但 言，余鳳琴，李 雙，陳元坤，陳紅霖，李 燕，王恕橋

(重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所，重慶 401120)

【研究意義】腸道是魚類重要的消化和吸收器官[1]，腸道微生物存在于腸道壁、腸道黏膜及其內(nèi)容物中[2]，是魚類腸道的重要組成部分，對(duì)魚類提供屏障、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、提高免疫具有重要作用[1]。魚類生長(zhǎng)發(fā)育過程中腸道菌群結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化[3]。【前人研究進(jìn)展】目前，腸道微生物的研究主要集中在不同環(huán)境[4-5]及疾病條件[6-7]下腸道微生物的差異、變化。【本研究切入點(diǎn)】采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大口黑鱸不同生長(zhǎng)階段腸道微生物結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為大口鱸腸道微生態(tài)研究、鱸養(yǎng)殖技術(shù)改良、益生菌篩選、疾病預(yù)防提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其養(yǎng)殖

實(shí)驗(yàn)用魚為大口黑鱸(Micropterussalmoides)，養(yǎng)殖在重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所長(zhǎng)壽湖基地池塘中。實(shí)驗(yàn)用魚苗均為2019年孵出，當(dāng)年4月份購入并放入池塘，其間每日投餌2次(8:30、16:00)，飼料為鱸魚專用商品飼料(粗蛋白≥50%，粗脂肪≥8%，粗灰分≤16%)，日投喂量為初始體重的3%～5%，并根據(jù)攝食情況隨時(shí)調(diào)整。

1.2 樣品采集

共采集有效樣品33個(gè)，第一次采集為5月齡(2019年8月，A組)，之后根據(jù)實(shí)際情況采集6月齡(2019年9月，B組)，7月齡(2019年10月，C組)，9月齡(2019年12月，D組)，10月齡(2020年1月，E組)，12月齡(2020年3月，F(xiàn)組)，14月齡(2020年5月，G組)，15月齡(2020年6月，H組)，16月齡(2020年7月，I組)，共采集9組，每次下午采集大口黑鱸腸道去除內(nèi)容物置于5 mL凍存管中，置于-80 ℃的冰箱中保存待測(cè)。

1.3 DNA提取及16S rDNA高通量測(cè)序

樣品送至深圳微生太科技有限公司，根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提；用338F和806R引物對(duì)V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對(duì)回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，洗脫后利用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OUTs聚類和物種分類分析，并將OUT和物種注釋結(jié)合，從而得到樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對(duì)OTUs進(jìn)行豐度及多樣性分析，同時(shí)將物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，并以LEfSe分析組間菌群差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道微生物的α多樣性差異分析

各組大口黑鱸腸道微生物多樣性數(shù)據(jù)見表1，結(jié)果表明，5、6月齡OTU數(shù)量，Chao1指數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于其他月齡，在6月齡(B組)均為最大，說明此階段大口黑鱸腸道微生物多樣性最高。

2.2 不同生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道微生物種類組成差異分析

測(cè)得序列經(jīng)過鑒定，在門水平上相對(duì)豐度大于2%的有9門。A組優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(Firmicutes，40.78%)，B～F組的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(Proteobacteria)，G～I(xiàn)組的優(yōu)勢(shì)菌群為梭桿菌門(Fusobacteria)。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，變形菌門在A～D組呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)，隨后上下波動(dòng)；梭桿菌門在A～D組呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，在E～H組升高，隨后降低；厚壁菌門在A～E組呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，隨后波動(dòng)(表2)。

各生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道微生物在屬水平上相對(duì)豐度大于2%的有17屬。其中A組的優(yōu)勢(shì)種群為消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae，29.88%)，B、D組優(yōu)勢(shì)種群為歐文氏菌屬(Erwinia，15.76%)，C、E組的優(yōu)勢(shì)種群為支原體屬(Mycoplasma，35.24%)，D、E組優(yōu)勢(shì)種群為假單胞菌屬(Pseudomonas)，G～I(xiàn)組優(yōu)勢(shì)種群為鯨桿菌屬(Cetobacterium)。隨著時(shí)間推移，鯨桿菌屬占比呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，后期豐度大幅度提高；假單胞菌屬所占比例表現(xiàn)出A～E組升高后升高降低交替變化的趨勢(shì)。支原體在A～C組所占比例升高，D～E組降低，F(xiàn)～I(xiàn)組降低升高交替變化，鄰單胞菌屬(Plesiomonas)為G～I(xiàn)組腸道特有，拉恩氏菌屬(Rahnella)及肉食桿菌屬(Carnobacterium)為D～E組特有，歐文氏菌屬(Erwinia)在A和I組沒有分布(表3)。

表2 大口黑鱸腸道微生物樣品中主要門類所占比例

表3 大口黑鱸腸道微生物樣品中主要屬類所占比例

續(xù)表3Continued table 3

從屬水平物種表達(dá)譜熱圖(圖1,見封三)可以看出，大口黑鱸腸道微生物主要聚為兩大分支，多數(shù)B組和E、F、G、H、I組聚為一支，A組、C組及D組聚為一支，說明不同生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道微生物組成差異明顯。鯨桿菌屬(Cetobacterium)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)和腐敗希瓦氏菌屬(Shewanella)在B、E、F、G、H、I組中的豐度明顯高于A、C、D組；而支原體屬(Mycoplasma)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和歐文氏菌屬(Erwinia)則相反。

2.3 不同生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道微生物的菌群豐度差異分析

通過LEfSe分析組間菌群差異，結(jié)果顯示(圖2,見封三)，A組標(biāo)志微生物(與其他生長(zhǎng)階段豐度差異顯著)為藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、棲熱菌門(Thermi)，B組標(biāo)志微生物為披毛菌科(Gallionellaceae)，C組標(biāo)志微生物為腸球菌科(Enterococcaceae)，D組標(biāo)志微生物為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，E組標(biāo)志微生物為假單胞細(xì)菌科(Pseudomonadaceae)，H組標(biāo)志微生物為梭桿菌門(Fusobacteria)。

3 討 論

3.1 不同生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道菌群多樣性比較

本研究對(duì)大口黑鱸9個(gè)生長(zhǎng)階段共33個(gè)樣品的腸道細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行了高通量測(cè)序，通過α多樣性分析，5、6月齡OTU數(shù)量，Chao1指數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于其他月齡，在6月齡(B組)均為最大。佟延南等利用同樣方法對(duì)海南省多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)羅非魚腸道微生物進(jìn)行多樣性研究，結(jié)果顯示微生物多樣性養(yǎng)殖中期>養(yǎng)殖后期>養(yǎng)殖前期[8]，這與本研究結(jié)果存在相似點(diǎn)。不同地域、不同魚類腸道微生物多樣性均在養(yǎng)殖中期出現(xiàn)峰值，反映出可能與魚類生長(zhǎng)發(fā)育有較大的相關(guān)性。對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰[9]和斑馬魚[10]的研究結(jié)果也指出，魚類生長(zhǎng)發(fā)育過程中腸道微生物類群不斷變化，而且這種變化與水環(huán)境和飼料改變沒有必然聯(lián)系。

3.2 門和屬水平上不同生長(zhǎng)階段大口黑鱸腸道菌群結(jié)構(gòu)比較

在門水平上的分析結(jié)果顯示，變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門是大口黑鱸腸道的優(yōu)勢(shì)菌，在15月齡(H組)二者所占比例之和達(dá)到93%以上。雷陽等對(duì)雙斑東方鲀腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群主要為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門，其中變形菌門為野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌，梭桿菌門在野生雙斑東方鲀腸道中占有很大比例[11]。蘇月華等研究表明白甲魚腸道細(xì)菌以梭桿菌門、變形菌門、螺旋菌門、厚壁菌門和軟壁菌門為主，其中梭桿菌門占比達(dá)到70%以上[12]。Wu等用高通量測(cè)序方法對(duì)草魚、黃顙魚腸道菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其主要為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門[13-14]。以上研究表明，變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門是大多數(shù)魚類腸道微生物的主要菌群。變形菌門是細(xì)菌中較大的一個(gè)門類，廣泛分布于環(huán)境和動(dòng)植物體內(nèi)[15-19]，門內(nèi)種類繁多，在哺乳動(dòng)物中變形菌門被視為腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志，研究中變形菌門一直為菌群優(yōu)勢(shì)種類，而對(duì)其他肉食性魚類如虹鱒[20]、鱖[21]的研究也表明，變形菌門豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。由此可見變形菌門對(duì)宿主的作用機(jī)制復(fù)雜，尤其對(duì)魚類作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。厚壁菌門比例上升在哺乳動(dòng)物中提示為肥胖病，與糖尿病密切相關(guān)，而厚壁菌門卻為魚類腸道菌群主要成員；Semova等對(duì)無菌斑馬魚的研究表明，腸道菌群可以促進(jìn)腸上皮及肝組織中的脂肪的吸收并促進(jìn)脂滴的形成，其中厚壁菌門起到了關(guān)鍵作用[22]。本研究表明大口黑鱸生長(zhǎng)過程中厚壁菌門比例逐步下降，可能提示魚類養(yǎng)殖后期面對(duì)脂肪沉積、糖尿病方面的疾病壓力更小。梭桿菌門是一類兼性厭氧微生物，能夠發(fā)酵多糖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生以乙醇和短鏈脂肪酸，其中短鏈脂肪酸是魚腸道中重要的有機(jī)酸，腸道內(nèi)壁細(xì)胞基本的代謝能量來源于此，本研究中梭桿菌門在生長(zhǎng)后期占比明顯增高。

屬水平上的分析結(jié)果顯示，鯨桿菌屬、假單胞菌屬、支原體屬所占比例較大，其中鯨桿菌屬在15月齡所占比例達(dá)到90.21%。張婧怡等[5]、Tsuchiya等[23]和Kessel等[24]研究表明，羅非魚不同環(huán)境不同階段腸道鯨桿菌屬豐度均較高。胡俊在對(duì)魚類腸道粘附菌群探究中認(rèn)為鯨桿菌屬具有更好的定植能力[25]。此外，鯨桿菌屬能夠發(fā)酵多肽碳水化合物，產(chǎn)生維生素B12，研究中在梭桿菌門中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，在養(yǎng)殖后期鯨桿菌顯著增多。以上研究表明，鯨桿菌屬是魚類腸道菌群的重要組成部分，豐度可能與魚類發(fā)育相關(guān)。假單胞菌屬為一種條件病原體，在環(huán)境良好的情況下，可產(chǎn)生多種抗生素和活性小分子物質(zhì)，具有抗菌溶菌作用，而在惡劣的環(huán)境下會(huì)使魚體表面潰爛，體內(nèi)腫脹充血等[26]。沈錦玉等從浙江寧波、臺(tái)州網(wǎng)箱養(yǎng)殖死亡大黃魚體內(nèi)分離和鑒定出致病力極強(qiáng)的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[27]，劉年鋒等對(duì)福州地區(qū)內(nèi)臟出現(xiàn)白點(diǎn)的網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚進(jìn)行研究，分離鑒定出優(yōu)勢(shì)致病菌變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[28]。以上研究表明，假單胞菌屬易對(duì)宿主產(chǎn)生脅迫作用，需要關(guān)注。支原體屬廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，研究中7月齡(C組)相對(duì)豐度為35.24%。Holben等研究表明，支原體屬在養(yǎng)殖大馬哈魚(Salmosalar)腸道中的相對(duì)豐度分別為25%、81%，在野生大馬哈魚中的相對(duì)豐度為96%[29]；Li等對(duì)揚(yáng)子江上游圓口銅魚(Coreiusguichenoti)的腸道菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雌性魚以支原體屬為主[30]。以上研究表明，支原體屬在魚類腸道中廣泛存在。

4 結(jié) 論

不同生長(zhǎng)階段的大口黑鱸腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯；多樣性在養(yǎng)殖前期較高；厚壁菌門在生長(zhǎng)過程中逐步減少；梭桿菌門在生長(zhǎng)過程中逐步增加，其中鯨桿菌屬起絕對(duì)作用。在養(yǎng)殖大口黑鱸的過程中，應(yīng)注意結(jié)合生長(zhǎng)發(fā)育情況，注意腸道微生物菌群調(diào)控，提高養(yǎng)殖和疾病防治水平。