袁若男，楊慧贊，黃黎明，黃 崢，杜雪松，馬 元，呂 敏，王 瑞

(廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

【研究意義】紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)屬十足目甲殼類(lèi)動(dòng)物，原產(chǎn)于澳大利亞，具有體型大、繁殖力強(qiáng)和生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，是優(yōu)質(zhì)淡水養(yǎng)殖蝦種[1]。但在紅螯螯蝦養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，同一養(yǎng)殖池塘中既有個(gè)體大的紅螯螯蝦，也有個(gè)體小的紅螯螯蝦，且個(gè)體大小差異明顯，不利于紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。腸道是蝦類(lèi)重要的消化吸收器官，不同的腸道微生物在蝦類(lèi)腸道中共同生存、相互制約，形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的微生物結(jié)構(gòu)[2]。利用復(fù)合菌劑可緩解高密度養(yǎng)殖紅螯螯蝦腸道菌群群落間的競(jìng)爭(zhēng)，顯著減弱環(huán)境脅迫相關(guān)的代謝(膜運(yùn)輸和細(xì)胞運(yùn)動(dòng))，也可顯著降低基于碳、氮、磷基本營(yíng)養(yǎng)元素的代謝(脂肪代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝)，提高紅螯螯蝦的免疫力和存活率[3]。因此，探究紅螯螯蝦腸道微生物與其個(gè)體大小間的關(guān)系，對(duì)篩選蝦類(lèi)益生菌、促進(jìn)紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究認(rèn)為，在缺乏腸道微生物情況下宿主的正常發(fā)育受阻，免疫功能收到損害[4]，潛在的有害菌和益生菌均是宿主腸道微生物群的重要成員[5]，腸道有害菌在許多系統(tǒng)性疾病如乳糜瀉[6]和帕金森病[7]的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮直接作用[8]，通過(guò)增加有益菌群改變腸道微生物組成，可提高有益代謝產(chǎn)物的生成，增強(qiáng)宿主對(duì)病原體的抵抗力，促進(jìn)宿主生長(zhǎng)[9]。微生物在腸道中定殖且在宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝、病原防御和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，其中一些微生物在促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)代謝方面既可作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源供宿主利用，也可產(chǎn)生一些酶促進(jìn)宿主對(duì)食物的消化，從而使宿主獲得有利于自身生長(zhǎng)發(fā)育和維持健康所需的營(yíng)養(yǎng)[10-11]。乳酸桿菌因其產(chǎn)生抗微生物物質(zhì)(乳酸和細(xì)菌素)、消化酶(淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等)和輔酶(葉酸和鈷胺素)等被認(rèn)為是非常重要的有益菌[12-13]，其分泌的細(xì)菌素可降低動(dòng)物腸道的pH，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)改變腸道的群落結(jié)構(gòu)，減少病原菌的生存機(jī)會(huì)[14]。Panigrahi等[15]研究表明，在生物絮凝系統(tǒng)中添加芽孢桿菌可提高印度白對(duì)蝦(Penaeusindicus)的生長(zhǎng)速度和免疫力。Du等[16]用戊糖乳桿菌HC-2喂養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，能改善其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用，顯著提高其免疫基因表達(dá)、免疫酶活性和消化酶活性。Shui等[17]研究認(rèn)為，在相同條件下飼養(yǎng)的紅色沼澤小龍蝦，其腸道微生物群存在的差異可能不是養(yǎng)殖水體中微生物差異的簡(jiǎn)單反映，而是物種特異性飲食、腸道形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)水平和系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果。在腸道細(xì)菌與其個(gè)體大小的關(guān)系方面，Wu等[5]研究表明，放線(xiàn)菌是一類(lèi)能在草魚(yú)腸道中發(fā)揮分解纖維素作用的細(xì)菌；王微微等[10]對(duì)比大、小個(gè)體草魚(yú)腸道微生物差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放線(xiàn)菌僅存在于大個(gè)體草魚(yú)腸道中，且大個(gè)體草魚(yú)具有較強(qiáng)的纖維素消化降解能力；Ni等[18]研究發(fā)現(xiàn)，同一池塘中大個(gè)體草魚(yú)可能會(huì)搶占食物資源，并抑制小個(gè)體草魚(yú)的攝食行為，造成小個(gè)體草魚(yú)營(yíng)養(yǎng)攝入不足，致使得小個(gè)體草魚(yú)腸道黏膜中厚壁菌門(mén)比例較少。Semova等[19]研究結(jié)果顯示，大個(gè)體草魚(yú)的腸道黏膜微生物中擁有比小個(gè)體草魚(yú)更高比例的厚壁菌門(mén)，可能與厚壁菌門(mén)細(xì)菌能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞吸收有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)紅螯螯蝦的腸道微生物對(duì)其個(gè)體生長(zhǎng)影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)池塘養(yǎng)殖紅螯螯蝦的腸道16S rDNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，探究紅螯螯蝦個(gè)體大小與腸道細(xì)菌組成及其多樣性和功能的關(guān)系，為紅螯螯蝦益生菌篩選及健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅螯螯蝦采自廣西南寧市蘇圩鎮(zhèn)同一池塘同一批次放養(yǎng)的紅螯螯蝦養(yǎng)殖基地，池塘水溫27.2 ℃。樣品分為大個(gè)體組(PB組)和小個(gè)體組(PS組)，每組3個(gè)重復(fù)。無(wú)菌采集紅螯螯蝦的后腸，將5尾的后腸及其內(nèi)容物混合為1個(gè)重復(fù)，保存于-80 ℃冰箱備用。紅螯螯蝦個(gè)體樣本信息如表1所示。

1.2 細(xì)菌基因DNA提取及高通量測(cè)序

從-80 ℃冰箱中取出紅螯螯蝦樣品，冰上融化后，按照HiPure Stool DNA Kit[購(gòu)自Magen(中國(guó))生物公司]說(shuō)明提取總DNA。采用PCR擴(kuò)增腸道菌群16S rDNA基因的V3～V4區(qū)序列，使用引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×KOD Buffer 5.0 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，KOD聚合酶1.0 μL，MgSO4(25 mmol/L)3.0 μL，DNA模板100 ng，補(bǔ)超純水至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，參考AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(購(gòu)自Axygen Biosciences公司，美國(guó))說(shuō)明進(jìn)行回收，采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行定量后送至廣州基迪奧生物科技有限公司在Illumina平臺(tái)進(jìn)行PE250測(cè)序。

表1 池塘養(yǎng)殖的紅螯螯蝦樣品信息

1.3 高通量測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析

紅螯螯蝦腸道細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果借助基迪奧公司在線(xiàn)實(shí)時(shí)交互式數(shù)據(jù)分析平臺(tái)Omicsmart(http://www.omicsmart.com)進(jìn)行分析。主要分析步驟：Illumina MiSeq高通量測(cè)序，序列拼接和質(zhì)控；采用USEARCH的UPARSE算法進(jìn)行樣品運(yùn)算分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)分析，相似度大于97%的序列聚為一類(lèi)，計(jì)算獲得每個(gè)OTU在各樣品中的Tags絕對(duì)豐度和相對(duì)信息；采用RDP Classifier的Na?ve bayesian assignment算法，參考Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)的物種注釋(設(shè)定置信度的閾值為0.8～1.0)對(duì)代表性O(shè)TUs進(jìn)行物種注釋?zhuān)贿M(jìn)行Alpha多樣性(Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))分析；在生物學(xué)分類(lèi)的門(mén)、目、屬水平進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度分析；使用Tax4Fun對(duì)16S序列的SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋進(jìn)行KEGG功能預(yù)測(cè)及KO豐度統(tǒng)計(jì)，預(yù)測(cè)功能通過(guò)Welch’s T檢驗(yàn)，獲得豐度均值顯著差異的功能聚類(lèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way-ANOVA)，以R語(yǔ)言Vegan包和Excel 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅螯螯蝦的個(gè)體生長(zhǎng)差異分析

由表2可知，PB組的15尾紅螯螯蝦平均體長(zhǎng)為(10.10±0.47)cm，平均體重為(77.05±10.99)g；PS組的15尾紅螯螯蝦平均體長(zhǎng)為(7.18±0.37)cm，平均體重為(24.40±3.67)g。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組紅螯螯蝦樣本的體長(zhǎng)和體質(zhì)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均存在極顯著差異(P<0.01，下同)。

2.2 腸道菌群16S rDNA基因的高通量測(cè)序結(jié)果分析

由表3可知，對(duì)紅螯螯蝦后腸樣品進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)優(yōu)化共獲得727 528個(gè)有效序列，其中有物種注釋序列661 047個(gè)。從圖1可看出，紅螯螯蝦腸道細(xì)菌中共檢出1433個(gè)OTUs，其中，PB組共檢出1211個(gè)(PB1、PB2和PB3分別檢出930、1083和1013個(gè))OTUs，PS組共檢出587個(gè)(PS1、PS2和PS3分別檢出663、732和633個(gè))OTUs；PB組和PS組腸道微生物共同的OTUs有365個(gè)(占總OTUs數(shù)的25.47%)，PB組和PS組腸道微生物各自獨(dú)有846和222個(gè)OTUs(分別占總OTUs數(shù)的59.04%和15.49%)，歸屬于23門(mén)51綱97目150科236屬。說(shuō)明PB組和PS組紅螯螯蝦腸道細(xì)菌種類(lèi)具有一定共性，但PB組紅螯螯蝦腸道細(xì)菌的種類(lèi)比PS組更豐富。

表2 PB組和PS組紅螯螯蝦的體型差異

2.3 紅螯螯蝦腸道細(xì)菌的菌群多樣性分析結(jié)果

紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果(表4)顯示，PB組的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均極顯著高于PS組，表明PB組菌群的物種豐富度極顯著高于PS組；PB組的Shannon指數(shù)極顯著高于PS組，說(shuō)明PB組菌群的多樣性極顯著高于PS組；PB組和PS組的覆蓋度分別為99.747%和99.750%，表明測(cè)序深度已基本覆蓋樣品的所有物種，未被檢測(cè)到菌種的概率極低，所得測(cè)序數(shù)據(jù)基本能代表細(xì)菌群的真實(shí)情況。從圖2可看出，所有樣品的稀釋曲線(xiàn)均趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可反映樣本中絕大多數(shù)微生物的信息。

2.4 紅螯螯蝦腸道細(xì)菌的群落組成分類(lèi)及比較

2.4.1 在門(mén)水平上的分類(lèi)及比較 從圖3可看出，紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落在門(mén)水平主要為變形菌門(mén)、軟壁菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、梭菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、古生菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和擬桿菌門(mén)；PB組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是厚壁菌門(mén)，在門(mén)組成中占比42.87%，PS組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是變形菌門(mén)，在門(mén)組成中占比59.77%；軟壁菌門(mén)在PB組和PS組的門(mén)組成中占比均較高，分別為27.19%和30.29%；浮霉菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和古生菌門(mén)在PB組門(mén)組成中占比高于在PS組的占比。此外，PB組的變形菌門(mén)在門(mén)組成中占比僅為18.45%，而PS組的厚壁菌門(mén)在門(mén)組成中占比僅6.79%。說(shuō)明池塘養(yǎng)殖大、小個(gè)體紅螯螯蝦的腸道細(xì)菌群落在門(mén)水平上具有一定共性也存在較大差異。

表3 不同樣本紅螯螯蝦腸道細(xì)菌的OTUs和Tags數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表4 PB組和PS組紅螯螯蝦腸道細(xì)菌的Alpha多樣性分析結(jié)果

2.4.2 在目水平上的分類(lèi)及比較 從圖4可看出，紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落相對(duì)豐度排名前10位的菌目分別為腸桿菌目、支原體目、梭菌目、乳桿菌目、假單胞菌目、出芽菌目、氣單胞菌目、弧菌目、葉綠體和芽單胞菌目；腸桿菌目在PS組目組成中占比57.01%，在PB組目組成中占比9.17%；梭菌目在PB組目組成中占比41.25%，在PS組目組成中占比1.11%；支原體目在PB組和PS組目組成中占比均較高，分別為26.89%和29.17%；乳桿菌目、假單胞菌、出芽菌目、氣單胞菌目和芽單胞菌目在PB組與PS組目組成中占比雖較低，但組間存在較大差異?？梢?jiàn)，池塘養(yǎng)殖大個(gè)體紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落梭菌目、假單胞菌目和出芽菌目等在目水平上的占比高于小個(gè)體紅螯螯蝦。

2.4.3 在屬水平上的分類(lèi)及比較 從圖5可看出，PB組紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落相對(duì)豐度大于1.00%的屬共有9個(gè)，分別為假絲酵母菌屬(Candidatus_bacilloplasm，26.87%)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter，4.99%)、 梭菌屬(Clostridium_sensustricto_ 1，30.83%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，3.76%)、氣單胞菌屬(Aeromonas，2.70%)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium_sensustricto_11，2.79%)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas，2.28%)、副桿菌屬(Paraclostridium，1.75%)和弧菌屬(Vibrio，1.25%)，而未鑒定的細(xì)菌屬占總細(xì)菌屬12.42%；PS組相對(duì)豐度大于1.00%的屬共有4個(gè)，分別為假絲酵母菌屬(29.00%)、檸檬酸桿菌屬(36.07%)、乳球菌屬(Lactococcus，4.53%)和不動(dòng)桿菌屬(1.18%)，而未鑒定的細(xì)菌屬占總細(xì)菌屬22.25%。說(shuō)明梭菌屬和梭狀芽胞桿菌屬是池塘養(yǎng)殖大個(gè)體紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落的特有菌屬。

2.5 紅螯螯蝦腸道的細(xì)菌群落功能分析

紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落通過(guò)KEGG功能預(yù)測(cè)及KO豐度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)富集的KEGG通路與代謝功能相關(guān)，排名前10位的功能聚類(lèi)分別為碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、翻譯、復(fù)制和修復(fù)及傳染病(圖6)。Welch’s T檢驗(yàn)結(jié)果(圖7)表明，PS組紅螯螯蝦腸道菌群的影響因子及聚糖生物合成與代謝功能的豐度顯著高于PB組(P<0.05，下同)，氨基酸代謝、外源生物降解與代謝、萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物的代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成及運(yùn)輸和分解物代謝功能的豐度顯著低于PB組。說(shuō)明池塘養(yǎng)殖的小個(gè)體紅螯螯蝦在脂代謝方面強(qiáng)于大個(gè)體，而大個(gè)體紅螯螯蝦在氨基酸代謝、聚酮類(lèi)代謝、外源生物降解和代謝、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等方面均強(qiáng)于小個(gè)體。

3 討 論

本研究基于16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)同一池塘、同一批次養(yǎng)殖的紅螯螯蝦腸道微生物V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，獲得大量、全面且深入的菌群信息，發(fā)現(xiàn)PB組與PS組紅螯螯蝦腸道細(xì)菌菌群具有一定共性，也存在較明顯差異。其中，PB組獨(dú)有的OTUs數(shù)為846個(gè)，占OTUs總數(shù)的59.04%，PS組獨(dú)有的OTUs數(shù)為222個(gè)，占OTUs總數(shù)的15.49%；Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，PB組腸道細(xì)菌的豐富度和多樣性均極顯著高于PS組，這種差異的產(chǎn)生可能與大個(gè)體紅螯螯蝦能優(yōu)先搶占食物資源和更好的生活空間、小個(gè)體紅螯螯蝦長(zhǎng)期處于更低社會(huì)等級(jí)及受到環(huán)境脅迫和攝食壓力較大有關(guān)[20]。

本研究結(jié)果顯示，在紅螯螯蝦后腸細(xì)菌群落門(mén)組成中，PS組的變形菌門(mén)占比59.77%，軟壁菌門(mén)占比30.29%、厚壁菌門(mén)占比6.79%，而PB組的變形菌門(mén)占比18.45%，軟壁菌門(mén)占比27.19%，厚壁菌門(mén)占比42.87%，說(shuō)明變形菌門(mén)在小個(gè)體紅螯螯蝦的腸道細(xì)菌中占較大比例，在大個(gè)體紅螯螯蝦的腸道細(xì)菌中所占比例相對(duì)較小，但厚壁菌門(mén)在大個(gè)體紅螯螯蝦的腸道細(xì)菌中占比較大，在小個(gè)體紅螯螯蝦的腸道細(xì)菌中所占比例相對(duì)較小，與前人研究結(jié)果[17，21-24]相似。

Guo等[23]研究表明，暴露于亞硝酸鹽和硫化物中的克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，其腸道細(xì)菌多樣性降低，組成受到破壞，微生物群落功能及其穩(wěn)定性受到損害。張棋麟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于氯化汞中的斑馬魚(yú)，其腸道菌群在門(mén)水平的相對(duì)豐度受到顯著影響，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著下降。Jin等[26]研究結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)暴露于高濃度殺菌劑抑菌唑21 d后，其腸道內(nèi)變形菌門(mén)相對(duì)豐度降低，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高。Shu等[27]研究認(rèn)為，變形菌門(mén)已被鑒定為活性污泥中最豐富的菌門(mén)之一，在降解復(fù)合碳和去除氮方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。變形菌門(mén)是蝦類(lèi)腸道中最豐富、定殖最有效的細(xì)菌菌門(mén)，其豐度增加會(huì)提高蝦類(lèi)的潛在疾病風(fēng)險(xiǎn)[22，28]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，小個(gè)體紅螯螯蝦腸道菌群的變形菌門(mén)在其門(mén)組成中的占比顯著高于大個(gè)體紅螯螯蝦，說(shuō)明小個(gè)體紅螯螯蝦可能更容易受到蝦類(lèi)疾病影響。厚壁菌門(mén)細(xì)菌是人類(lèi)和動(dòng)物(包括克氏原螯蝦[29])的主要有益菌，可產(chǎn)生短鏈脂肪酸為腸粘膜細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，有助于調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)環(huán)境[30]，依賴(lài)于飲食而富集且相對(duì)豐度與飲食熱量攝入呈正相關(guān)[19]，可提高魚(yú)類(lèi)對(duì)食物的消化率和免疫性能，抵御腸道致病菌的破壞作用[31-32]，還可通過(guò)調(diào)節(jié)乳酸菌和鏈球菌增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)的氨基酸合成和代謝途徑[33]。本研究中，大個(gè)體紅螯螯蝦腸道菌群厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度明顯高于小個(gè)體紅螯螯蝦，表明大個(gè)體紅螯螯蝦可能更容易消化食物，具有更高的免疫力。

4 結(jié) 論

大個(gè)體紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群的豐富度和多樣性極顯著高于小個(gè)體紅螯螯蝦，有益菌的相對(duì)豐度高于小個(gè)體紅螯螯蝦，腸道細(xì)菌功能中的氨基酸代謝、消化系統(tǒng)功能和免疫系統(tǒng)功能均顯著強(qiáng)于小個(gè)體紅螯螯蝦。因此，在相同的養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)方法下，紅螯螯蝦腸道細(xì)菌群落是影響紅螯螯蝦生長(zhǎng)性能、消化代謝和抗病能力的重要因素之一。