王新亮

(1．濱州學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部，山東 濱州 256603； 2．濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603)

【研究意義】土壤鹽堿化嚴(yán)重影響植物的生長，黃河三角洲是中國甚至世界增長最快的河口三角洲之一[1]，也是我國沿海鹽堿地高度集中的地區(qū)，約有50%的土地屬于鹽堿地[2]。蘋果(Malus×domesticaBorkh.)是世界四大水果(蘋果、葡萄、柑桔和香蕉)之一[3]，也是我國種植面積和產(chǎn)量最多的水果，是果農(nóng)重要的經(jīng)濟(jì)來源，但土壤鹽堿化制約著蘋果種植業(yè)的發(fā)展[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factor，Hsf)對(duì)熱、干旱、鹽堿等多種非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。研究表明Hsf在真核生物中高度保守[5]，植物Hsf家族被分為A、B和C三個(gè)亞族[6-7]。植物中的Hsf至少含有 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)、寡聚化結(jié)構(gòu)域(OD)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核定位信號(hào)基序(NLS)，C端激活基序(AHA)是A亞族特有的，大部分 Hsf還含有核輸出信號(hào)(NES)結(jié)構(gòu)域[7-8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Hsf是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)在番茄、水稻、小麥、擬南芥和棗中分別至少存在26 個(gè)[9]、26 個(gè)[10-11]、56 個(gè)[12]、24 個(gè)[5]和21 個(gè)[7]Hsf。HsfA3可能在高溫、干旱和鹽脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[12-13]。HsfA2能調(diào)節(jié)番茄花藥熱脅迫保護(hù)機(jī)制的活性[14]。擬南芥HsfB1和HsfB2b能抑制熱誘導(dǎo)型Hsf的表達(dá)，但在熱脅迫條件下，他們同樣能誘導(dǎo)熱休克蛋白基因的表達(dá)，從而提高擬南芥的耐熱性[15]。水稻中的OsHsfC1b在ABA介導(dǎo)的耐鹽性中發(fā)揮著重要作用，而且它還參與滲透脅迫的響應(yīng)[16]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了解蘋果Hsf的生物信息、表達(dá)特性和功能信息，利用蘋果基因組GDDH13 v1.1，通過Hsf結(jié)構(gòu)域特異氨基酸序列檢索和關(guān)鍵詞搜索，篩選出36 個(gè)Hsf成員，并對(duì)其中33個(gè)含有完整結(jié)構(gòu)域的成員進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹、序列分析、表達(dá)分析與功能預(yù)測，旨在分析蘋果Hsf的基本信息和生物功能，以期為進(jìn)一步分析Hsf在調(diào)節(jié)蘋果響應(yīng)熱、鹽堿、干旱等非生物脅迫中的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

實(shí)驗(yàn)在濱州學(xué)院黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室苗圃中進(jìn)行。首先利用0.2% KMnO4浸泡平邑甜茶種子30 min，再用流水洗凈，然后與細(xì)沙混和均勻放在 4 ℃的冰箱中層積 60 d左右。露白的種子被種在育苗盤，育苗盤裝有種植土(土、蛭石、沙的體積比為 1︰2︰3)，發(fā)芽后用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液( pH = 6.8 ± 0.2)澆灌，每隔5 d 1次。6～8 片真葉時(shí)，平邑甜茶苗用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液(含有100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Na2SO4、 50 mmol/L NaHCO3，pH =8)處理，葉片和新根分別在第 0、1、3、6 天被收集，除根0 d為2個(gè)重復(fù)，其他樣品均為3 個(gè)重復(fù)，經(jīng)液氮處理后儲(chǔ)存于-80 ℃中。

1.2 RNA 提取與測序

用TRIzol(Invitrogen)法提取樣品總RNA。利用磁珠從總RNA中富集mRNA，再用打斷buffer使mRNA片段化，然后用隨機(jī)N6引物反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈，再形成雙鏈，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用熱變性得到PCR產(chǎn)物的單鏈，然后環(huán)化形成環(huán)狀DNA文庫。用BGISEQ-500平臺(tái)(華大基因，深圳)進(jìn)行測序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)純化得到高質(zhì)量序列，用 HISAT 將序列比對(duì)到蘋果參考基因組Malus×domesticaGDDH13 Whole Genome v1.1(https://www.rosaceae.org/species/malus/malus_x_domestica/genome_GDDH13_v1.1)[17]。

1.3 蘋果Hsf轉(zhuǎn)錄因子篩選與鑒定

利用Hsf結(jié)構(gòu)域特異氨基酸序列(Pfam登錄號(hào)：PF00447)，在蘋果基因組 GDDH13 v1.1蛋白序列中進(jìn)行BLAST并通過“Heat shock transcription factor”關(guān)鍵詞搜索篩選蘋果Hsf候選成員。候選Hsf蛋白通過 Pfam (http://pfam.xfam.org)[18]和NCBI Conserved Domain Database(CDD，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進(jìn)行確認(rèn)。

1.4 Hsf蛋白理化性質(zhì)、染色體定位與共線性分析

Hsf的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分別通過ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)[19]和WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行分析。

Hsf基因的染色體定位用 TBtools 軟件的 Amazing Gene Location From GTF/GFF 工具分析；共線性分析用 Quick Run MCScanX Wrapper 和Text Merge For MCScanX工具分析，然后使用 Circle Gene View工具可視化。

1.5 Hsf基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹與序列分析

擬南芥Hsf的氨基酸序列從擬南芥信息數(shù)據(jù)庫(TAIR https://www.arabidopsis.org/)獲得。系統(tǒng)進(jìn)化樹利用MEGA-X采用Neighbor-Joining (NJ)法構(gòu)建，bootstrap 設(shè)置為 1000。利用MEME 5.3.0版本(http://memesuite.org/tools/meme)分析保守基序(數(shù)目設(shè)為10，寬度為6～90 aa)[20]，通過 TBtools 軟件的Gene Structure View(Advanced)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析并可視化。

1.6 Hsf表達(dá)與功能預(yù)測

利用平邑甜茶的RNA-seq數(shù)據(jù)通過Excel繪制Hsf的表達(dá)熱圖，因?yàn)橛行┗蛟诟腿~片中的表達(dá)差異較大，所以先分別對(duì)根和葉片的Hsf表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后再繪制熱圖。利用AppleMDO數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.cau.edu.cn/AppleMDO/)[21]以GDDH13 v1.1 homology withArabidopsis為參考進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)分析，顯著水平設(shè)置為0.01。通過在線軟件 STRING[22](https://string-db.org)分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，物種來源選擇蘋果(Malusdomestica)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hsf轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定

利用Hsf結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，在GDR數(shù)據(jù)庫蘋果基因組(MalusxdomesticaGDDH13 Whole Genome v1.1)進(jìn)行BLAST并通過關(guān)鍵詞共檢索到37個(gè)蘋果候選Hsf，然后通過Pfam和NCBI Conserved Domain Database確認(rèn)36個(gè)含有顯著Hsf結(jié)構(gòu)域，其中有3個(gè)含有的Hsf結(jié)構(gòu)域不完整，因此本文只對(duì)33個(gè)含有完整Hsf結(jié)構(gòu)域的成員做了進(jìn)一步分析。表1列出了這些Hsf基因的定位、編碼蛋白的氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。這些含有完整結(jié)構(gòu)域的Hsf基因在除9號(hào)外的各個(gè)染色體上均有分布，它們的編碼蛋白的氨基酸數(shù)為189～530；分子量為21 703.71～58 972.96；等電點(diǎn)為4.55～8.58。通過亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，除MD00G1095900和MD02G1171800可能定位于葉綠體/細(xì)胞核中，MD05G1313700 可能定位于細(xì)胞核/線粒體中；其他Hsf蛋白均定位于細(xì)胞核中。

表1 蘋果 Hsf 基因及蛋白信息

2.2 Hsf基因的染色體定位與共線分析

串聯(lián)重復(fù)(Tandem duplication)、片段重復(fù)(segmental duplication)和轉(zhuǎn)位事件(transposition events)是基因家族表達(dá)的主要原因[23]。串聯(lián)重復(fù)是同一染色體上，200 kb內(nèi)的片段上存在 2 個(gè)或2 個(gè)以上同一家族基因[24]；而片段重復(fù)是不同染色體之間發(fā)生的基因重復(fù)事件[25]。基因組染色體定位分析顯示，不同染色體上的Hsf基因數(shù)量存在差異(圖1-A)。15號(hào)染色體含有5個(gè)含有完整結(jié)構(gòu)域的Hsf基因，而7條染色體(1、3、6、7、11、14和17號(hào)染色體)上各只含有1個(gè)Hsf基因。因此，圖1-A顯示蘋果Hsf基因沒有串聯(lián)重復(fù)，但共線性分析(圖1-B)顯示有 16對(duì)共24個(gè)蘋果Hsf基因存在片段重復(fù)。

2.3 Hsf蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

利用MEGA-X軟件構(gòu)建了蘋果與擬南芥Hsf家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2-A)。根據(jù)擬南芥的分組方法將這些Hsf家族成員分成11組，其中蘋果Hsf家族成員在A1組有4 個(gè)，A2組有2 個(gè)，A3組有2 個(gè)，A4組有3 個(gè)，A5組有2 個(gè)，A6/A7組有4 個(gè)，A9組有4 個(gè)；B1/B3組有5 個(gè)，B2組有3 個(gè)，B4組有2 個(gè)；C1組有2 個(gè)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示進(jìn)化樹同一分支上基因的結(jié)構(gòu)也相似(圖2-B)，但成員較多的組中，基因結(jié)構(gòu)差異較大。圖2-C顯示這33個(gè)Hsf蛋白均含基序1和基序3，進(jìn)化樹同一分支上的Hsf蛋白的保守基序的數(shù)量和序列相似度也較高。

2.4 平邑甜茶Hsf基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)分析

由圖3顯示，鹽堿脅迫1、3、6 d后的平邑甜茶幼苗葉和根中Hsf的表達(dá)情況，除MD15G1209400在葉片中沒有檢測到外，其他Hsf基因在根和葉中均檢測到一次及以上的表達(dá)。在鹽堿脅迫下，多數(shù)Hsf基因的表達(dá)顯著下調(diào)。只有MD05G1213800、MD10G1197700、MD15G1283700在根和葉中的表達(dá)同時(shí)上調(diào)。

2.5 蘋果Hsf蛋白GO分析

為了進(jìn)一步了解蘋果Hsf的功能，利用AppleMDO數(shù)據(jù)庫的對(duì)這33個(gè)Hsf進(jìn)行了GO功能分析。由表2顯示，共涉及到36個(gè)GO條目，其中生物過程25個(gè)、分子功能4個(gè)、細(xì)胞組成 6個(gè)。除生物過程中的6個(gè)條目(次生代謝過程、分解代謝過程、對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、對(duì)脅迫的反應(yīng)、對(duì)非生物刺激的反應(yīng)、對(duì)刺激的反應(yīng))參與的基因較少，其余條目均有33個(gè)Hsf參與。

表2 蘋果Hsf蛋白GO分析

2.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

挑選了表達(dá)量較高且差異較大的下調(diào)基因MD03G1258300和上調(diào)基因MD15G1283700，利用STRING 在線軟件構(gòu)建了蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4)，MD03G1258300與熱激蛋白(Hsp40)、超氧化物歧化酶銅分子伴侶(copper chaperone for superoxide dismutase，CCS)、蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C，PP2C)、 蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶γ調(diào)節(jié)亞基(SNF1-related protein kinase regulatory subunit gamma-like PV42a，SnRK1-PV42a)相互作用；MD15G1283700與熱激蛋白(Hsp90、Hsp83)、IAA氨基酸水解酶(IAA-amino acid hydrolase ILRl-like，ILR1)、堿性亮氨酸拉鏈(Basic region/leucine zipper 60,bZIP60)相互作用。

3 討 論

本研究利用Hsf保守結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵詞檢索，鑒定了36 個(gè)蘋果Hsf家族成員，這與張國俊等[26]鑒定的數(shù)目不同，這可能是由于所使用的基因組版本不同引起的。本文只對(duì)33 個(gè)含有完整Hsf結(jié)構(gòu)域的成員做了進(jìn)一步分析。這33 個(gè)Hsf基因編碼的蛋白質(zhì)含有189～530 個(gè)氨基酸，分子量為21 703.71～58 972.96，等電點(diǎn)為4.55～8.58，與棗和南瓜中Hsf類似[7,27]。

染色體定位和共線性分析顯示蘋果Hsf基因沒有串聯(lián)重復(fù)，但有16對(duì)共24 個(gè)蘋果Hsf基因存在片段重復(fù)，表明片段重復(fù)可能在蘋果的Hsf基因家族進(jìn)化和擴(kuò)增中發(fā)揮這重要作用。Velasco等[28]報(bào)道稱蘋果相對(duì)較近的一次基因組重復(fù)發(fā)生在至少5 千萬年前，導(dǎo)致蘋果染色體由9 條變成為17 條。蘋果基因組重復(fù)可能在基因家族擴(kuò)張中起了重要作用。

系統(tǒng)進(jìn)化樹可以為同源基因功能的預(yù)測提供參考。擬南芥65%以上的熱脅迫上調(diào)基因受AtHSFA1(AtHSFA1a、b、d、e)的調(diào)控，這 4個(gè)基因不僅在熱脅迫中起著重要作用，還調(diào)控?cái)M南芥的生長和發(fā)育[29]。因此，與AtHSFA1a、b、d、e在同一分支上的MD05G1213800、 MD06G1037900、MD10G1197700和MD16G1271200可能也具有類似的功能。HsfB1和HsfB2b除了能提高擬南芥耐熱能力還具有提高抗病的能力[30]。MD02G1171800、MD04G1064700和MD15G1283700與上述2個(gè)基因較近，那么它們可能參與調(diào)節(jié)蘋果的抗病性。

研究表明Hsf不僅是熱應(yīng)激防御反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子[31]，還能調(diào)控植物對(duì)干旱、鹽堿等非生物脅迫的響應(yīng)。本研究中除MD15G1209400在葉片中沒有表達(dá)外，其他Hsf基因的表達(dá)均受到鹽堿處理影響。鹽堿脅迫下，平邑甜茶大部分Hsf基因的表達(dá)下調(diào)，只有MD05G1213800、MD10G1197700、MD15G1283700的表達(dá)上調(diào)。表明蘋果Hsf家族成員可能在調(diào)控鹽堿脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

GO功能分析顯示Hsf共涉及到36個(gè)GO條目，除DNA結(jié)合等GO條目外，還包括多種生物合成和代謝過程，以及對(duì)刺激和脅迫的反應(yīng)生物過程，表明蘋果Hsf可能不僅在調(diào)控脅迫響應(yīng)中起重要作用，而且調(diào)節(jié)其生長和發(fā)育。對(duì)MD03G1258300和MD15G1283700構(gòu)建了蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，MD03G1258300與Hsp40、CCS、PP2C、SnRK1-PV42a相互作用；MD15G1283700與Hsp90、Hsp83、ILR1、bZIP60相互作用。Hsf和Hsp是熱應(yīng)激防御反應(yīng)中的兩個(gè)重要成員。植物Hsf通過與‘nGAAnnTCCn’特別結(jié)合來調(diào)控Hsp基因的表達(dá)，Hsp能穩(wěn)定染色質(zhì)和膜，促進(jìn)蛋白質(zhì)修復(fù)，提高植物耐熱性并促進(jìn)植物熱損傷的恢復(fù)[32]。Boyd 等[33]發(fā)現(xiàn)CCS1能通過提供一個(gè)銅離子及催化每個(gè)未成熟的銅—鋅超氧化物歧化酶(copper-zinc superoxide dismutase,SOD1)內(nèi)二硫鍵的氧化來激活SOD1。PP2C可以通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來參與植物非生物脅迫響應(yīng)[34]。在植物中，SnRK1是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α-催化亞基和β、γ兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成，PV42a是SnRK1的γ亞基[35]。SnRK1可以通過蔗糖合成酶(SS)控制碳水化合物代謝，能調(diào)節(jié)如3-羥基-3-甲基戊二?！o酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)、磷酸蔗糖合成酶 (SPS)、硝酸還原酶(NR)，而且它還在碳和氨基酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[36]。有研究表明，在玉米原生質(zhì)體中，HSFTF13(HsfA6b成員)的啟動(dòng)子是bZIP60的一個(gè)靶標(biāo)。bzip60突變體中，HSFTF13的表達(dá)降低并且高溫下的熱應(yīng)激反應(yīng)鈍化，Hsp基因在高溫下的表達(dá)不能正常上調(diào)[37]。因此，Hsf可以通過調(diào)節(jié)熱激蛋白，活性氧清除酶等多種功能基因來調(diào)節(jié)植物抗逆反應(yīng)[38]。

4 結(jié) 論

本研究在蘋果基因組GDDH13 v1.1中檢索找到36個(gè)Hsf家族成員，然后對(duì)其中33個(gè)含有完整Hsf結(jié)構(gòu)域的基因做了進(jìn)一步分析。這些熱激轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)含有189～530個(gè)氨基酸數(shù)，分子量為21 703.71～58 972.96，等電點(diǎn)為4.55～8.58，它們多數(shù)定位于細(xì)胞核中。染色體定位和共線性分析顯示蘋果Hsf基因沒有串聯(lián)重復(fù)，但有16對(duì)共24個(gè)蘋果Hsf基因存在片段重復(fù)。在鹽堿脅迫下，多數(shù)Hsf基因的表達(dá)顯著下調(diào)。蘋果Hsf家族成員可能在調(diào)控鹽堿脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。