張躍華 楊風 續(xù)婷婷 朱書霞 陳格 趙紅

(青島大學附屬青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042)

慢性肝損傷由肝炎病毒、酒精、自身免疫、代謝、藥物等多種因素導致，如不及時治療，最終會發(fā)展為肝硬化，甚至肝衰竭[1]。因此，阻止慢性肝損傷的進展，具有重要的臨床意義，是當前國內(nèi)外研究的熱點。依帕司他是醛糖還原酶抑制劑，可以減少山梨醇生成，改善細胞內(nèi)高滲透壓狀態(tài)[2]；減少煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)消耗，改善NADPH/NADP+(NADPH的氧化形式)失衡，提高細胞抗氧化能力[3]。目前有研究表明，在酒精誘導的肝損傷小鼠中使用依帕司他，小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平下降，內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白表達減少[4]；依帕司他亦可改善蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導的小鼠肝損傷，減少腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6表達[5]；此外，依帕司他還可提高機體抗氧化能力，改善2型糖尿病大鼠氧化應激導致的肝損傷[6]。但依帕司他對化學藥物致小鼠慢性肝損傷的保護機制，目前國內(nèi)外鮮見報道。本實驗通過采用CCl4建立經(jīng)典化學性肝損傷模型，探討依帕司他對化學藥物致小鼠慢性肝損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源

SPF級雄性C57BL/6J小鼠75只,6周齡,體質量19～21 g，購于北京維通利華公司,許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

依帕司他(揚子江藥業(yè)公司)，甘草酸二銨(正大天晴公司)，TUNEL試劑盒(武漢賽維爾公司)，兔抗小鼠B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)一抗(武漢愛博泰克公司), ELISA試劑盒(上海博湖公司)，酶標儀(美國賽默飛公司)，全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.3 方法

1.3.1動物分組及處理 75只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為正常組(A組)、模型組(B組)、陽性對照組(C組)、依帕司他低劑量組(D組)以及依帕司他高劑量組(E組)，每組15只小鼠。A組小鼠腹腔注射橄欖油(2 mL/kg)，其余各組小鼠腹腔注射等量體積分數(shù)0.20的CCl4橄欖油溶液，每周2次，持續(xù)8周。B～E組隨機抽取1只小鼠處死后取肝組織制作病理切片，若切片中發(fā)現(xiàn)肝細胞水腫、壞死及炎癥細胞浸潤，則慢性肝損傷小鼠模型構建成功。然后A、B組小鼠灌胃生理鹽水4 mL/kg,C組小鼠灌胃甘草酸二銨50 mg/kg，D、E組小鼠分別灌胃依帕司他50、100 mg/kg，每天1次，給藥4周。末次給藥后,小鼠禁食12 h。各組小鼠摘除眼球取血，斷頸處死所有小鼠，快速解剖，取出小鼠肝臟備用。

1.3.2小鼠血清中ALT、AST水平的檢測 分離血清，全自動生化測定儀檢測小鼠血清中ALT及AST水平。

1.3.3小鼠肝組織病理檢查 切取各組小鼠肝右葉，經(jīng)40 g/L甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片、烘烤處理后，HE染色，光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理變化。

1.3.4小鼠肝細胞凋亡情況的檢測 取各組小鼠新鮮肝組織做成石蠟切片，按照TUNEL試劑盒所示步驟操作，熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的細胞核為綠色熒光，采集圖像，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=顯微鏡視野下凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.3.5小鼠肝組織的氧化應激指標的檢測 制備小鼠肝組織勻漿，3 000 r/min離心10 min,取上清液。按照ELISA試劑盒說明書要求的步驟，測定各組小鼠肝組織勻漿上清液中丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性。

1.3.6小鼠肝組織凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax以及Caspase-3表達量的測定 裂解小鼠肝組織提取總蛋白，12 000 r/min離心5 min,收取上清液，使用BCA法檢測蛋白濃度。以20 μg蛋白量計算每組的上樣體積，上樣至含體積分數(shù)0.10的SDS-PAGE凝膠孔中，電泳、轉膜、封閉。將封閉后的膜放入1∶1 000稀釋后的Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗工作液中，4 ℃反應過夜。洗膜后放入1∶10 000稀釋后的二抗工作液中，室溫避光孵育。洗滌后進行曝光及洗片，用Image J軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結 果

2.1 各組小鼠血清中ALT、AST水平比較

各組小鼠血清中ALT、AST水平比較差異有顯著性(F=12.00、7.42，P<0.05)。與A組相比，B組小鼠血清中ALT、AST水平顯著升高(t=5.54、3.67,P<0.05)；與B組相比，C、D、E組小鼠血清中ALT以及AST水平顯著降低(t=4.24～5.44,P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST水平比較

2.2 各組小鼠肝組織病理變化比較

A組小鼠肝組織中肝小葉結構正常，肝索排列整齊，肝竇無明顯擴張，肝細胞無明顯水腫，未見明顯炎性細胞浸潤，僅見極少量點狀壞死(圖1A)。B組小鼠肝組織可見肝細胞明顯水腫，肝索排列紊亂，部分區(qū)域有明顯橋接壞死出現(xiàn)，匯管區(qū)及部分膽管可見大量炎性細胞聚集(圖1B)。C、D、E組小鼠肝組織中肝小葉排列較為規(guī)整，細胞水腫較輕，可見少量點狀和灶狀壞死，部分匯管區(qū)及膽管內(nèi)有少量炎性細胞浸潤，其中E組改善較D組更為明顯(圖1C、D、E)。見圖1。

A～E分別為A～E組，HE染色法，100倍

2.3 各組小鼠肝細胞凋亡率比較

A～E組小鼠肝細胞凋亡率分別為0.001 6±0.000 5、0.006 2±0.002 9、0.001 2±0.000 8、0.003 6±0.001 8、0.001 6±0.000 9。各組小鼠肝細胞凋亡率比較差異有顯著性(F=7.99，P<0.05)；與A組相比，B組小鼠肝細胞凋亡率顯著上升(t=4.38,P<0.05)；與B組比較,C、E組小鼠肝細胞凋亡率顯著下降(t=4.76、4.38,P<0.05)。

2.4 各組小鼠肝組織中氧化應激指標比較

各組小鼠肝組織中MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性比較差異有顯著性(F=3.36～8.70，P<0.05)；與A組相比，B組小鼠的肝組織中SOD、GSH-Px、CAT的活性明顯下降(t=3.45～5.20,P<0.05)；與B組相比，D、E組小鼠肝組織中MDA含量明顯下降(t=3.58、4.98,P<0.05),C、D、E組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT的活性明顯上升(t=2.14～4.64,P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肝組織中MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性比較

2.5 各組小鼠肝組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達量比較

各組小鼠肝組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達量比較差異有顯著意義(F=5.29～8.39,P<0.05)；與A組相比，B組小鼠肝組織中Bcl-2蛋白表達顯著下調(diào)(t=5.10,P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)(t=4.44、4.40,P<0.05)；與B相比，C、D、E組小鼠肝組織中Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)(t=2.97～4.71,P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)(t=2.75～4.36,P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組小鼠肝組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達量比較

表3 各組小鼠肝組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達量比較

3 討 論

慢性肝損傷是由多種病因引起的肝臟慢性炎癥[7]。CCl4作為化學藥物，進入機體以后會破壞肝細胞結構，引起肝細胞壞死，最終導致了肝細胞內(nèi)的ALT、AST等物質入血[8]。血清中ALT、AST水平是反應肝損傷最常用的指標[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，D、E組小鼠血清中ALT、AST水平明顯低于B組，差異有顯著性，這表明依帕司他可降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST水平，對于CCl4誘導的小鼠慢性肝損傷有保護作用。病理檢查是診斷肝損傷的“金標準”[10]，B組小鼠肝組織病理檢查可見肝細胞明顯水腫，部分區(qū)域可見橋接壞死，并見大量炎性細胞浸潤。D、E組小鼠肝組織病理檢查結果顯示肝細胞水腫比較輕微，僅僅發(fā)現(xiàn)有少量點狀或者灶狀壞死，同時少量炎性細胞浸潤，與C組小鼠肝組織鏡下結果相仿，表明依帕司他亦可以保護肝細胞結構，減輕肝組織炎癥反應，對CCl4誘導的小鼠肝損傷發(fā)揮了保護作用。

氧化應激是慢性肝損傷發(fā)生和發(fā)展的重要機制[11]。氧自由基(ROS)過量生成和抗氧化能力不足使體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，導致氧化應激[12]。CCl4的代謝產(chǎn)物攻擊肝細胞膜上的多不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化，生成ROS[8]。MDA是細胞膜發(fā)生脂質過氧化的最終產(chǎn)物，肝臟MDA含量增加表明脂質過氧化增強，提示肝臟氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡[13]。本研究結果顯示，D、E組小鼠肝臟中MDA含量較B組顯著減少，提示依帕司他可以減弱肝細胞脂質過氧化的程度。機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，還存在多種抗氧化酶，如SOD、GSH-Px、CAT等，持續(xù)清除各種反應產(chǎn)生的ROS，使氧化/抗氧化系統(tǒng)達到一種穩(wěn)態(tài)平衡。SOD可以有效地清除超氧陰離子，將超氧陰離子分解成為過氧化氫(H2O2)[14]。GSH-Px和CAT將H2O2分解成為水和氧氣[15-16]。本研究結果顯示，D、E組與B組相比，小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著增加，提示依帕司他可以通過提高肝臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性，增強清除ROS的能力，維持肝臟氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡。GSH-Px還可利用NADPH將氧化型谷胱甘肽催化為還原型谷胱甘肽(GSH)，提高細胞抗氧化能力[17]。由此可以推測依帕司他可通過減少NADPH消耗，增加GSH生成，增強肝細胞抗氧化能力。葡萄糖在多元醇代謝途徑中，會產(chǎn)生大量的ROS[18]，依帕司他通過抑制醛糖還原酶生成，減少葡萄糖進入多元醇代謝途徑，減少ROS生成，提高肝細胞抗氧化能力。這表明依帕司他可以通過抑制多種機制引起的氧化應激，保護CCl4誘導的小鼠慢性肝損傷。

細胞凋亡是肝損傷的主要特征之一[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)，B組小鼠肝細胞凋亡率顯著升高，E組小鼠肝細胞凋亡率明顯低于B組，提示依帕司他可以減少肝細胞凋亡，對CCl4誘導的小鼠慢性肝損傷起保護作用。然而，D組與B組相比，小鼠肝細胞凋亡率無顯著差異，考慮與藥物劑量不足有關，提示依帕司他與抑制肝細胞凋亡可能存在劑量-反應關系。肝細胞凋亡機制復雜，需要多種蛋白參與調(diào)控[20]。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中起重要調(diào)控作用，Bcl-2和Bax是線粒體凋亡的關鍵蛋白[21]。Bcl-2是凋亡抑制蛋白，主要通過保護線粒體的功能和抑制Caspase激活抑制細胞凋亡[22]。Bax是促凋亡蛋白，在細胞凋亡過程中從胞漿移動到線粒體，改變線粒體膜通透性，釋放細胞色素C，破壞線粒體功能,誘發(fā)細胞凋亡[23]。Bcl-2和Bax在細胞膜上相互作用，變化構象，調(diào)控細胞凋亡[24]。本研究結果顯示，相比于B組，D、E組小鼠肝組織中Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)，而Bax蛋白的表達顯著下調(diào)，表明依帕司他可以通過調(diào)控小鼠肝細胞線粒體凋亡的關鍵蛋白，影響肝細胞線粒體代謝，抑制肝細胞線粒體凋亡途徑，從而可以減少肝細胞凋亡。Caspase-3位于細胞凋亡途徑下游，在細胞內(nèi)通常以無活性的pro-Caspase-3存在，它的激活是通過蛋白酶裂解某個亞基啟動。激活的Caspase-3選擇性地分割不同底物，激活凋亡級聯(lián)反應，最終導致肝細胞凋亡[25]。本研究中，D、E組較B組小鼠肝組織中Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)，提示依帕司他可能是在小鼠肝細胞凋亡途徑的下游發(fā)揮阻斷作用，抑制小鼠肝細胞凋亡。

綜上所述，通過本研究可發(fā)現(xiàn)依帕司他可以顯著降低CCl4誘導的慢性肝損傷小鼠血清中ALT、AST水平，減少肝細胞凋亡，其作用機制可能與抑制氧化應激，調(diào)控凋亡相關蛋白表達有關。依帕司他在改善肝損傷方面有良好臨床應用前景，其確切的機制還有待于進一步深入研究，以探討其臨床應用的可行性。