兩種不同CAR分子的檢測(cè)也存在不適用的問(wèn)題，同時(shí)這兩種染色劑只能結(jié)合一部分CAR分子中單鏈抗體片段（scFv）的輕鏈部分，不能結(jié)合所有CAR分子中單鏈抗體片段（scFv）的輕鏈部分，如本文使用的Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LH-GFP四株細(xì)胞就不能被這兩種染色劑檢測(cè)到，但Jurkat-Meso，Jurkat-Met兩種細(xì)胞上的CAR分子可以通過(guò)IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L抗體染色檢測(cè)到。從峰值偏移水平、陽(yáng)性率以及平均熒光強(qiáng)度顯著性分析可以看出IgG抗體染色比蛋白質(zhì)L染色的效果更佳。隨著嵌合抗原受體T細(xì)胞療法的發(fā)展，更多檢測(cè)嵌合抗原受體的方法報(bào)道相繼出現(xiàn)，如數(shù)字PCR（dPCR）精確定量CAR-T細(xì)胞［15］、分析單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集CAR mRNA的含量［16］、共聚焦顯微鏡以高空間分辨率可視化CAR［17］等。文章中使用的5種方法是目前最常見(jiàn)且廉價(jià)方便的檢測(cè)方法，并在同一水平同時(shí)利用這些檢測(cè)方法分析其敏感性和適用性，提供了系統(tǒng)化的參考。

將CAR分子通過(guò)T2A系統(tǒng)與綠色熒光蛋白共表達(dá)的方法可用于所有嵌合抗原受體表達(dá)水平的檢測(cè)，然而此方法僅適用于研究。此外，在載體中額外引入GFP的序列會(huì)影響病毒的包裝效率。在本文中，這為我們提供qPCR相對(duì)定量檢測(cè)CAR表達(dá)水平的參考值，以便通過(guò)綠色熒光蛋白表達(dá)比例和qPCR循環(huán)閾值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算表達(dá)CAR分子細(xì)胞的比例。qPCR絕對(duì)定量的方法早先應(yīng)用于檢測(cè)病毒滴度［13］，近幾年有關(guān)于監(jiān)測(cè)外周血嵌合抗原受體T細(xì)胞的qPCR分析方法的報(bào)道［9］，與相對(duì)定量的方法相比，結(jié)果精確性高，能計(jì)算得到平均每一個(gè)細(xì)胞基因組整合CAR分子的數(shù)目，可體現(xiàn)CAR分子表達(dá)水平的趨勢(shì)。

綜上所述，qPCR的絕對(duì)定量方法是在基因水平上檢測(cè)細(xì)胞基因組中整合的CAR分子數(shù)目，可大致推測(cè)CAR分子表達(dá)水平趨勢(shì)。而具體CAR分子的表達(dá)水平和含有CAR分子細(xì)胞比例的結(jié)果還需在蛋白質(zhì)水平上得到驗(yàn)證，可通過(guò)qPCR的相對(duì)定量、流式抗體染色或偶聯(lián)GFP蛋白，通過(guò)流式細(xì)胞儀直觀的檢測(cè)。

4 結(jié)論

在 穩(wěn) 定 表 達(dá)Meso-CAR、Met-CAR、CAR1-2-GFP、CAR2-4-GFP、Dupixent-HL-CAR-GFP、Dupixent-HL-CAR-GFP的6種Jurkat細(xì)胞中，CAR分子與綠色熒光蛋白共表達(dá)可用于CAR表達(dá)水平的試驗(yàn)階段的檢測(cè)，免疫球蛋白G抗體染色的靈敏性較蛋白質(zhì) L染色好，對(duì)于免疫球蛋白G抗體及蛋白質(zhì) L無(wú)法識(shí)別的CAR分子，則可以使用相對(duì)或絕對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光PCR方法，兩者均可以反映CAR表達(dá)水平的趨勢(shì)。