周洲 張東寧 房程龍 朱崇田 陸玉成

(1 青島大學(xué)第十一臨床醫(yī)學(xué)院(臨沂市人民醫(yī)院)，山東 臨沂 276003；2 臨沂市人民醫(yī)院康復(fù)診療中心； 3 臨沂市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，發(fā)病率占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%[1]。腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤，腦膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，預(yù)后越差。高級(jí)別膠質(zhì)瘤，尤其膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率、高死亡率的特點(diǎn)，患者預(yù)后極差，5年生存率約為5.6%[1-4]。迄今為止，腦膠質(zhì)瘤的治療方法有手術(shù)切除、化療、放療、生物治療及免疫治療等。由于腦膠質(zhì)瘤具有廣泛侵襲的生物學(xué)特性，與周?chē)M織邊界不清，手術(shù)無(wú)法完全切除，復(fù)發(fā)率較高[5-7]。而輔助放療和化療技術(shù)，治療效果也不盡人意[8-9]。此外，因腦膠質(zhì)瘤的遺傳異質(zhì)性，新提出的免疫治療和生物治療對(duì)患者的生存率也無(wú)明顯的影響[10]。因此，研究新的有效治療方法是當(dāng)務(wù)之急。磷酸甘油酸變位酶1(PGAM1)是糖酵解的重要酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PG)生成2-PG，通過(guò)控制細(xì)胞內(nèi)底物3-PG和產(chǎn)物2-PG的濃度反饋調(diào)控生物大分子物質(zhì)的合成，在腫瘤的代謝和生物合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11]。研究證實(shí)PGAM1在人類(lèi)多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而且其表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等患者的預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)[12-15]。Ki67是應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，存在于細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞周期密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)隨著腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高，Ki67蛋白的表達(dá)水平也逐漸增高[16]。目前國(guó)內(nèi)外分別有PGAM1和Ki67在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的研究，但是關(guān)于PGAM1與Ki67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)是否具有相關(guān)性及其具體調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中PGAM1和Ki67表達(dá)水平，探討兩者的相關(guān)性及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，為尋找腦膠質(zhì)瘤新的檢測(cè)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

選取2014年1月—2018年12月于臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療并經(jīng)病理檢查確診為腦膠質(zhì)瘤的83例患者腫瘤組織標(biāo)本(腦膠質(zhì)瘤組)，同時(shí)選取10例來(lái)自于接受顱內(nèi)減壓手術(shù)的顱腦外傷或高血壓腦出血患者的腦組織樣本。腦膠質(zhì)瘤組中男41例，女42例；年齡4～82歲，平均年齡48歲；按照WHO(2007年)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將腦膠質(zhì)瘤組分為Ⅰ～Ⅱ級(jí)組26例，Ⅲ級(jí)組21例，Ⅳ級(jí)組36例。所有腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)前均未接受過(guò)放射化學(xué)治療。本研究經(jīng)過(guò)臨沂市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其親屬術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。

1.2 蘇木精-伊紅(HE)和免疫組織化學(xué)染色

術(shù)中收集的腦組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋后，切片。按照常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀(guān)察組織標(biāo)本的病理變化情況。免疫組織化學(xué)染色操作嚴(yán)格按照中杉免疫組化試劑盒(PV9003)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，一抗為PGAM1(1∶200，ab2220，美國(guó)Abcam公司)、Ki-67(1∶100，上海復(fù)申生物科技有限公司)，檢測(cè)兩組中PGAM1和Ki-67蛋白的表達(dá)情況。

1.3 結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)

針對(duì)兩種染色結(jié)果均采用雙盲法進(jìn)行觀(guān)察。其中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判讀參考相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[17]，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈黃色或棕黃色為PGAM1陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為Ki67陽(yáng)性表達(dá)。PGAM1綜合評(píng)分包括細(xì)胞染色比例以及細(xì)胞染色強(qiáng)度兩部分，細(xì)胞染色比例為染色細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占的比例，分為0、1%～25%、26%～50%、51%～75%和>75% 5個(gè)等級(jí)，分別計(jì)為0、1、2、3和4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度分為無(wú)、弱、中、強(qiáng)4個(gè)等級(jí)，分別計(jì)為0、1、2和3分。按照細(xì)胞染色比例和染色強(qiáng)度得分的乘積進(jìn)行分組，乘積的分值≤3分為PGAM1低表達(dá)組，>3分為PGAM1高表達(dá)組；用陽(yáng)性指數(shù)評(píng)估Ki67蛋白的表達(dá)情況并進(jìn)行分組，陽(yáng)性指數(shù)≥10%為Ki67高表達(dá)組，陽(yáng)性指數(shù)<10%為Ki67低表達(dá)組。

1.4 腦膠質(zhì)瘤組患者臨床資料的收集以及患者的隨訪(fǎng)

收集腦膠質(zhì)瘤組患者的臨床資料，包括患者的性別、年齡及腫瘤原發(fā)位置。對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者本人或家屬以電話(huà)、門(mén)診方式進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)截至患者病逝或隨訪(fǎng)結(jié)束。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率(X%)表示，計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，腦膠質(zhì)瘤組織中PGAM1、Ki67蛋白表達(dá)水平比較，及與各臨床病理參數(shù)分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)。PGAM1高表達(dá)以及低表達(dá)組間Ki67蛋白的表達(dá)比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。同時(shí)采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，以L(fǎng)og-rank檢驗(yàn)分析PGAM1和Ki67蛋白的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者生存的相關(guān)性。以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 各組腦組織HE染色結(jié)果

對(duì)照組腦組織細(xì)胞密度均勻，層次分明，細(xì)胞核規(guī)則，胞漿無(wú)異常染色，無(wú)異型性細(xì)胞(圖1A)；腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)組患者的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞密度增加，細(xì)胞質(zhì)著色，細(xì)胞核深染，輕度異型性(圖1B)；Ⅲ級(jí)組患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞聚集，大小不一，排列紊亂，異型性更加明顯(圖1C)；Ⅳ級(jí)組患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞明顯密集，核分裂象多見(jiàn)，可見(jiàn)微血管增生(圖1D)。

A～D分別為對(duì)照組、Ⅰ～Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組，PV9003法，200倍

2.2 PGAM1和Ki67在各組腦組織中的表達(dá)情況比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,PGAM1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，Ki67定位于細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)照組和不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組中PGAM1表達(dá)比較差異有顯著性(χ2=21.029，P<0.05)。不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組中Ki67表達(dá)比較，差異具有顯著性(χ2=28.105，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PGAM1和Ki67在各組腦組織中表達(dá)情況比較(例)

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中PGAM1、Ki67蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，PGAM1高表達(dá)組患者42例，PGAM1低表達(dá)組患者41例；Ki67高表達(dá)組患者57例，Ki67低表達(dá)組患者26例。高級(jí)別(WHO Ⅲ～Ⅳ級(jí))腦膠質(zhì)瘤組織中PGAM1以及Ki67蛋白的表達(dá)顯著高于低級(jí)別(WHO Ⅰ～Ⅱ級(jí))腦膠質(zhì)瘤組織(χ2=14.906、20.415，P<0.05)，而與患者性別、年齡以及腫瘤原發(fā)位置無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PGAM1和Ki67表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織中PGAM1以及Ki67表達(dá)的相關(guān)性

PGAM1高表達(dá)組和低表達(dá)組的Ki67陽(yáng)性指數(shù)分別為5.0(0.0～15.0)、10.0(5.0～30.0)，兩組間比較差異具有顯著性(Z=-3.038，P<0.05)。

2.5 PGAM1和Ki67表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間的關(guān)系

Kaplan-Meier曲線(xiàn)顯示，PGAM1與Ki67高表達(dá)、低表達(dá)組患者總生存期比較差異有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 PGAM1和Ki67高表達(dá)、低表達(dá)組患者的生存曲線(xiàn)圖

3 討 論

腦組織主要依靠葡萄糖提供能量，在氧氣充足時(shí)，葡萄糖經(jīng)過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生大量的能量，并進(jìn)行物質(zhì)代謝，參與一系列細(xì)胞活動(dòng)。在缺氧環(huán)境下，氧化磷酸化被抑制，腦組織細(xì)胞只能通過(guò)糖酵解產(chǎn)生能量供能。然而早期的研究發(fā)現(xiàn)，即使在氧氣充足的條件下，一些細(xì)胞依然選擇糖酵解途徑進(jìn)行能量代謝，經(jīng)糖酵解代謝產(chǎn)生的丙酮酸并不進(jìn)入線(xiàn)粒體進(jìn)行氧化磷酸化，反而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)代謝生成乳酸，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為“有氧糖酵解”，也叫“Warburg效應(yīng)”[18]。研究證實(shí)，Warburg效應(yīng)是腫瘤的生物學(xué)特征，對(duì)腫瘤內(nèi)Warburg效應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑中的幾種關(guān)鍵酶含量明顯上升，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的能量和物質(zhì)代謝來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[19-20]。

PGAM1為輔因子依賴(lài)型的單磷酸甘油酸變位酶，在糖酵解和磷酸戊糖途徑中起著關(guān)鍵性作用。PGAM1由2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為30 000的亞單位B(腦型)組成的同二聚體，即BB-PGAM，最初在腦組織中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)證實(shí)在人類(lèi)組織中廣泛表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，PGAM1在腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與惡性腫瘤的臨床分期以及預(yù)后有明顯的相關(guān)性[15]。ZHANG等[15]發(fā)現(xiàn)PGAM1的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，且PGAM1是患者總體生存率(OS)和無(wú)病生存(DFS)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。LIU等[21]將PGAM1的表達(dá)程度與胰腺導(dǎo)管腺癌患者是否有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分化程度、臨床分期以及生存率的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PGAM1表達(dá)水平越高，癌組織的分化程度越高，臨床分期越高，患者的生存率越低，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的傾向性越高。PGAM1具有代謝酶和非代謝酶的雙重作用。mTOR/HIF-1α通路可以轉(zhuǎn)錄激活PGAM1，活化的PGAM1通過(guò)其代謝酶作用促進(jìn)Warburg效應(yīng)，促使細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[12]。敲低乳腺癌細(xì)胞內(nèi)PGAM1的表達(dá)后，底物3-PG累積，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGD)，致使DNA的合成原料dNTP失衡，激活下游p53(p73)并作用于p21，后者可使APC/C-Cdh1復(fù)合物活化，導(dǎo)致DNA的同源修復(fù)(HR)過(guò)程失敗，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[13]。此外，PGAM1通過(guò)其非代謝酶與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(ACTA2)相互作用，在腫瘤的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[22]。最近，國(guó)內(nèi)首先報(bào)道了PGAM1的一種新型變構(gòu)抑制劑HKB99，具有抑制PGAM1代謝酶和非代謝酶活性的雙重作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和遷移[23]。PGAM1已成為腫瘤診斷與治療的熱點(diǎn)。

Ki67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，存在于除G0期之外的細(xì)胞周期中。在病理學(xué)中，Ki67陽(yáng)性指數(shù)和有絲分裂指數(shù)可作為腫瘤組織病理學(xué)分級(jí)的指標(biāo)[24]。Ki67在許多腫瘤中異常表達(dá)，可作為腫瘤復(fù)發(fā)的重要預(yù)后指標(biāo)[25]。研究發(fā)現(xiàn)Ki67在腦膠質(zhì)瘤組織中異常高表達(dá)，與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)[26]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PGAM1表達(dá)后可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，提示PGAM1可能在細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。JUNG等[27]將可以通過(guò)血-腦屏障的Tat-PGAM1融合蛋白經(jīng)腹腔注射到8周齡的雄鼠體內(nèi)，3周后取其腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在Tat-PGAM1組下丘腦齒狀回細(xì)胞內(nèi)Ki67陽(yáng)性增殖細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性核表達(dá)顯著增加。REN等[28]也報(bào)道在肝癌的荷瘤小鼠中敲低PGAM1的表達(dá)后，Ki67陽(yáng)性表達(dá)下降68%以上。但是，關(guān)于腦膠質(zhì)瘤中PGAM1與Ki67表達(dá)的相關(guān)性及其意義的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中PGAM1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組正常腦組織，高級(jí)別(WHO Ⅲ～Ⅳ)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較低級(jí)別(WHO Ⅰ～Ⅱ)腦膠質(zhì)瘤組織明顯增高，這與先前的研究結(jié)果一致[29-30]。隨著腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別增高，Ki67蛋白的表達(dá)水平也逐漸升高，高級(jí)別(WHO Ⅲ～Ⅳ)腦膠質(zhì)瘤組織中Ki67蛋白的表達(dá)水平顯著高于低級(jí)別(WHO Ⅰ～Ⅱ)腦膠質(zhì)瘤組織。將PGAM1和Ki67蛋白的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明PGAM1和Ki67蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)具有相關(guān)性，與患者的年齡、性別及腫瘤原發(fā)位置無(wú)關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，PGAM1高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Ki67蛋白的表達(dá)水平更高。Kaplan-Meier分析顯示，PGAM1和Ki67表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的總生存期有關(guān),提示PGAM1和Ki67可能是影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的重要因素，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著協(xié)同作用。

綜上所述，PGAM1和Ki67與腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)密切相關(guān)，對(duì)腦膠質(zhì)瘤的診斷、病理分級(jí)及預(yù)后評(píng)價(jià)有重要的參考價(jià)值。雖然腦膠質(zhì)瘤在顱腦腫瘤中較為常見(jiàn)，但是其發(fā)病率遠(yuǎn)不及其他惡性腫瘤，由于本研究收集病理資料較少，也未對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，因此，PGAM1對(duì)腦膠質(zhì)瘤診斷的價(jià)值，及其與病理分級(jí)和Ki67的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。