姚運(yùn)法，練冬梅，林碧珍，賴正鋒，洪建基

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005)

【研究意義】冰葉日中花(MesembryanthemumcrystallinumLinn.)俗稱冰菜，屬于番杏科日中花屬(MesembryanthemumL.)的一年生或二年生草本植物，其莖匍匐、葉肉質(zhì)，具有較高食用價(jià)值[1]。原產(chǎn)非洲南部，世界各地均有引種栽培，近年來引種中國[2]。冰菜在環(huán)境適應(yīng)性方面，具有耐干旱、鹽堿、喜陽光、怕寒及水澇等特點(diǎn)，其適合生長的溫度是5～25 ℃[3]。冰菜作為一種新型特菜資源，研究冰菜外源硒對冰菜生長和生理變化機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】硒是一種重要的微量元素，適量硒能清除植物體過量自由基[4]，促進(jìn)根系生長發(fā)育[5]，有利于増強(qiáng)植物體新陳代謝，提高生命力，抵御逆境傷害，延緩組織成熟衰老等[6-8]；高濃度硒會促進(jìn)植物過氧化作用，易造成植物體損傷[9]。研究表明，硒能改善多種作物的可食用部分品質(zhì)[4]。蔬菜食用部位硒的含量濃度在0.0008～5.37 mg/kg范圍內(nèi)，均值為0.067 mg/kg[10]，其中葉菜中硒的平均濃度低于推薦值0.025 mg/kg[11]。蔬菜中的硒含量隨著土壤中硒含量的增加而増加，對外源硒的響應(yīng)能力因植物種類而異，薛瑞玲等[12]發(fā)現(xiàn)，低濃度硒鹽能提高小白菜的抗氧化作用，促進(jìn)葉綠素合成和葉片生長，高濃度時(shí)則相反。因此，適宜濃度的硒對植物的生長發(fā)育有益?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，在中國的冰菜設(shè)施栽培越來越廣泛，開展冰菜富硒栽培模式具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對冰菜以不同濃度(0、10和100 mmol/L)外源硒處理，利用Illumina Hi-seq 2500高通量測序技術(shù)，分析不同濃度硒處理下冰菜響應(yīng)機(jī)制及其植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)差異基因表達(dá)情況，篩選冰菜硒響應(yīng)的相關(guān)基因及其表達(dá)機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄組水平闡述冰菜對硒處理的響應(yīng)機(jī)制，挖掘發(fā)現(xiàn)富硒的冰菜資源，為富硒冰菜育種積累理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為冰菜，種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗(yàn)農(nóng)場。2019年12月11日育苗，2020年1月10日定植。2020年2月15日，以亞硒酸鈉為外源硒，不同濃度(M0: 0 mmol/L; M1:10 mmol/L；M2: 100 mmol/L)亞硒酸鈉處理冰菜。2020年2月22日取嫩莖葉，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)樣品，置于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序 利用Trizol(Invitroge)試劑分別提取硒處理(M1和M2)和對照(M0)冰菜嫩莖葉總RNA，采用Nanodrop(ThermoFisher)、Qubit 2.0、Aglient 2100(Bioanalyzer)技術(shù)檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，構(gòu)建cDNA文庫，再分別使用QubiM2.0、Agilent 2100和Q-PCR對文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測。合格后，基于SBS技術(shù)，使用Illumina Hiseq高通量測序平臺對cDNA文庫進(jìn)行測序，產(chǎn)出高質(zhì)量Raw Data，采用截除Reads中的測序接頭以及引物序列方式，過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量Clean Data。利用Trinity軟件對高質(zhì)量的Clean Data進(jìn)行序列組裝。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)組裝與分析 將冰菜轉(zhuǎn)錄組測序Clean Data與組裝得到的Transcript或Unigene庫進(jìn)行序列比對，比對到Transcript或Unigene的Reads稱為Mapped Reads，Mapped Reads將用于后續(xù)的分析。

1.2.3 Unigene表達(dá)量估計(jì)與差異表達(dá)分析 采用Bowtie將測序得到的Reads與Unigene庫進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果，結(jié)合RSEM進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM值(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)表示對應(yīng)Unigene的表達(dá)豐度。使用EBSeq進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用Benjamini-Hochberg方法對原假設(shè)試驗(yàn)得到的顯著性P值進(jìn)行校正，校正后P值，即偽發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate)小于0.01且差異倍數(shù)(Fold Change,FC)大于等于2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中，F(xiàn)C表示兩樣品(組)間FPKM的比值。

1.2.4 DEGs篩選和韋恩圖統(tǒng)計(jì) 根據(jù)對照與處理樣品之間表達(dá)水平的相對高低，DEGs可分為下調(diào)基因(Down gene)和上調(diào)基因(Up gene)。然后對兩組 (M0 與 M1; M0 與 M2) 數(shù)據(jù)DEGs進(jìn)行維恩圖分析。

1.2.5 Unigene功能注釋與DEGs富集分析 使用Blast軟件將Unigene序列與COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG、NR等8大數(shù)據(jù)庫比對，使用KOBAS 2.0得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果，預(yù)測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得Unigene的注釋信息。系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物代謝途徑及功能，并將DEGs比對到KEGG數(shù)據(jù)庫，得到DEGs的代謝途徑。

1.2.6 硒處理對冰菜植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析 對硒處理?xiàng)l件下冰菜植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑DEGs(關(guān)鍵酶基因)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫檢索，分析植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)情況，研究不同硒處理濃度對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中間產(chǎn)物影響。

1.2.7 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵差異基因驗(yàn)證 表1顯示，取1 μg冰菜葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Primer Premier 6軟件，設(shè)計(jì)并合成引物，使用qRT-PCR分別檢測M0、M1、M2處理與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑關(guān)鍵差異表達(dá)基因，設(shè)置3個(gè)重復(fù)；統(tǒng)計(jì)9個(gè)基因(c38220為內(nèi)參)在待測樣品中的Ct值，計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)組裝及分析

表2顯示，經(jīng)高通量測序和質(zhì)量控制分析，共獲得23.63 Gb Clean data，其中M0 Clean data為8.47 Gb，M1 Clean data為7.61 Gb，M2 Clean data為7.55 Gb，堿基百分比均達(dá)到92.0%以上。本次測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，利于后續(xù)分析。由表3顯示，轉(zhuǎn)錄本序列(Transcipt)組裝出223 477條轉(zhuǎn)錄本序列，平均長度為1843.9 bp，N50長2916 bp；由單基因序列(Unigene)組裝出76 806條，平長度為759.0 bp，N50長1513 bp。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

表2 有效數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計(jì)

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

表4 單基因序列注釋統(tǒng)計(jì)表

表5 差異基因表達(dá)情況

2.2 Unigene功能注釋

如表4所示，在76 806條單基因序列中，共獲得28 172條Unigene的注釋結(jié)果，占單基因序列總數(shù)36.68%。其中與COG數(shù)據(jù)庫比對，獲得9096條基因注釋，占總注釋基因的32.29%；與KOG數(shù)據(jù)庫比對，獲得16 137條基因注釋，占總注釋基因的57.28%；與GO數(shù)據(jù)庫比對，獲得10 493條基因注釋，占總注釋基因的37.25%；與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，獲得15 636條基因注釋，占總注釋基因的55.50%；與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得18 324條基因注釋，占總注釋基因的65.04%；與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫比對，獲得17371條基因注釋，占總注釋基因的61.66%；與eggNOG數(shù)據(jù)庫比對，獲得25 240條基因注釋，占總注釋基因的89.59%；與NR數(shù)據(jù)庫比對，獲得26 405條基因注釋，占總注釋基因的93.73%。

2.3 DEGs的篩選與功能注釋

2.3.1 DEGs篩選 如表5所示，通過DEGs的篩選，獲得冰菜硒處理DEGs 570個(gè)(M0 與 M1)和580個(gè)(M0 與 M2)，其中M0 與 M1組表達(dá)量上調(diào)的基因493個(gè)，下調(diào)基因77個(gè)；M0 與 M2組表達(dá)量上調(diào)的基因293個(gè)，下調(diào)基因287個(gè)。通過對兩組(M0 與 M1，M0 與 M2)DEGs維恩圖分析，硒處理(M0 與 M1)非共表達(dá)基因468個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因447個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因21個(gè)；硒處理(M0 與 M2)非共表達(dá)基因478個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因247個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因231個(gè)；硒處理共表達(dá)基因102個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?6個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因56個(gè)(圖1)。

表6顯示，將M0與M1和M0與M2兩組DEGs單基因序列分別注釋到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG、NR8個(gè)數(shù)據(jù)庫，分別獲得426和428個(gè)基因，其中COG數(shù)據(jù)庫分別208和144個(gè)，GO數(shù)據(jù)庫分別241和239個(gè)，KEGG數(shù)據(jù)庫分別237和138個(gè)，KOG數(shù)據(jù)庫分別309和168個(gè)，Pfam數(shù)據(jù)庫分別366和330個(gè)，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫分別289和325個(gè)，eggNOG數(shù)據(jù)庫分別404和381個(gè)；NR數(shù)據(jù)庫分別367個(gè)和422個(gè)，其中M0與M1組在eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋比最高，超過94.8%；M0與M2組在NR數(shù)據(jù)庫注釋比最高，超過98.6%。

表6 差異表達(dá)基因注釋數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.3.2 GO功能注釋 如表7所示，對不同硒濃度處理M1、M2與M0(CK)DEGs進(jìn)行GO分類統(tǒng)計(jì)，兩組DEGs均歸到43個(gè)功能小類。生物學(xué)過程中DEGs主要集中在代謝過程、細(xì)胞過程、單一生物過程、生物調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答和細(xì)胞成分或生物合成等6個(gè)功能小類占比高，兩組DEGs差值來看，單一生物過程和刺激應(yīng)答生物學(xué)過程，隨著硒處理濃度增加，DEGs分別增加29和22個(gè)；細(xì)胞過程和細(xì)胞成分或生物合成生物過程，隨著硒處理濃度增加，DEGs分別減少45和24個(gè)。細(xì)胞組分過程中DEGs主要在細(xì)胞器、復(fù)雜大分子、細(xì)胞成分、細(xì)胞、細(xì)胞器成分、膜成分、膜結(jié)構(gòu)7個(gè)功能小類占比高；兩組DEGs差值來看：隨著硒處理程度增加，細(xì)胞器、復(fù)雜大分子、細(xì)胞成分、細(xì)胞、細(xì)胞器成分、細(xì)胞組分過程DEGs減少，且DEGs均在50個(gè)以上；膜成分、膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器成分等過程比值較高，分別差42、35和18個(gè)DEGs。分子功能過程中DEGs在催化活性、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和分子結(jié)合活性4個(gè)功能小類占比最高。兩組DEGs比值差異來看：其中催化活性過程與硒處理濃度呈正相關(guān)，DEGs個(gè)數(shù)達(dá)69個(gè)；結(jié)構(gòu)分子活性過程與硒處理濃度呈負(fù)相關(guān)，DEGs數(shù)目達(dá)59個(gè)。

表7 硒處理差異表達(dá)基因GO功能注釋比較

續(xù)表7Continued table 7

2.3.3 KOG功能注釋 將M0與M1和M0與M2兩組DEGs注釋到KOG數(shù)據(jù)庫，對注釋結(jié)果進(jìn)行直系同源分類，均獲得22個(gè)功能分類，其中未知功能(S)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(P)、胞質(zhì)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸(U)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(G)、能源的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化(C)、次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(Q)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(I)、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(J)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(E)、轉(zhuǎn)錄(K)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(P)共11個(gè)功能分類DEGs差異較多。

兩組KOG功能注釋差值分析，一般功能預(yù)測(R)、次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(Q)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(G)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(F)功能分類DEGs數(shù)分別為34、14、13、12個(gè)；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(J)、能源的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化(C)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(P)、細(xì)胞骨架(Z)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶(O)功能分類DEGs數(shù)分別為70、27、13、10、10個(gè)(表8)。

表8 硒處理差異表達(dá)基因KOG功能注釋比較

2.3.4 KEGG功能注釋 表9顯示，將兩組DEGs與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，M0與M1和M0與M2分別有431和351條基因得到注釋，分別富集在104和101條代謝通路，其中M0與M1組中，硒處理對核糖體(68個(gè))、碳代謝(35個(gè))、氧化磷酸化(30個(gè))、氨基酸的生物合成(27個(gè))、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(26個(gè))、苯丙烷類生物合成(19個(gè))、植物—病原互作(18個(gè))、光合作用的固碳作用(17個(gè))、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(16個(gè))、嘌呤代謝(15個(gè))、丙酮酸代謝(15個(gè))等11個(gè)代謝途徑具有主要影響；M0與M2組中，硒處理對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(34個(gè))不飽和脂肪酸的生物合成(30個(gè))、苯丙烷類生物合成(30個(gè))、脂肪酸代謝(18個(gè))4個(gè)代謝途徑具有主要影響。M0與M1和M0與M2兩組DEGs差值分析表明，不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、苯丙烷類生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑其DEGs增加分別為27、12、11和8個(gè)；核糖體、碳代謝、氨基酸的生物合成、氧化磷酸化、植物—病原互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工代謝途徑其DEGs分別減少66、32、25、21、9和9個(gè)。

表9 硒處理差異表達(dá)基因KEGG功能注釋比較

2.4 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析

生長素(Auxin)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，生長素吲哚乙酸蛋白(Auxin/indole-3-Acetic Acid，AUX/IAA)有2個(gè)差異拷貝，M1基因表達(dá)無顯著差異，M2處理均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)；生長素上調(diào)小RNA(Small auxin up RNA,SAUR)共16個(gè)差異拷貝，M1和M2處理均具有上調(diào)和下調(diào)基因；生長素響應(yīng)家族基因(Gretchen Hagen3，GH3)共有2個(gè)拷貝，M1和M2均表現(xiàn)下調(diào)(c32701)或上調(diào)(c32788)。細(xì)胞分裂素(Cytokinine，CK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins，AHP)(c31251、c36579)在M1和M2處理下均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，AHP(c39901)對M1處理表現(xiàn)下調(diào)，M2處理表現(xiàn)不敏感。A型擬南芥響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Type-A Arabidopsis response regulators，A-ARR)對M1和M2處理顯著上調(diào)作用。赤霉素(Gibberellin，GA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，赤霉素不敏感矮稈蛋白1(Gibberellin insensitive Dwarf 1，GID1)(c39849)在M1和M2處理均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor，TF)(c37269)在M1和M2處理均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。脫落酸(Abscisic acid，ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中：蔗糖非發(fā)酵1相關(guān)蛋白激酶2(Sucrose nonfermenting 1-related protein kinase2，SnRK2)(c37312)在M1處理表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，M2處理表現(xiàn)不顯著表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)受體蛋白PYR/PYL/RCAR家族基因影響比較復(fù)雜，PYR/PYL/RCAR復(fù)合體(c26211)在M1處理表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，M2處理表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)；PYR/PYL/RCAR復(fù)合體(c34313)在M1處理表達(dá)不顯著，M2處理顯著下調(diào)表達(dá)；PYR/PYL/RCAR(c28738)在M1和M2均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)；2C類蛋白磷酸酯酶(Protein phosphatase 2C,PP2C)有7個(gè)拷貝具有表達(dá)量差異表現(xiàn)，無規(guī)律；ABRE結(jié)合因子(ABRE binding factors，ABF)有2個(gè)差異表達(dá)拷貝，其中c34215在M1處理表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，M2處理表達(dá)差異不顯著，c32284在M1處理表達(dá)差異不顯著，M2處理表達(dá)顯著下調(diào)。乙烯(Ethylene，ET)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ETR和ERF1/2各有1個(gè)拷貝，在M1和M2處理下均表現(xiàn)為顯著下調(diào)表達(dá)。茉莉酸(Jasmonic acid，JA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，骨髓細(xì)胞瘤病蛋白2(Myeolcytomatosis proteins 2，MYC2)(c36305)和茉莉酮酸酯ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白(Jasmonate ZIM-domain，JAZ)(c28853)在M1處理下均表現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，M2處理下表達(dá)無顯著差異。水楊酸(Salicylic acid，SA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，TGACG基序結(jié)合因子(TGACG motif-binding factor，TGA)和病程相關(guān)蛋白-1(Pathogenesis-related protein-1，PR-1)在M1處理?xiàng)l件下，表達(dá)量無顯著差異表達(dá)，M2處理下，TGA表達(dá)量下調(diào)，PR-1表達(dá)量上調(diào)，上調(diào)表達(dá)量增加12倍。另外，油菜素類固醇(Brassinosteroid，BRs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在M1和M2處理下，均無顯著差異表達(dá)基因(表10)。

表10 硒處理下冰菜植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因差異表達(dá)

續(xù)表10Continued table 10

2.5 植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵差異基因驗(yàn)證分析

對表10中部分DEGs進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證，共驗(yàn)證AUX/IAA、SAUR、GH3、AHP、MYC2、JAZ、PR-1等7個(gè)。以冰菜Actin (c38220) 基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。由圖2可知，7個(gè)DEGs基因qRT-PCR分析得到的相對表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析趨勢完全一致，但表達(dá)的變化大小存在一定差異，說明基因表達(dá)譜的分析結(jié)果基本可靠，其中PR-1(c41466)基因分別M0和M2表達(dá)量差異極大，為冰菜水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑硒處理響應(yīng)關(guān)鍵基因克隆提供研究基礎(chǔ)。

3 討 論

硒處理對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中除油菜素類固醇外，其它7個(gè)代謝途徑均產(chǎn)生重要影響。生長素IAA通過細(xì)胞質(zhì)膜上生長素輸入載體AUX1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，其受體TIR1與AUX/IAA互作，促進(jìn)AUX/IAA泛素化而降解，解除生長素對ARF活性的抑制作用[13-14]。隨著硒處理程度加深，冰菜葉片中AUX/IAA被泛素化降解，解除AUX對下游ARF活性的抑制作用，促進(jìn)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；另外，SAUR和GH3對硒處理的響應(yīng)較為復(fù)雜，且不具有規(guī)律性。胞外細(xì)胞分裂素與質(zhì)膜上受體蛋白(Cytokinin response1,CRE1)結(jié)合，使得CRE1發(fā)生自磷酸化，然后其磷酸基團(tuán)被傳遞至細(xì)胞質(zhì)中的AHP上，磷酸化的AHP進(jìn)入到細(xì)胞核中，再將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至B型擬南芥應(yīng)答調(diào)節(jié)子(B-Arabidopsis Response Regulators,B-ARR)，作為正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的B-ARR激活下游基因A-ARR等表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，A-ARR作為負(fù)調(diào)控因子，其累積反過來抑制B-ARR活性，從而抑制細(xì)胞分裂[15-16]。冰菜硒處理過程中，AHP對硒處理敏感，但對其濃度變化不敏感；A-ARR對硒處理顯著上調(diào)作用，但對濃度變化不敏感；硒處理M1與M2處理均能顯著性的提高A-ARR的表達(dá)量，顯著的抑制細(xì)胞分裂素的細(xì)胞分裂作用，抑制冰菜生長和發(fā)育作用。赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，隨著硒處理濃度增加而顯著提高，GID1與DELLA蛋白結(jié)合，異構(gòu)化DELLA蛋白空間構(gòu)象，異構(gòu)化后的DELLA蛋白在GID2作用下，進(jìn)行泛素化修飾后被26S蛋白酶降解，其下游TF得到激活[17-18]，促進(jìn)冰菜莖葉生長，但硒處理也對赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游TF(c37269)表達(dá)量顯著抑制作用。脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，低濃度硒處理(10 mmol/L)導(dǎo)致SnRK2表達(dá)量顯著降低，從而負(fù)調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子ABF，抑制氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致冰菜易脫水[19-20]；高濃度硒處理(100 mmol/L)SnRK2蛋白表達(dá)量顯著恢復(fù)。另外，硒處理對ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體蛋白PYR/PYL/RCAR家族基因影響比較復(fù)雜，無顯著規(guī)律。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，乙烯信號分子傳到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)乙烯受體蛋白(Ethylene receptor,ETR)上，ETR與下游乙烯抑制蛋白(Constitutive triple response 1,CTR1)互作，通過激酶磷酸化下游乙烯不敏感蛋白(Ethylene insensive 2,EIN2)，從而抑制EIN2下游的乙烯響應(yīng)途徑；此外，EIN2還受到EIN3結(jié)合F盒蛋白(EIN3-binding F-box protein1/2,EBF1/2)介導(dǎo)的泛素化蛋白酶降解調(diào)控，進(jìn)而抑制ERF等下游乙烯響應(yīng)基因[21-22]。隨著硒處理濃度的提高，ETR和ERF1/2表達(dá)量降低，抑制EIN2和ERF下游的乙烯響應(yīng)途徑，抑制冰菜成熟和衰老[23]。茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，JA在JAR1酶催化下將異亮氨酸(Isoleucine,Ile)加到JA上，獲得活化性JA-Ile，活性JA-Ile大量積累，結(jié)合JA受體蛋白—冠毒素不敏感蛋白(Coronatine-insensitive protein 1,COI-1)，COI-1結(jié)合JAZ形成復(fù)合體，促進(jìn)JAZ泛素化而降解，進(jìn)而下游MYC2等轉(zhuǎn)錄因子釋放，激活JA下游響應(yīng)基因表達(dá)，調(diào)控植物非生物逆境響應(yīng)[24]。低濃度硒處理(10 mmol/L)促進(jìn)JAZ和MYC2表達(dá)量上調(diào)，調(diào)節(jié)硒對冰菜的逆境脅迫；高濃度硒處理(100 mmol/L)對JAZ和MYC2表達(dá)量影響不顯著，表明高濃度硒處理對茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑無顯著影響。水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，SA與細(xì)胞質(zhì)中受體蛋白—非發(fā)病相關(guān)蛋白表達(dá)子(Nonexpresser of Pathogenesis-Related genes,NPR1)受體結(jié)合，以寡聚體形式的NPR1解離為單體形式，單體NPR1進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TGA互作，共同激活下游基因表達(dá)，激活植物抗非生物逆境能力[25-26]。本實(shí)驗(yàn)中，TGA和PR-1在低硒處理(10 mmol/L)條件下，表達(dá)量無上下調(diào)表達(dá)，高硒處理(100 mmol/L)下，TGA表達(dá)量下調(diào)，PR-1表達(dá)量上調(diào)，其中PR-1上調(diào)表達(dá)量增加12倍，激活冰菜硒響應(yīng)能力。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR分析，其中7個(gè)DEGs得到的相對表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析趨勢完全一致。

4 小 結(jié)

利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，前期項(xiàng)目組初步對冰菜鹽脅迫相關(guān)代謝分析和關(guān)鍵基因挖掘[27]，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)開展冰菜硒處理試驗(yàn)，研究植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)硒處理的分子機(jī)制，為下一步研究硒調(diào)控過程的轉(zhuǎn)錄因子及其關(guān)鍵功能基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供參考。以上鹽脅迫、硒處理逆境冰菜分子機(jī)制的研究，有助于冰菜抗逆品種的改良及選育，并指導(dǎo)富硒冰菜生產(chǎn)實(shí)踐上具有重要意義。