王威威，李德鑫，李秋娥，廖 海，張富麗，周嘉裕*

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川 成都 610066)

【研究意義】暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)為百合科多年生草本植物，主產(chǎn)于川西高原地區(qū)，為四川名貴道地藥材川貝母的基原植物之一。暗紫貝母以其干燥鱗莖入藥，味苦，微寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱潤肺，止咳化痰，鎮(zhèn)靜平喘，抗炎降壓等多種功效，習稱為“松貝”[1-2]。暗紫貝母的主要活性成分包括異甾體類生物堿和甾體類生物堿，其中異甾體類生物堿所占比例約為75%[3]?！厩叭搜芯窟M展】高等植物中，異甾體生物堿與甾體類生物堿的生物合成與三萜的生物合成都是通過甲羥戊酸(MVA)途徑進行的[4-5]。鯊烯合酶(Squalene synthase，SQS)是MVA途徑的一個關鍵酶，其催化兩分子的法尼基焦磷酸 (famesyl diphosphate,FPP)縮合生成鯊烯(squalene)，鯊烯(squalene)經(jīng)過一系列氧化還原反應后，生成異甾類與甾體類生物堿。鯊烯合酶SQS的含量與活性決定了MVA途徑后續(xù)產(chǎn)物的產(chǎn)量[6-9]。鑒于SQS在MVA途徑的關鍵地位，對植物中鯊烯合酶的研究已成為植物MVA途徑關鍵酶研究的熱點。【本研究切入點】目前已經(jīng)從甘草[8]、山楂[11]、刺五加[10]等多種植物中克隆出SQS的cDNA序列，但暗紫貝母中SQS的相關研究未見報道。實驗室前期已獲得了暗紫貝母轉錄組數(shù)據(jù)，從中發(fā)現(xiàn)有8條功能注釋為SQS的Unigene?！緮M解決的關鍵問題】本文從中選擇ORF長度最長(1230 bp)的SQS Unigene，利用RT-PCR的方法，克隆得到暗紫貝母SQS的ORF序列，并對序列開展生物信息學分析，最后通過Real-time PCR的方法分析SQS在暗紫貝母不同組織中表達水平的差異，從而為深入研究SQS在暗紫貝母生物堿生物合成途徑的調控機制提供科學依據(jù)，并為體外生物合成川貝母生物堿的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)完整植株采自青海省西寧市互助縣青海綠康生物開發(fā)有限公司，經(jīng)西南交通大學生命科學與工程學院周嘉裕副教授鑒定為暗紫貝母，清水洗凈后，濾紙吸干植株表面水分，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒(Prime-Script RT reagent Kit)、LA酶、pMD19-T載體、DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細胞、2×T5 FAST qPCR Mix(SYBR GreenⅠ)試劑盒購自北京擎科生物有限公司；引物合成和基因測序由北京擎科生物有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 暗紫貝母各組織RNA的提取 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取暗紫貝母鱗莖、莖、葉、花中的RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用Bio-Tek酶標儀檢測其純度和濃度，并于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 暗紫貝母各組織RNA的逆轉錄 取三年生成熟期暗紫貝母鱗莖、莖、葉、花中的RNA各1000 ng，根據(jù)PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒說明書進行逆轉錄。

1.2.3 PCR擴增cDNA 根據(jù)本實驗室已有的暗紫貝母轉錄組數(shù)據(jù)，得到功能注釋為鯊烯合酶基因(SQS)的Unigene，利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找序列的開放閱讀框(ORF)，并用Primer primier 5.0設計ORF序列特異性引物(表1)，以逆轉錄得到的鱗莖cDNA為模板進行PCR擴增。LA酶PCR體系為50 μL，其中上下游引物各1 μL，10×LA PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mix 8 μL，模板cDNA 2 μL，LATaq酶0.5 μL，補滅菌ddH2O至50 μL。PCR反應程序：預變性95 ℃，5 min；變性 95 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸 72 ℃，2 min，32個循環(huán)72 ℃延伸7 min。取10 μL擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收及單克隆測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外光下切下目的條帶，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與 pMD19-T Vector 16 ℃過夜連接，將重組質粒轉化到DH5α感受態(tài)細胞中。均勻涂布在含IPTG、X-gal 和Amp的LB平板上。37 ℃培養(yǎng)16 h 左右，隨機挑選8個白斑，搖菌培養(yǎng)6～8 h，將PCR擴增驗證為陽性的菌液送北京擎科生物有限公司測序。

1.2.5 生物信息學分析 ExPASyProteomics Server (https://web.expasy.org/protparam/)在線分析蛋白質的相對分子質量、等電點、疏水性等基本理化性質。TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白質跨膜結構域。SingnalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/sevices/signalP/)進行信號肽分析。PSORT(https://www.psort.org/)進行亞細胞定位的預測。NCBI在線分析工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白質保守結構域。SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質的二級結構，并通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行SQS蛋白三級結構同源建模。使用Clustal W進行比對分析，并從GenBank下載醋桿菌等48個物種的SQS氨基酸序列(表2)利用MEGA 7.0構建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap重復次數(shù)為 1000次。

表1 引物序列信息

M：DL2000 marker; 1：PCR擴增產(chǎn)物 M: DL2000 marker; 1: PCR product圖1 FuSQS的擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplification product of FuSQS

1.2.6FuSQS基因在暗紫貝母不同組織中相對表達量分析 以暗紫貝母18S基因為內參，利用Primer primier 5.0軟件根據(jù)測序結果和18 S基因設計qRT-PCR 擴增引物和內參引物。以逆轉錄出的暗

表2 不同物種SQS氨基酸序列信息

續(xù)表2Continued table 2

紫貝母各組織cDNA為模板，采用2×T5 FAST qPCR Mix(SYBR GreenⅠ)試劑盒在Roche Light Cycler96熒光定量PCR儀中進行PCR 檢測，每個樣品平行做3次，所得數(shù)據(jù)按照Cq(2-ΔΔCq)法計算SQS基因的相對表達量。qPCR體系為：2×T5 FAST qPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板cDNA 1 μL，補滅菌ddH2O至20 μL。qPCR反應程序95 ℃預變性，1 min。95 ℃，30 s；56 ℃，40 s；72 ℃，20 s；40個循環(huán)，同時繪制熔融曲線。

2 結果與分析

2.1 cDNA擴增結果

參照暗紫貝母轉錄組數(shù)據(jù)，設計引物上游引物FuSQS-F、下游引物FuSQS-R，以暗紫貝母鱗莖cDNA為模板進行PCR擴增，結果顯示擴增產(chǎn)物長度與預期相符(圖1)，通過單克隆測序驗證獲得一條長度為1230 bp暗紫貝母SQS基因ORF核苷酸序列，將其命名為FuSQS，提交GenBank獲得注冊號MW365404，使用DNAMAN 6.0將所得核苷酸序列與所選轉錄組SQS Unigene的ORF序列進行比對，二者序列相似度為99.59%，驗證了轉錄組數(shù)據(jù)的準確性。

2.2 暗紫貝母SQS氨基酸序列生物信息學分析

FuSQS編碼蛋白的氨基酸殘數(shù)為409，理論相對分子質量為46.84 kDa，理論等電點(pI)為6.33，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為41.36，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為92.25，總平均疏水性(GRAVY)為-0.099，說明該蛋白為親水性蛋白。應用SingnalP4.1進行信號肽分析，結果顯示該蛋白不含信號肽，說明該蛋白屬于非分泌性蛋白。用在線軟件PSORT進行亞細胞定位的預測，結果表明該蛋白最有可能定位于內質網(wǎng)膜上。利用TMHMM Server v.2.0預測蛋白質的跨膜結構域，結果表明該蛋白在287～304 aa和386～408 aa存在兩個跨膜超螺旋結構域，1～286 aa和409 aa位于內質網(wǎng)膜外，305～386 aa位于內質網(wǎng)膜內。

CDD結果顯示該蛋白屬于類異戊二烯生物合成超家族Ⅰ類，含有法尼基焦磷酸結合口袋和鎂離子結合位點——富含天冬氨酸的區(qū)域，并特異性命中三個鯊烯合酶(SQS)的重要結構域：Trans_IPPS_HH、SQS-PSY和ERG9，進一步驗證了該蛋白為鯊烯合酶(SQS)。將暗紫貝母SQS氨基酸序列與已報道的智人、葡萄球藻、重樓、青蒿、擬南芥、甘草、紅豆杉、煙草、玉米等物種的SQS氨基酸序列進行比對，結果(圖2)顯示，以上物種氨基酸序列有6個較為保守的區(qū)域，結合保守結構域預測結果，發(fā)現(xiàn)SQS酶活性中心相關的47VSRSF52、77DTVED81、213DYLED217、R225均高度保守[17]，且都落在6個保守區(qū)域內。

EgSQS：油棕；PpSQS：寬瓣重樓；FuSQS：暗紫貝母；ZmSQS：玉米；NtSQS：煙草；GgSQS：光果甘草；AaSQS：青蒿；AtSQS：擬南芥；TcSQS：紅豆杉；BbSQS：葡萄球藻；HsSQS：智人 EgSQS: Elaeis guineensis; PpSQS: Paris polyphylla var.yunnanensis; FuSQS: Fritillaria unibracteata; ZmSQS: Zea mays; NtSQS: Nicotiana tabacum; GgSQS: Glycyrrhiza glabra; AaSQS: Artemisia annua; AtSQS: Arabidopsis thaliana; TcSQS: Taxus cuspidate; BbSQS: Botryococcus braunii; HsSQS: Homo sapiens圖2 FuSQS編碼蛋白與部份物種SQS蛋白的序列對比Fig.2 Sequence comparison of FuSQS protein and SQS proteins of some species

圖3 FuSQS編碼蛋白三級結構預測分析模型Fig.3 Tertiary structure prediction and analysis model of FuSQS encoded protein

利用SOPMA對該蛋白二級結構分析，結果顯示該蛋白由409個氨基酸殘基組成，在二級結構中α螺旋占 71.15%，β折疊占3.18%，延伸主鏈占3.42%，無規(guī)則卷曲占 22.25%。由此可見，在暗紫貝母SQS蛋白結構中，α螺旋和無規(guī)則卷曲是主要構成元件，β折疊和延伸主鏈可能散布于蛋白質結構中。

由于目前還未成功獲得植物中SQS蛋白的三維結構，因此以三維結構已被解析的人類SQS蛋白為模板進行同源建模。經(jīng)過對比，暗紫貝母SQS與模板3vj9.1.A的序列相似度達49.24%，通過SWISS-MODEL對暗紫貝母SQS進行同源建模從而預測暗紫貝母SQS的三維結構(圖3)。預測結果提示，暗紫貝母SQS蛋白為單體球狀蛋白，其活性中心主要是由幾個α螺旋圍繞形成的中央疏水底物結合口袋，用以催化底物，根據(jù)SQS蛋白保守結構域的預測結果以及暗紫貝母SQS與人類SQS對比結果可知，暗紫貝母SQS催化活性中心與人SQS的相應區(qū)域關鍵氨基酸殘基高度保守，因此可以推測暗紫貝母SQS與人類SQS[15]的催化機制可能十分相同。

2.3 暗紫貝母SQS進化關系分析

通過MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹，結果將49條SQS按不同來源分別聚為細菌、真菌、動物、藻類、裸子植物、單子葉植物以及雙子葉植物等7個分化簇(圖4)。其中，F(xiàn)uSQS與同為百合科的花貝母聚為一類，并與川澤瀉、鐵皮石斛、盾葉薯蕷、油棕、寬瓣重樓、虎眼萬年青、水稻、玉米聚為單子葉植物這一大類，說明暗紫貝母與這些物種進化關系較近,而與紅豆杉等裸子植物、擬南芥等雙子葉植物雖同屬植物界但進化關系較遠，與葡萄球藻等藻類、醋桿菌等細菌、靈芝等真菌、智人等動物的進化關系更為遙遠，這一結果與形態(tài)學分類一致。

2.4 暗紫貝母SQS基因在暗紫貝母不同組織中相對表達量分析

為研究暗紫貝母SQS基因在暗紫貝母不同組織中的表達量，采用實時熒光定量PCR進行分析，以暗紫貝母鱗莖為對照組，莖、葉、花為實驗組，并采用Cq(2-ΔΔCq)法進行數(shù)據(jù)處理，結果(圖5)顯示，暗紫貝母SQS基因在不同組織中表達量具有顯著差異，在鱗莖中表達量最高，葉中表達量次于花和鱗莖但高于莖，莖中表達量最少。

圖4 FuSQS與其他物種SQS氨基酸序列對比構建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed by comparing the amino acid sequence of FuSQS with other species

3 討 論

本文借助實驗室前期所獲得的轉錄組數(shù)據(jù)成功克隆出FuSQS基因的完整ORF序列，測序結果與轉錄組數(shù)據(jù)一致，證實了轉錄組數(shù)據(jù)的可信度。對暗紫貝母SQS氨基酸序列的分析結果表明暗紫貝母SQS蛋白由409個氨基酸殘基構成，分子量46.84 kDa，是定位于內質網(wǎng)膜上的親水單體酶，二級結構以α螺旋為主，其活性中心主要是由幾個α螺旋圍繞形成的中央疏水空腔，其催化機制可能與人類SQS[15]的催化機制可能十分相同。這一結果與已報道的川澤瀉[12]、羅漢果[9]、黑老虎[14]、三七等植物的SQS較為相似，說明植物中的SQS蛋白結構保守性較高。該蛋白有兩個跨膜結構域(287～304 aa、386～408 aa)，是SQS蛋白錨定在內質網(wǎng)膜上的肽段，羧基端跨膜結構域肽段是必需的，若缺失會導致SQS蛋白在細胞中積累[16]。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母SQS蛋白屬于類異戊二烯生物合成超家族Ⅰ類，含有底物結合口袋和鎂離子結合位點——富含天冬氨酸的區(qū)域，其中77DTVED81和213DYLED217這兩個富含天冬氨酸的肽段是 SQS與Mg2+的結合位點，主要起結合異戊烯磷酸基團的作用，是催化2分子的法呢基焦磷酸縮合生成鯊烯的關鍵位點[18]，而這兩個肽段在不同的物種SQS中高度保守，說明這些位點在SQS蛋白在長期進化中受到強烈的負選擇作用約束，為維持SQS的催化作用起到重要作用。

FuSQS與其他48種不同物種的SQS構建系統(tǒng)進化樹，得出的系統(tǒng)分類結果與形態(tài)學分類結果一致，表明通過SQS氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹，可以較為準確地反映物種之間的親緣關系。

研究表明植物中的SQS基因表達具有組織特異性，研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛[19]SQS基因表達存在組織特異性，根中的表達量遠高于莖和葉，蛇足石杉[20]SQS基因在根中表達量高于莖和葉，西洋參[21]SQS基因在須根，葉柄，種皮等14個組織中的表達量也具有顯著差異。本研究的qPCR結果表明，暗紫貝母SQS基因在不同組織中表達量具有顯著差異，表達量依次為鱗莖>花>葉>莖。鱗莖是暗紫貝母的藥用部位，其生物堿含量在暗紫貝母組織中是最高的[22]，SQS基因在暗紫貝母鱗莖中的高表達特征，揭示了SQS在暗紫貝母生物堿合成途徑中具有重要的調控作用，其表達量的多少會影響后續(xù)生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)量。后續(xù)可以進行對暗紫貝母SQS的過表達特征分析及體外蛋白表達等研究。

4 結 論

本研究根據(jù)暗紫貝母轉錄組數(shù)據(jù)克隆得到了FuSQS序列，且進行了一系列的生物信息學分析，并對FuSQS基因在暗紫貝母不同組織中的表達水平進行了分析，所得的結果為深入研究SQS在暗紫貝母生物堿生物合成途徑的調控機制提供科學依據(jù)，并為體外生物合成川貝母生物堿的研究奠定理論基礎。