張澤錦,王力明,梁 穎,李躍建,唐 麗*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610066; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610066; 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,四川 成都 610066)

【研究意義】萵筍是萵苣六大栽培類型之一，為菊科一、二年生蔬菜，以肥大的肉莖為食用器官的一類蔬菜，在中國(guó)有著悠久的栽培歷史[1]，在我國(guó)南方地區(qū)廣為栽培[2]。萵筍是四川高山地區(qū)夏季種植的主要錯(cuò)季蔬菜，以川西面積最大。其中，四川阿壩藏族羌族自治州夏季萵筍播種面積在0.53萬(wàn)hm2，5月中下旬至10月上旬上市，正好填補(bǔ)了四川平壩丘陵區(qū)夏季葉菜“淡季”，市場(chǎng)行情好，種植戶經(jīng)濟(jì)效益可觀?！叭唷比n筍(LactucasativaL.var.angustanaIrishex Bremer)因其具有青皮、青肉、青葉而得名，其營(yíng)養(yǎng)豐富，皮薄肉厚，質(zhì)脆嫩，味清香，深受消費(fèi)者喜愛，但是，“三青”萵筍因其品種特性，自然生長(zhǎng)過(guò)程中常存在節(jié)間距短、植株矮小、莖桿短、商品性差的問(wèn)題。在實(shí)際生產(chǎn)上常通過(guò)赤霉素(GA3)處理來(lái)提高萵筍節(jié)間和株高，但是其具體機(jī)理和安全性尚不明確。本試驗(yàn)通過(guò)噴施不同濃度的GA3，研究了GA3對(duì)萵筍不同時(shí)期株高和莖粗的影響；通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)定，揭示了GA3對(duì)萵筍光合電子傳遞性能、氰化物含量的作用機(jī)制。【前人研究進(jìn)展】GA3是一種重要的植物激素，它參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的全過(guò)程，其生理作用多種多樣，可以打破某些植物的休眠、促進(jìn)莖稈伸長(zhǎng)、葉片伸展、種子萌發(fā)、開花、果實(shí)發(fā)育等[3]。國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了外源GA3處理對(duì)蔬菜生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響。例如，Kuchlan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，噴施GA3提高了大豆株高，增加了籽粒產(chǎn)量。葉倩等[5]研究結(jié)果顯示，60 g/hm2GA3噴施莧菜，能顯著增加莧菜株高和產(chǎn)量。鄧惠惠等[6]研究表明，噴施GA3會(huì)促進(jìn)黃瓜植株莖的伸長(zhǎng)和增粗。【本研究切入點(diǎn)】在四川，外源GA3被廣泛用于提高“三青”萵筍株高和莖粗來(lái)提升商品價(jià)值，但有關(guān)研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確GA3對(duì)“三青”萵筍生長(zhǎng)、光合作用及氰化物含量的影響機(jī)制，為“三青”萵筍高效安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以“三青”萵筍(LactucasativaL.var.angustanaIrishex Bremer)為供試材料，品種為西龍高山青，購(gòu)自四川廣漢龍盛種業(yè)有限公司。GA3為分析純，購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年9—12月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園內(nèi)進(jìn)行。2020年9月2日，選擇大小均勻且飽滿的西龍高山青萵筍種子進(jìn)行浸種、催芽，待種子露白后播種于50孔育苗盤中育苗。2020年9月25日，挑選大小一致的萵筍幼苗定植于示范園大田小區(qū)中，小區(qū)長(zhǎng)2.0 m，寬1.5 m，每個(gè)小區(qū)種植15株，行距30 cm，株距30 cm，定植前施足基肥。當(dāng)萵筍幼苗5～6片葉展開時(shí)于10月21日早上9點(diǎn)噴施不同濃度的GA3。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，分別為噴施12.5 mg/L(T1)、25 mg/L(T2)、50 mg/L(T3)、100 mg/L(T4)GA3溶液，噴清水T0(CK)為對(duì)照，以葉片滴水為度。每個(gè)處理隨機(jī)排列，重復(fù)3次。生長(zhǎng)期間常規(guī)管理。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定及方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 分別在10月21日、11月1日、11月11日、11月21日及收獲時(shí)間11月25日進(jìn)行株高和莖粗測(cè)量。株高采用刻度尺測(cè)量，莖粗采用游標(biāo)卡尺測(cè)量。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定 11月21日利用雙通道熒光儀Dual-PAM-100(Walz，德國(guó))自動(dòng)測(cè)量程序，在葉片暗適應(yīng)180 min后測(cè)定噴施GA3(50 mg/L)和未噴施GA3(CK)萵筍中部葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線，JIP-test參數(shù)根據(jù)Strasser等(2000)計(jì)算得到[7]。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組分析 11月25日采收萵筍，取噴施GA3(50 mg/L)和未噴施GA3(CK)萵筍莖尖，將樣品放入液氮中速凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆?，每個(gè)處理取3個(gè)樣用于轉(zhuǎn)錄組分析。樣品的后續(xù)處理包括RNA抽提、純化、建庫(kù)以及采用第二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing,NGS)，基于Illumina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙末端(paired-end,PE)測(cè)序，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(參考基因組：Lsat_Salinas_v7；下載鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002870075.1/)。以上工作由上海派森諾生物有限公司完成。

1.3.4 氰化物測(cè)定 11月25日采收萵筍，參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測(cè)定(GB 5009.36—2016)第一法進(jìn)行測(cè)定，以氫氰酸含量表示氰化物含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用Excel 2013 進(jìn)行整理，用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著性檢驗(yàn)采用 Duncan 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GA3處理對(duì)“三青”萵筍株高的影響

由表1可知，噴施GA3當(dāng)天萵筍株高各處理間無(wú)顯著差異。之后每10 d測(cè)定萵筍株高，直至收獲。11月1日，噴施GA3均增加了萵筍株高，其中T2、T3和T4處理萵筍株高均顯著高于CK，分別增加了44.12%、50.61%和55.07%，但是三者間無(wú)顯著差異。在11月11日，萵筍株高變化趨勢(shì)與11月1日一致，T1與CK無(wú)顯著差異，其余處理均顯著高于CK，但是T3處理萵筍株高最大，為30.50 cm，較CK增加了28.15%。在11月21日和11月25日時(shí)，與CK相比，GA3處理萵筍株高均顯著增加，11月21日萵筍株高分別增加了19.98%、47.63%、50.10%以及54.48%，11月25日萵筍株高分別增加了16.22%、41.51%、43.16%以及55.52%。

表1 噴施GA3對(duì)“三青”萵筍株高的影響

2.2 不同濃度GA3處理對(duì)“三青”萵筍莖粗的影響

由表2可知，在11月1日、11月11日和11月21日，噴施不同濃度GA3均增加了萵筍莖粗。在11月1日，與CK相比，各處理(T1、T2、T3和T4處理)萵筍莖粗分別增加了7.45%、17.16%、45.03%以及40.92%。在11月11日，與CK相比，各處理萵筍莖粗分別增加了1.71%、10.50%、21.19%以及20.60%。在11月21日，與CK相比，各處理萵筍莖粗分別增加了6.12%、7.99%、11.68%以及8.26%。

2.3 GA3處理對(duì)“三青”萵筍葉片光合電子傳遞性能的影響

表3～4顯示，GA3處理對(duì)葉片PSⅡ反應(yīng)中心能量分配和光合性能指標(biāo)的影響。噴施GA3，單位活性反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、捕獲的光能(TRo/RC)、用于電子傳遞的能量(ETo/RC)和熱耗散的光能(DIo/RC)顯著增加，相比對(duì)照分別增加2.6%、2.5%、4.7%及4.9%。最大光化學(xué)效率(φPo)與對(duì)照無(wú)顯著差異；光合反應(yīng)中心數(shù)目(RC/ABS)、2 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心的開放程度(Ψo)及以吸收光能為基礎(chǔ)的光合性能指數(shù)(PIABS)均顯著增加，相比對(duì)照分別增加2.5%、2.3%及9.2%。由此可見噴施GA3通過(guò)提高PSⅡ光合反應(yīng)中心吸收和捕獲光的能力和PSⅡ向下游傳遞電子的數(shù)量，最終提高了萵筍葉片光合電子傳遞效率。

2.4 GA3處理對(duì)“三青”萵筍氰化物含量的影響

由圖1可知，噴施GA3增加了萵筍莖稈氰化物的積累。噴施50 mg/L GA3時(shí)，“三青”萵筍氰化物含量為0.583 mg/kg，顯著高于CK。與CK相比，增加了112.77%。

表2 噴施GA3對(duì)“三青”萵筍莖粗的影響

表3 噴施GA3對(duì)“三青”萵筍葉片光合電子傳遞性能的影響

表4 噴施GA3對(duì)“三青”萵筍葉片光合電子傳遞性能的影響

2.5 GA3處理對(duì)萵筍光合電子傳遞和氰化物影響的轉(zhuǎn)錄組分析

噴施GA3后，萵筍有顯著差異的代謝通路有14個(gè)(圖2)，其中光合作用(Photosynthesis)和氰基氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)途徑是其中2個(gè)。光合作用(Photosynthesis)途徑中LOC111897400(psbS)、LOC111897632(petH)、LOC111895461(petC)、LOC111890958(ATPF1G,atpG)、LOC111905179(psbQ)、LOC111903099(psbQ)基因上調(diào)；氰基氨基酸代謝途徑中LOC111895989(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、LOC111879508((R)-扁桃腈裂解酶)及LOC111910046(β-葡萄糖苷酶)3個(gè)基因上調(diào)。

2.6 GA3處理對(duì)萵筍光合電子傳遞和氰化物影響的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq的結(jié)果，對(duì)以上2個(gè)途徑中的8個(gè)上調(diào)的差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖3)。

噴施GA3后，光合作用代謝途徑中LOC111897400(psbS)、LOC111897632(petH)、LOC111895461(petC)、LOC111890958(atpG)和LOC111903099(psbQ)5個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量分別增加148%、182%、145%、166%及224%；氰基氨基酸代謝中LOC111895989(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、LOC111879508[(R)-扁桃腈裂解酶]及LOC111910046(β-葡萄糖苷酶)3個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量分別增加152%、632%及246%。結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以表征噴施GA3后萵筍光合作用和氰基氨基酸代謝中轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。

3 討 論

GA3參與調(diào)控種子萌發(fā)、莖稈伸長(zhǎng)、成花轉(zhuǎn)變及花和果實(shí)的發(fā)育等過(guò)程。GA3在植物體內(nèi)中的細(xì)胞質(zhì)中主要由GA3氧化酶(GA3ox2)和GA2氧化酶(GA20ox)催化GA12成為較高生物活性的GA3GA1和GA4，對(duì)植物表型產(chǎn)生作用[8]。GA3可以誘導(dǎo)水稻[9]、大豆[10]、油菜[11]、甘蔗[12]等植物的的節(jié)間伸長(zhǎng)。外源噴施GA3被植物直接吸收利用，增加萵筍莖干中細(xì)胞分化和拉伸，最終增加萵筍的株高和莖粗。

噴施GA3對(duì)不同作物的光合能力影響不同，噴施20 mg/L GA3可明顯提高冬棗葉片凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度[13]。噴施4.0 mg/L GA3能顯著影響鳳梨釋迦的葉片葉綠素?zé)晒馓匦?，提高PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量[14]。GA3處理后葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fm、Fv/Fm和ETR 出現(xiàn)不同程度的降低，NPQ 較對(duì)照顯著升高[15]。噴施GA3后，萵筍葉片有關(guān)電子傳遞途徑上調(diào)控基因顯著上調(diào)。LOC111897400(psbS)調(diào)控光系統(tǒng)Ⅱ22 kDa蛋白(photosystem II 22 kDa protein)的表達(dá)，PsbS蛋白是PSⅡ處結(jié)合葉綠素結(jié)合蛋白[16]。PsbS蛋白在能量耗散中起著關(guān)鍵性的作用，這對(duì)于可變條件下，調(diào)節(jié)植物處于合適光合狀態(tài)至關(guān)重要[17]。過(guò)量表達(dá)PePsbS1和PePsbS2的轉(zhuǎn)基因擬南芥均顯示出增強(qiáng)的光保護(hù)作用[18]。LOC111897400(psbS)基因的上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明噴施GA3后提高了萵筍葉片自身光保護(hù)能力。LOC111895461(petC)調(diào)控細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體，該復(fù)合體在調(diào)節(jié)電子傳遞鏈的電子流向和PSII與PSI之間的狀態(tài)轉(zhuǎn)移等光合過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用[19]。LOC111895461(petC)的上調(diào)使得電子順利通過(guò)細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體進(jìn)入PSⅠ。光合電子傳遞中的鐵氧還蛋白NADP+氧還酶(FNR)則受LOC111897632(petH)的調(diào)控，在兩種桑樹的研究中表明，Morus002073(petH)基因上調(diào)的會(huì)導(dǎo)致該品種的光合速率的增高[20]。噴施GA3后，導(dǎo)致萵筍LOC111897632(petH)的上調(diào)表達(dá)，則可以生成更多的NADPH，用于光合作用中的碳固定。LOC111890958(atpG)調(diào)控ATP合成酶，LOC111890958(atpG)上調(diào)表達(dá)，使更多的氫離子通過(guò)ATP合酶泵出細(xì)胞膜外，同時(shí)產(chǎn)生更多的ATP用于光合作用的能量。光合電子傳遞鏈上有關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致萵筍葉片電子傳遞吸收、捕獲光的能力及PSⅡ向下游傳遞電子的數(shù)量提高，最終表現(xiàn)出吸收光能為基礎(chǔ)的光合性能指數(shù)(PIABS)增高。

植物自身就能合成氰化物，木薯、杏仁、竹筍等植物中就含有不同濃度的氰化物[21-23]，以含氰糖苷(cyanogenic glycoside)形式存在[24]。目前已發(fā)現(xiàn)50多種生氰糖苷類物質(zhì)存在于植物體內(nèi)[25]。外界環(huán)境的改變能提高植物體內(nèi)氰化物含量，如干旱可以使得高粱牧草中的氰化物含量增高[26]。噴施GA3后，萵筍體內(nèi)的氰氫酸是通過(guò)R-苯乙醇腈(R-mandelonitrile)經(jīng)過(guò)R-扁桃腈裂解酶(LOC111879508)生成；噴施GA3后，R-扁桃腈裂解酶(LOC111879508)表達(dá)顯著上調(diào)，所以使得氰氫酸生成增多。此外，在氫氰酸代謝途徑中，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(LOC111895989)和β-葡萄糖苷酶(LOC111910046)基因表達(dá)上調(diào)，可能分別使得代謝下游產(chǎn)物(s)-4-羥基扁桃腈[(s)-4-hydroxy mandelonitrile]、2-羥基-2-甲基丁腈(2-hydroxy-2-methyl-butanenitrile)、2-羥基-2-甲基丙腈(2-hydroxy-2-methyl-propanenitrile)及d-扁桃腈葡糖苷(prunasin)、甘氨酸(Glycine)增多，間接的導(dǎo)致氰氫酸的生成。噴施GA3后，“三青”萵筍氰化物含量增高，但是人類肝臟中硫氰酸酶可減輕氰化物的毒性作用[27]；含氰糖苷類物質(zhì)并不穩(wěn)定，易在酸性和加熱的條件下，自然分解或通過(guò)酶解產(chǎn)生有毒的HCN氣體[28]。Cardoso 等[29]設(shè)置氫氰酸對(duì)健康造成危險(xiǎn)的濃度是高于100 mg/kg，本次測(cè)定的“三青”萵筍品種可食部分氫氰酸含量低于此濃度，未對(duì)健康造成危險(xiǎn)，但還需開展更多“三青”萵筍品種的相關(guān)研究，對(duì)四川栽培過(guò)程中大面積應(yīng)用赤霉素拔節(jié)“三青”萵筍的方法的進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

4 結(jié) 論

(1)噴施不同濃度的GA3均增加了“三青”萵筍的株高和莖粗，噴施100 mg/L GA3，“三青”萵筍株高最大，噴施50 mg/L GA3，“三青”萵筍莖粗最大，兩者間無(wú)顯著差異，在生產(chǎn)中可根據(jù)實(shí)際情況選用相對(duì)應(yīng)的赤霉素濃度對(duì)“三青”萵筍進(jìn)行噴施。

(2)對(duì)比噴施GA3(50 mg/L)和不噴施GA3(CK)2個(gè)處理，噴施GA3顯著提高了“三青”萵筍的光合性能和氰化物含量，這是由于噴施赤霉素后，“三青”萵筍的光合作用代謝途徑中LOC111897400(psbS)、LOC111897632(petH)、LOC111895461(petC)、LOC111890958(atpG)和LOC111903099(psbQ)和氰基氨基酸代謝中LOC111895989(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、LOC111879508((R)-扁桃腈裂解酶)及LOC111910046(β-葡萄糖苷酶)的相對(duì)表達(dá)量增加而導(dǎo)致。