時(shí)冠蘭

中國(guó)石油化工股份有限公司江蘇油田分公司石油工程技術(shù)研究院，江蘇揚(yáng)州225001

生物表面活性劑是一類由微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物［1］，由一個(gè)或多個(gè)親水性和疏水性基團(tuán)組成［2］，具有卓越的表/界面活性，同時(shí)還具有特殊的生物活性。生物表面活性劑的兩親結(jié)構(gòu)使其能夠吸附于表/界面上，定向分散于水/油體系中，具有乳化［3］、滲透、潤(rùn)濕［4］、分散、起泡、消泡和破乳等表/界面活性［5］。生物表面活性劑因其來源天然、生物親和［6］、易生物降解等特點(diǎn)，近年來受到廣泛的重視，被認(rèn)為是最具潛力的表面活性劑之一［7-8］。

脂肽是生物表面活性劑中最受關(guān)注的一類，但其有來源復(fù)雜、產(chǎn)量低、提取周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，這限制了對(duì)該生物表面活性劑的進(jìn)一步研究，因此，建立便捷、快速且高效的定性定量分析方法是篩選產(chǎn)脂肽菌種的關(guān)鍵。目前高效液相色譜（HPLC）、油滴擴(kuò)散、酸沉淀、表面張力和氨基酸顯色光度等方法已用于脂肽的定性和定量分析中，其中HPLC 是最靈敏的方法之一。HPLC 的紫外檢測(cè)是一種常見的脂肽檢測(cè)手段，大多脂肽含有酰胺鍵、酯鍵等結(jié)構(gòu)，決定了其最大紫外吸收波長(zhǎng)位于205 nm 左右，溶劑效應(yīng)及絕大部分物質(zhì)在此波長(zhǎng)附近都有吸收，這導(dǎo)致直接HPLC法的檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確率下降［9］。針對(duì)以上問題，利用對(duì)硝基苯乙二胺衍生化-HPLC 法檢測(cè)脂肽，以改變Surfactin 的最大吸收波長(zhǎng)并提高其紫外響應(yīng)值，達(dá)到檢測(cè)低含量的脂肽以適用于Surfactin 的微量檢測(cè)的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

LC-100 Plus 型高效液相色譜儀（HPLC），上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；熒光檢測(cè)器，日本島津公司；LC-2000 型半制備色譜儀，Jasco CO-2060+Plus，日本分光公司。

1.2 脂肽樣品的制備

1）用半制備型HPLC 制備產(chǎn)物脂肽，制備條件如下：使用ODS 反相C18柱（10 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（0.1%甲酸）和水（0.1%甲酸）；梯度為0～90 min 乙腈保持90%，90～100 min乙腈從90%提高至100%；進(jìn)樣量為1.00 mL 脂肽的乙腈溶液；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；流速為8.0 mL/min。根據(jù)色譜圖收集樣品中不同的組分并編號(hào)，將收集產(chǎn)物旋蒸后進(jìn)行ESI 質(zhì)譜分析，得到各編號(hào)離子的質(zhì)荷比（m/z），對(duì)比分析后確定其成分。

2）分別將不同的產(chǎn)物溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再用乙腈溶解蒸餾燒瓶中的產(chǎn)物，將乙腈溶液倒入平板中，于通風(fēng)櫥中吹干乙腈，刮取產(chǎn)物粉末得到純物質(zhì)。

1.3 衍生試劑的選擇及吸收波長(zhǎng)掃描

1）選擇可與Surfactin 肽鏈上的兩個(gè)羧基發(fā)生酯化反應(yīng)或酰胺化反應(yīng)并且有較強(qiáng)紫外吸收的試劑：對(duì)硝基苯甲醇、對(duì)硝基苯乙醇、對(duì)硝基苯乙胺、對(duì)硝基苯丙胺、對(duì)硝基苯乙二胺和對(duì)硝基苯肼。

2）用分析天平稱取上述衍生試劑各5.0 mg后分別置于7 mL EP 管中，分別加入3.0 mL 乙腈溶液并充分振蕩溶解，再于8 000 r/min離心3 min后分別取上清液于潔凈EP 管中并編號(hào)。用紫外分光光度計(jì)掃描衍生試劑在200～800 nm 波長(zhǎng)的吸收情況，以乙腈作為空白對(duì)照。記錄衍生試劑最大吸收波長(zhǎng)及該點(diǎn)處的吸光度（若吸光度過大，則用乙腈稀釋衍生試劑溶液并重復(fù)掃描直至最大吸收波長(zhǎng)處吸光度小于0.8）。

1.4 Surfactin衍生效果檢測(cè)

1.4.1 酰胺化標(biāo)記

稱取制備得到的Surfactin-C1560.3 mg，用乙腈定容至100.0 mL，得到質(zhì)量濃度為0.603 g/L 的Surfactin-C15乙腈溶液。取該樣0.5 mL 和候選衍生試劑（對(duì)硝基苯乙胺、對(duì)硝基苯丙胺、對(duì)硝基苯乙二胺、對(duì)硝基苯肼），配制酰胺化體系如表1所示。

表1 Surfactin的酰胺化反應(yīng)體系

將上述體系裝于100 mL 梨形燒瓶中，放入合適攪拌子后用玻璃塞封閉瓶口，于75 ℃油浴鍋中加熱攪拌反應(yīng)3 h，待其冷卻后取出反應(yīng)液至5 mL 比色管中，用1.0 mL 乙腈潤(rùn)洗燒瓶3 次并將潤(rùn)洗液合并于比色管中。用乙腈將反應(yīng)液標(biāo)定至5.0 mL，搖勻后取1.0 mL 樣品待檢測(cè)。另將本體系中的Surfactin 更換為20.0 mg 十六酸重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。

1.4.2 酯化標(biāo)記

取上述脂肽的乙腈溶液0.5 mL 于100 mL 梨形燒瓶中，旋蒸除去溶劑乙腈并加入候選衍生試劑（對(duì)硝基苯甲醇或?qū)ο趸揭掖迹渲品枷銦N環(huán)境酯化反應(yīng)體系（見表2）、二氧六環(huán)環(huán)境酯化反應(yīng)體系（見表3）及正己烷環(huán)境酯化反應(yīng)體系（見表4）。

表2 Surfactin的芳香烴環(huán)境酯化反應(yīng)體系

表3 Surfactin的二氧六環(huán)環(huán)境酯化反應(yīng)體系

表4 Surfactin的正己烷環(huán)境酯化反應(yīng)體系

按表2 將相關(guān)物質(zhì)裝于100 mL 梨形燒瓶中，溶劑苯、甲苯、乙苯對(duì)應(yīng)100、120 和140 ℃油浴鍋中分水回流反應(yīng)3 h。待反應(yīng)結(jié)束后保持原溫度，用分水器分離溶劑，靜置，待反應(yīng)體系冷卻后向燒瓶中添加0.10 g 無水硫酸鈉中和硫酸并吸水。用1.0 mL 乙腈溶解反應(yīng)產(chǎn)物，超聲振蕩3 min 后，將反應(yīng)液移至5 mL 比色管中，用1.0 mL 乙腈潤(rùn)洗燒瓶3 次并將潤(rùn)洗液合并于比色管中，用乙腈將反應(yīng)液標(biāo)定至5.0 mL，搖勻后取1.0 mL 樣品用0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾后待檢測(cè)。另將體系中的Surfactin 更換為20.0 mg 十六酸重復(fù)實(shí)驗(yàn)作對(duì)照。

按表3 將相關(guān)物質(zhì)裝于100 mL 梨形燒瓶中，在120 ℃油浴鍋中分水回流反應(yīng)3 h。后續(xù)處理步驟同表2 反應(yīng)體系。另將體系中的Surfactin 更換為20.0 mg十六酸重復(fù)實(shí)驗(yàn)作對(duì)照。

按表4 將相關(guān)物質(zhì)裝于100 mL 梨形燒瓶中，80 ℃油浴鍋中分水回流反應(yīng)3 h。后續(xù)處理步驟同表2 反應(yīng)體系。另將體系中的Surfactin 更換為20.0 mg 十六酸重復(fù)實(shí)驗(yàn)作對(duì)照，樣品過濾后檢測(cè)。

1.5 標(biāo)記物鑒定

取純化樣品，旋蒸除去甲醇后用對(duì)硝基苯乙二胺標(biāo)記，用0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾，之后進(jìn)樣并進(jìn)行液相色譜（LC）及液質(zhì)聯(lián)用色譜（LCMS）檢測(cè)，同時(shí)取混合脂肽乙腈溶液直接進(jìn)樣并進(jìn)行LC 及LC-MS 作為對(duì)照。根據(jù)質(zhì)荷比、反應(yīng)后物質(zhì)分子量確定脂肽標(biāo)記的方式并確定LC 色譜圖中各個(gè)峰的組成。

LC 條件檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為各衍生試劑對(duì)應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)。觀察是否有衍生化Surfactin-C15峰產(chǎn)生，并根據(jù)衍生化Surfactin-C15的峰面積篩選衍生試劑。

LC-MS 檢測(cè)使用超高壓反相柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為乙腈（0.1%甲酸）和水（0.1%甲酸），流速0.3 mL/min，梯度為0～10 min 乙腈從75%提高至99%，10～20 min乙腈保持在99%。流動(dòng)相流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)器為ESI陽離子模式，Q-Exactive檢測(cè)器。

1.6 衍生化Surfactin標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)硝基苯乙二胺標(biāo)記不同濃度Surfactin-C15確定其標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同量的樣品，配制酰胺化標(biāo)記體系（見表5），于100 mL 梨形燒瓶中密封攪拌并30 ℃油浴反應(yīng)15 min。待反應(yīng)體系冷卻后，吸取燒瓶中反應(yīng)液置于10 mL比色管（含5 mL刻度），用0.5 mL乙腈洗滌燒瓶，溶解燒瓶壁殘留物質(zhì)并將其吸取到比色管中，重復(fù)此操作直至將溶液定容至5 mL處，搖晃比色管使溶液均勻。吸取比色管中反應(yīng)液，過濾后進(jìn)樣HPLC檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)雙標(biāo)記Surfactin的峰面積及峰高，根據(jù)濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表5 對(duì)硝基苯乙二胺衍生化Surfactin-C15標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑

另配制質(zhì)量濃度分別為0.064、0.129、0.258、0.387、0.516 和0.645 g/L 的Surfactin-C15乙 腈 溶液，微孔濾膜過濾后用液相色譜檢測(cè)樣品205 nm波長(zhǎng)吸收，其他條件參照上述酰胺化標(biāo)記液相設(shè)置，統(tǒng)計(jì)雙標(biāo)記Surfactin 的峰面積及峰高，根據(jù)濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 檢出限

重復(fù)配制表5 中6 號(hào)樣品（不含Surfactin）并按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，統(tǒng)計(jì)色譜圖中19.5～20.7 min 基線的噪音色譜信息，計(jì)算檢出限。

1.7 樣品測(cè)定的重復(fù)性及回收率

1.7.1 重復(fù)性

從同一搖瓶中取1.0 mL 發(fā)酵液，用硫酸將其pH調(diào)至2，過夜。用1.0 mL乙酸乙酯萃取脂肽，重復(fù)3 次，混合乙酸乙酯后在100 mL 燒瓶中旋干，添加標(biāo)記體系后反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑，并添加1.0 mL 乙腈溶解樣品，過濾后進(jìn)樣HPLC檢測(cè)。

1.7.2 回收率

從上述搖瓶中取1.0 mL 發(fā)酵液，加入0.250 mL Surfactin-C15的乙腈溶液（0.603 g/L），用硫酸將其pH 調(diào)至2，過夜。用1.0 mL 乙酸乙酯萃取脂肽3 次，混合乙酸乙酯后在100 mL 燒瓶中旋干，添加標(biāo)記體系并反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束定容過濾檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備產(chǎn)物色譜圖及其ESI

HPLC 色譜圖有3 個(gè)明顯產(chǎn)物峰，標(biāo)記為a、b、c，收集流動(dòng)相，旋蒸得到相應(yīng)產(chǎn)物，將產(chǎn)物用ESI 檢測(cè)確定成分，制備色譜圖和ESI 質(zhì)譜圖，見圖1。由圖1可知：在陰離子模式下，a、b、c的質(zhì)荷比分別為1 006.65、1 020.66、1 034.68，分別對(duì)應(yīng)Surfactin-C13、Surfactin-C14、Surfactin-C15，其中Surfactin-C15含量最高，共分離得到Surfactin-C1325.6 mg、Surfactin-C1447.6 mg、Surfactin-C1560.3 mg。

圖1 制備產(chǎn)物色譜圖及其ESI質(zhì)譜圖

2.2 標(biāo)記試劑選擇

用紫外分光光度計(jì)掃描衍生試劑在溶劑乙腈中對(duì)各波段的吸收波長(zhǎng)，各個(gè)衍生試劑的最大吸收波長(zhǎng)見表6。

表6 衍生試劑在溶劑乙腈中最大吸收波長(zhǎng)

由表6 可知：由于苯環(huán)上的硝基及對(duì)位的取代基團(tuán)存在，各衍生試劑都出現(xiàn)了最大吸收波長(zhǎng)移動(dòng)現(xiàn)象，尤其是對(duì)硝基苯肼和對(duì)硝基苯乙二胺，苯環(huán)上對(duì)位的硝基和氨基產(chǎn)生共振現(xiàn)象，使其在乙腈中的最大吸收波長(zhǎng)分別移至380 和386 nm，大大提高了屏蔽雜質(zhì)的效果。

用各衍生試劑對(duì)應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的衍生產(chǎn)物，在對(duì)硝基苯肼、對(duì)硝基苯甲醇和對(duì)硝基苯乙醇對(duì)應(yīng)的Surfactin 衍生產(chǎn)物色譜圖中未見明顯的色譜峰，但在其十六酸衍生產(chǎn)物的色譜圖中均有較明顯的色譜峰，這說明對(duì)硝基苯肼、對(duì)硝基苯甲醇和對(duì)硝基苯乙醇可與十六酸衍生物上的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，但不易與Surfactin上的羧基發(fā)生反應(yīng)。

在對(duì)硝基苯乙胺、對(duì)硝基苯丙胺及對(duì)硝基苯乙二胺對(duì)應(yīng)的色譜圖中有較明顯的產(chǎn)物峰。相比于相同液相條件下未標(biāo)記Surfactin 的峰，各Surfactin 衍生產(chǎn)物的保留時(shí)間有所延長(zhǎng)，這可能是Surfactin 經(jīng)衍生化后分子上的親水基團(tuán)由羧基變成了硝基苯，親水性減弱，所以在C18反相柱中保留時(shí)間延長(zhǎng)。作為對(duì)照的十六酸亦出現(xiàn)了明顯的色譜峰，其保留時(shí)間較Surfactin 更短，說明對(duì)硝基苯乙胺、對(duì)硝基苯丙胺及對(duì)硝基苯乙二胺可與Surfactin及脂肪酸反應(yīng)。

對(duì)硝基苯乙胺、對(duì)硝基苯丙胺及對(duì)硝基苯乙二胺標(biāo)記Surfactin 的衍生產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的色譜峰面積見表7。由表7 可知：酰胺化衍生體系Surfactin 的投料量相同且3 種衍生試劑的投料遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過Surfactin（n（衍生試劑）∶n（Surfactin）≈1 000∶3），對(duì)硝基苯乙二胺標(biāo)記的Surfactin色譜信號(hào)最強(qiáng)。

表7 不同標(biāo)記物標(biāo)記Surfactin-C15色譜峰面積

2.3 標(biāo)記產(chǎn)物識(shí)別及分析

Surfactin 上有2 個(gè)羧基，為確定對(duì)硝基苯乙二胺和Surfactin 的反應(yīng)程度，利用LC 及LC-MS對(duì)混合脂肽衍生產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別，衍生前后液相色譜見圖2。由圖2可知：衍生后主要產(chǎn)物峰為對(duì)硝基苯乙二胺雙標(biāo)記的Surfactin-C13（m/z=1 334.81）、Surfactin-C14（m/z =1 348.82）、Surfactin-C15（m/z =1 362.84）。衍生后的TIC 中也能發(fā)現(xiàn)Surfactin-C12、Surfactin-C16對(duì)應(yīng)衍生化離子的存在，說明對(duì)硝基苯乙二胺的衍生率高，不易漏檢低含量的脂肽。但是質(zhì)譜圖中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的單標(biāo)記Surfactin離子和未標(biāo)記Surfactin離子，說明Surfactin上2個(gè)羧基都被充分反應(yīng)了。通過質(zhì)譜圖可確定對(duì)硝基苯乙二胺在70 ℃下反應(yīng)180 min可完全反應(yīng)。

圖2 Surfactin衍生前后液相色譜對(duì)比

對(duì)比Surfactin 衍生前的色譜峰發(fā)現(xiàn)，衍生Surfactin 峰面積更大，峰寬更窄且拖尾現(xiàn)象較弱。在峰面積方面，硝基是一種強(qiáng)生色團(tuán)，氨基是一種強(qiáng)助色團(tuán)，Surfactin 經(jīng)對(duì)硝基苯乙二胺衍生后在相應(yīng)的紫外波段有很強(qiáng)的吸收。Surfactin 在205 nm 波長(zhǎng)處的吸收主要依賴于酰胺鍵及酯鍵上的碳氧雙鍵。在臨界濃度時(shí)，表面活性劑在溶液中的形態(tài)也有相應(yīng)的改變，從單體締合成為膠束，Surfactin 的CMC 大致為1.0 × 10-5mol/L，因在液相的流動(dòng)相中易形成較穩(wěn)定的膠束，給柱分離造成一定的阻礙。經(jīng)衍生試劑標(biāo)記后，Surfactin的表面活性下降，CMC 增大或不形成膠束，峰寬降低且拖尾現(xiàn)象減少。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

對(duì)硝基苯乙二胺雙標(biāo)記Surfactin 色譜信息見表8。Surfactin-C15衍生前后的峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，其中y 為峰高，x 為進(jìn)樣HPLC 樣品中Surfactin/衍生化Surfactin濃度。

表8 不同濃度Surfactin-C15色譜信息

由圖3 對(duì)比衍生前后Surfactin 曲線斜率可發(fā)現(xiàn)：在相同濃度的情況下，衍生后峰面積擴(kuò)大約2.52 倍，峰高提高2.65 倍，這一點(diǎn)側(cè)面說明了衍生后的Surfactin 峰型有所改善，峰寬減少，峰高提高。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和色譜噪音及儀器信噪比確定了對(duì)硝基苯乙二胺衍生化Surfactin檢出限為6.75×10-2mg/L。

圖3 Surfactin-C15衍生前后色譜峰面積及峰高對(duì)應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 重復(fù)性及回收率

重復(fù)衍生化并液相檢測(cè)等量相同濃度脂肽5次，平行樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都在3%以內(nèi)，表明衍生化方法具有良好的重復(fù)性。樣品回收率為99%～101%，說明對(duì)硝基苯乙二胺標(biāo)記Surfactin 檢測(cè)的方法準(zhǔn)確率高，適于Surfactin 的微量檢測(cè)。

3 結(jié)論

通過對(duì)硝基苯乙二胺標(biāo)記的Surfactin 色譜信號(hào)最強(qiáng)，衍生率高，不易漏檢低含量的脂肽，能夠降低脂肽的檢出限。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和色譜噪音及儀器信噪比確定了對(duì)硝基苯乙二胺衍生化Surfactin 檢出限為6.75×10-2mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%以內(nèi)，樣品回收率在99%～101%，表明該衍生化方法具有良好的重復(fù)性，檢測(cè)方法準(zhǔn)確率高，適于Surfactin 的微量檢測(cè)。