張燕飛，王麗芳

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 乳制品質(zhì)量安全控制技術(shù)教育部工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

奶牛乳房炎是奶牛最常見(jiàn)的疾病，全球奶牛乳房炎平均發(fā)病率為50%［1］。奶牛乳房炎會(huì)使奶牛產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)下降造成經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，我國(guó)每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)150億元［2］，美國(guó)每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)20億美元［3］。奶牛乳房炎分為兩類(lèi)，分別是臨床型奶牛乳房炎和亞臨床型奶牛乳房炎?；寂R床型乳房炎的奶牛乳房特征表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。亞臨床型乳房炎由乳房持續(xù)感染引起，通常無(wú)臨床癥狀，乳房無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)癥狀，乳汁pH值達(dá)到7.0以上，乳汁中有大量絮狀物和纖維，氯化鈉占比達(dá)到0.14%以上，細(xì)菌含量和電導(dǎo)值顯著增加［4］。亞臨床型乳房炎因發(fā)病特征不明顯，在亞臨床型乳房炎篩查、診治過(guò)程中通常會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間和資金，造成的損失較大。引起奶牛乳房炎的病原體包括革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌，可分為接觸傳染性致病微生物（如金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、支原體）和環(huán)境性致病微生物（如大腸桿菌、腸球菌、凝固酶陰性葡萄球菌）［5］。

目前獸醫(yī)臨床對(duì)奶牛乳房炎多采用抗菌藥物療法，但這一方法存在很多弊端，如抗生素亂用、濫用以及休藥期執(zhí)行不嚴(yán)格帶來(lái)的乳中抗菌藥物殘留、動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及擴(kuò)散，同時(shí)也會(huì)對(duì)人體健康、環(huán)境安全和公共衛(wèi)生安全造成威脅。因此，開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療奶牛乳房炎低毒、低殘留、不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的綠色藥物尤為緊迫。歐盟和美國(guó)分別于2003年和2017年起先后做出限用或禁用抗生素作為飼料添加劑的決定，2004年我國(guó)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局公布了植物提取物對(duì)人類(lèi)食品藥品安全無(wú)毒副作用，可以作為飼料添加劑使用。植物提取物中的酚類(lèi)、多糖、生物堿、有機(jī)酸、苷類(lèi)、精油、大蒜素等活性成分均具有一定的抗菌作用［6］。植物提取物作為天然產(chǎn)品的先天優(yōu)勢(shì)是低毒少殘留，不會(huì)對(duì)牛體健康和牛奶品質(zhì)造成損害［7］。黃酮類(lèi)化合物不僅可以提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)力，也會(huì)提高奶?？箲?yīng)激的能力［8］。植物提取物飼喂、灌服、外敷、注射等不同牛體施用方式的效果差異還有待驗(yàn)證。目前植物有效成分的提取方法眾多，筆者詳細(xì)介紹了回流提取法、超聲波提取法、微波萃取法和超臨界流體萃取法。回流提取法和超聲波提取法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣，微波萃取法的特點(diǎn)在于加熱均勻、操作簡(jiǎn)單，超臨界流體萃取分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于選擇性高、溫度溫和。超聲波提取法在提取酚類(lèi)化合物方面是快速有效的，而微波萃取法可用于提取植物中的總黃酮、總多酚等活性物質(zhì)。同時(shí)，筆者論述了細(xì)菌性奶牛乳房炎的發(fā)生機(jī)理、植物有效成分抗菌機(jī)制以及植物提取物抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)利用植物提取物防控奶牛乳房炎提供理論基礎(chǔ)。

1 植物有效成分提取方法

1.1 回流提取法

回流提取法是用乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取，浸提液被加熱，揮發(fā)性溶劑蒸餾出后又被冷凝，流回浸出器浸提藥材，直至有效成分提取完全的方法?？紤]到生物安全性，水和乙醇溶液是傳統(tǒng)的提取溶劑，水作為提取溶劑時(shí)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的單因素主要為反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和料液比，乙醇溶液作為提取溶劑時(shí)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的單因素主要為反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、料液比和乙醇濃度。先利用控制變量法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定每個(gè)條件下的最佳值，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)從而確定最佳實(shí)驗(yàn)條件?；亓魈崛》ㄓ玫降闹饕獙?shí)驗(yàn)儀器為：帶冷凝管的數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵。通常情況下，乙醇提取物比水提取物具有更高的抗菌活性［9］。賽福丁·阿不拉等［10］運(yùn)用回流提取法，分別以水和乙醇溶液作為提取溶劑提取了小檗果粗提物，通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌3種奶牛乳房炎常見(jiàn)致病菌的體外抑菌效果。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗果水提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌高度敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中度敏感；其醇提物對(duì)無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌高度敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌中度敏感。由此可知，醇提物和水提物的抑菌效果還是有一定差別的。梅兆雄［11］運(yùn)用回流提取法，以乙醇溶液作為提取溶劑提取了黃花蒿中的青蒿素，通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)證明了青蒿素對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑菌效果。

1.2 超聲波提取法

超聲波提取法是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，改變植物本身的組織，主要作用于植物粉末顆粒的核殼界面，使細(xì)胞破碎，活性成分溶解，在擴(kuò)散和傳質(zhì)超聲的作用下，提取黃酮類(lèi)化合物、生物堿和酚類(lèi)等活性成分［12］。在超聲波提取海藻酸酯的過(guò)程中，提取時(shí)間較短，溫度較低，但活性成分較高［13］。超聲波提取法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、提取效率高、適用范圍廣，缺點(diǎn)在于反應(yīng)過(guò)程不穩(wěn)定［14］。超聲波提取的主要影響因素有：提取溶劑的種類(lèi)、溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、反應(yīng)溫度、超聲功率和頻率。所選植物的提取率通過(guò)以下方程式計(jì)算：產(chǎn)量（%）=（X1×100）/X0，X1表示溶劑蒸發(fā)后的提取物重量，X0表示提取前植物粉末的干重［15］。超聲波提取用乙醇溶液或去離子水提取極性化合物，如黃酮和酚類(lèi)化合物，尤其在提取酚類(lèi)化合物方面快速有效［16］。超聲波提取技術(shù)可用于提取總多酚（如板栗殼多酚、蜜柑皮多酚和茶多酚）、單寧、多酚類(lèi)單體（如丹皮酚、厚樸酚）以及黃酮類(lèi)化合物（如含羞草總黃酮、黃芩總黃酮和半枝蓮黃酮）［17］。羅磊等［14］運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助提取金銀花葉黃酮的工藝。

1.3 微波萃取法

微波萃取法是利用微波輻射，高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達(dá)物料內(nèi)部的微管束和腺胞系統(tǒng)，細(xì)胞吸收了微波能，細(xì)胞內(nèi)部的溫度將迅速上升，使細(xì)胞內(nèi)部的壓力超過(guò)細(xì)胞壁膨脹所能承受的壓力，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，其內(nèi)的有效成分自由流出，并在較低的溫度下溶解于萃取介質(zhì)中。現(xiàn)階段，在微波傳輸過(guò)程中，根據(jù)不同物質(zhì)的不同性質(zhì)，會(huì)發(fā)生反射穿透和吸收現(xiàn)象，分子在接收到微波輻射能量后，會(huì)迅速產(chǎn)生熱效應(yīng)。通過(guò)進(jìn)一步的過(guò)濾和分離，即可獲得所需的萃取物［9］。微波產(chǎn)生的電磁場(chǎng)可加速被萃取組分的分子由固體內(nèi)部向固液界面擴(kuò)散。由于微波的頻率與分子轉(zhuǎn)動(dòng)的頻率相關(guān)，微波能是一種由離子遷移和偶極子轉(zhuǎn)動(dòng)而引起分子運(yùn)動(dòng)的非離子化輻射能，當(dāng)它作用于分子時(shí)，可促進(jìn)分子的轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)，若分子具有一定的極性，即可在微波場(chǎng)的作用下產(chǎn)生瞬時(shí)極化并作極性變換運(yùn)動(dòng)，從而產(chǎn)生鍵的振動(dòng)、撕裂和粒子間的摩擦和碰撞，并迅速生成大量的熱能，促使細(xì)胞破裂，使細(xì)胞液溢出并擴(kuò)散至溶劑中。微波萃取法用到的主要實(shí)驗(yàn)儀器有電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、微波爐、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素有目數(shù)、乙醇濃度、料液比、微波功率和提取時(shí)間。首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)結(jié)果進(jìn)行極差分析，最終選出3個(gè)最主要的影響因素，再通過(guò)設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［18］。微波萃取法具有加熱均勻、操作簡(jiǎn)單、提取效率高的特點(diǎn)［19］。微波萃取法可用于提取植物中的總黃酮、總多酚等活性物質(zhì)［18-19］。

1.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是利用超臨界流體的溶解能力與其密度密切相關(guān)的特性，通過(guò)改變壓力或溫度使超臨界流體的密度大幅改變。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性不同、沸點(diǎn)不同和相對(duì)分子質(zhì)量大小不同的成分萃取出來(lái)。超臨界流體萃取法將傳統(tǒng)的蒸餾和有機(jī)溶劑萃取結(jié)合一體，利用超臨界二氧化碳優(yōu)良的溶劑力，將基質(zhì)與萃取物有效分離、提取和純化。超臨界二氧化碳具有類(lèi)似氣體的擴(kuò)散系數(shù)、液體的溶解力，表面張力為零，能迅速滲透固體物質(zhì)，具有高效、不易氧化、純天然、無(wú)化學(xué)污染等特點(diǎn)。超臨界流體萃取分離技術(shù)有選擇性高、溫度溫和等優(yōu)點(diǎn)，從而避免了熱降解和溶劑殘留，與傳統(tǒng)的溶劑萃取相比，超臨界流體萃取最嚴(yán)重的缺點(diǎn)之一是需要更高的設(shè)備成本［20］。實(shí)驗(yàn)裝置為超臨界流體萃取器，該萃取器包含一個(gè)2 L圓柱體萃取池、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀。超臨界流體萃取多用于提取植物的親脂部分。Garcia-Risco等［21］運(yùn)用超臨界流體萃取分離技術(shù)提取菊科和乳草科植物中的酚類(lèi)化合物，實(shí)驗(yàn)提取壓力為140 bar，提取溫度為40℃，二氧化碳流量為70 g/min，提取時(shí)間為180 min，用乙醇收集分離得到的油樹(shù)脂。然后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醇，之后采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent Technologies7890A）分析超臨界萃取物的化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳草科植物提取物的酚類(lèi)化合物含量高于菊科植物提取物。乳草科植物富含酚類(lèi)單萜和倍半萜（約32%的香脂和53%的馬郁蘭），環(huán)醇含量為7%～12%。而菊科植物揮發(fā)油中含有大量的二環(huán)醇和三環(huán)醇（52%的蓍草和32%的萬(wàn)壽菊），幾乎不含酚醇。

2 細(xì)菌性奶牛乳房炎的發(fā)生機(jī)理

乳房炎的發(fā)生有多種因素，研究表明，奶牛乳房炎的發(fā)生與病原微生物感染、機(jī)體代謝失衡、氧化應(yīng)激、腸道菌群失衡都有關(guān)系。細(xì)菌感染引起的奶牛乳房炎難以治療主要是由于以下幾個(gè)因素：①微生物細(xì)胞壁成分中的蛋白質(zhì)和磷壁酸聚合物，在黏附過(guò)程中發(fā)揮作用，這是侵入宿主細(xì)胞的先決條件［22］。②微生物可以產(chǎn)生多種毒力因子，如毒素、凝固酶和生物膜，這些被認(rèn)為是乳房炎發(fā)病的主要毒力因子［23］。

金黃色葡萄球菌是奶牛傳染性乳房?jī)?nèi)感染的重要病原，金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎是幾種毒力因子產(chǎn)生的結(jié)果，這些毒力因子可以在不同的致病方式中起作用［23］。金黃色葡萄球菌的毒力因子大致可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是作為毒力因子的表面局部結(jié)構(gòu)成分，另一類(lèi)是分泌的毒力因子，它們共同幫助金黃色葡萄球菌逃避宿主的防御并定植于乳腺［24］。作為毒力因子的一些表面局部結(jié)構(gòu)成分包括膜結(jié)合因子（膠原結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、彈性蛋白結(jié)合蛋白和青霉素結(jié)合蛋白）、細(xì)胞壁結(jié)合因子（蛋白A、β-內(nèi)酰胺酶和蛋白酶）以及細(xì)胞表面相關(guān)因子（莢膜和黏液）［25］。一些已知的分泌性毒力因子是毒素（葡萄球菌腸毒素、中毒性休克綜合征毒素、溶血素和脫落素）和酶（凝固酶、葡萄激酶、脫氧核糖核酸酶、磷酸酶、脂肪酶和磷脂酶）。除了特定的毒力因子外，金黃色葡萄球菌還通過(guò)不同的機(jī)制或途徑，如生物膜的形成、對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的黏附和侵襲、小菌落變體（small colony variant，SCV）的形成等，使其能夠抵抗宿主防御［24］。其中一些毒素被認(rèn)為是超抗原，可以增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)性。生物膜的形成可以促進(jìn)金黃色葡萄球菌在乳房中的黏附和定植，細(xì)菌不斷地增殖和積累，這將保護(hù)金黃色葡萄球菌免受奶牛的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的影響，以及抵抗抗生素的影響［26］。金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的莢膜多糖增強(qiáng)了其對(duì)巨噬細(xì)胞的抵抗力［27］。對(duì)微生物持久性機(jī)制的透徹理解將有助于開(kāi)拓新的治療方法。在感染的初始階段，中性粒細(xì)胞會(huì)從血管移動(dòng)到感染部位。中性粒細(xì)胞的數(shù)量是炎癥感染過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因素，在牛乳腺炎期間，遺傳會(huì)影響中性粒細(xì)胞的數(shù)量和濃度。之后，模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）的機(jī)制被激活，通過(guò)其特殊的傳感器對(duì)病原體進(jìn)行重組，最終激活免疫反應(yīng)。PRRs包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR）和RIG樣受體（RIG-like receptor，RLR），它們識(shí)別各種病原體基序，也稱為微生物相關(guān)分子模 式 （microbial-related molecular patterns，MAMPs）［28］。

在大腸桿菌引起的奶牛乳房炎發(fā)病過(guò)程中，一個(gè)非特異性但起到關(guān)鍵作用的因素是內(nèi)毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［29］，一方面它誘導(dǎo)防御機(jī)制，另一方面它是一種有毒化合物。反芻動(dòng)物內(nèi)毒素的病理生理效應(yīng)是劑量依賴性的，并引起多種代謝和臨床癥狀［30］。大腸菌群的毒性和對(duì)炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)取決于它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)復(fù)制和破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的能力。在增殖、破壞和裂解過(guò)程中，它們釋放一種外膜成分，即內(nèi)毒素或脂多糖，這是一種耐高溫分子，是革蘭陰性病原體細(xì)胞壁的獨(dú)特結(jié)構(gòu)成分。許多研究表明，大腸桿菌在乳腺的致病性與LPS有關(guān)。這是基于以下事實(shí)：①LPS是大腸桿菌在泌乳竇內(nèi)裂解和生長(zhǎng)的結(jié)果。一旦細(xì)菌到達(dá)乳頭池，它們會(huì)迅速生長(zhǎng)，每2 h細(xì)菌數(shù)量增加8～10倍，釋放大量LPS。②LPS誘導(dǎo)的局部體征與大腸桿菌乳腺炎相同。③多黏菌素B（一種LPS中和劑）預(yù)處理或同時(shí)給藥可減少和延緩腹腔注射脂多糖引起的發(fā)熱和白細(xì)胞減少反應(yīng)，并防止血漿鋅減少。反芻動(dòng)物在革蘭陰性菌感染過(guò)程中觀察到許多病理生理變化，如發(fā)熱、循環(huán)白細(xì)胞數(shù)量的變化（白細(xì)胞減少或增多）、補(bǔ)體激活、巨噬細(xì)胞激活、靜脈通透性增加、血漿代謝物、礦物質(zhì)、急性期反應(yīng)物和激素水平的變化等［30］。

3 植物有效成分抗菌機(jī)制

奶牛乳房炎難以治療的一個(gè)原因在于微生物可以產(chǎn)生多種毒力因子，如毒素、凝固酶和生物膜，而微生物產(chǎn)生毒力因子依賴微生物群體感應(yīng)的調(diào)控作用，因此干擾微生物群體感應(yīng)對(duì)毒力因子的產(chǎn)生是治療奶牛乳房炎的一個(gè)思路。群體感應(yīng)是細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些特定的信號(hào)分子，并能感知其濃度變化，調(diào)節(jié)微生物的群體行為的化學(xué)通信系統(tǒng)。群體感應(yīng)不僅有助于細(xì)菌的生存，還可以在種群水平上組織細(xì)菌的活動(dòng)，包括協(xié)調(diào)分泌毒力因子，形成生物膜。在革蘭陰性菌中，群體感應(yīng)的自身誘導(dǎo)劑分子是酰基高絲氨酸內(nèi)酯，而在革蘭陽(yáng)性菌中，它們是自誘導(dǎo)信號(hào)肽。群體感應(yīng)的基本機(jī)制包括可擴(kuò)散信號(hào)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用，直接或間接激活傳感器激酶［31］。Ta等［32］發(fā)現(xiàn)，具有顯著抗群體感應(yīng)和抗生物膜活性的植物屬于十字花科、野牡丹科、洋酢漿草科、無(wú)患子科和苦木科。葉下珠（葉下珠科）、茄子（茄科）和茄子黃果（茄科）的植物部位對(duì)歐文菌和青枯假單胞菌表現(xiàn)出群體感應(yīng)抑制作用［33］。從肉豆蔻干樹(shù)皮丙酮提取物的乙酸乙酯可溶部分中分離出的巨型糖苷酮對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抗群體感應(yīng)活性［34］。濃度為63.5 g/mL的小檗堿能抑制克雷伯菌的生物被膜生長(zhǎng)［35-36］，從蘿芙木屬中分離得到的生物堿對(duì)克雷伯菌生物被膜有抑制作用［37］。天竺葵精油對(duì)金黃色葡萄球菌的生物被膜有較強(qiáng)的殺滅作用［38］。丁香提取物的主要成分丁香酚（丁香酚結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）可抑制大腸桿菌毒力因子的產(chǎn)生，包括紫羅蘭素、彈性蛋白酶、綠色素和生物膜的形成［39］。另外，三個(gè)丁香酚衍生物異丁香酚（異丁香酚結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2）、2-甲氧基-4-丙基酚（2-甲氧基-4-丙基酚結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3）和4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-乙基愈創(chuàng)木酚結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖4）具有抗生物膜活性，表明丁香酚苯環(huán)上的C-1羥基單元、C-2甲氧基單元和C-4烷基或烷烴鏈對(duì)抗生物膜活性有貢獻(xiàn)［40］。植物單寧酸通過(guò)轉(zhuǎn)糖基酶抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成［41］。Maria等［26］研究了反膠束法制備的殼聚糖納米粒（chitosan nanoparticles，Ch-NPs）的抗菌性能，發(fā)現(xiàn)開(kāi)發(fā)的納米制劑對(duì)乳房炎病原體具有劑量依賴性的抗菌活性。此外，不同的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ch-NPs的抗菌效果比用于制備這些納米復(fù)合材料的天然聚合物的抗菌效果更好。Ch-NPs對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成膜損傷，抑制細(xì)菌生物膜的形成，但不影響牛細(xì)胞的活力。這些發(fā)現(xiàn)顯示了Ch-NPs作為治療牛乳腺炎藥物的巨大潛力。Hu等［42］研 究 表 明 山 蒼 子 精 油（Litsea cubeba essential oil，LC-EO）對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）有破壞作用，可使細(xì)胞內(nèi)生物大分子滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。此外，經(jīng)LC-EO處理后，MRSA的己糖單磷酸途徑（hexose monophophate pathway，HMP）及其關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性也受到抑制，從而抑制了MRSA的呼吸代謝。紫外吸收光譜結(jié)果表明，LC-EO的主要成分檸檬醛可以與MRSA的DNA形成嵌合體，從而抑制其生物活性。筆者總結(jié)了根據(jù)DNA/RNA、三磷酸腺苷（adenosine triphosphatese，ATPase）、可溶性蛋白、β-半乳糖苷酶的含量判別作用機(jī)制見(jiàn)表1［42］。DNA/RNA、三磷酸腺苷、可溶性蛋白、β-半乳糖苷酶是細(xì)胞存活至關(guān)重要的生物大分子。260 nm波長(zhǎng)處的光密度變化可以揭示細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的核酸。經(jīng)LC-EO處理后260 nm波長(zhǎng)處的值增加，說(shuō)明被測(cè)細(xì)菌的DNA和RNA都有泄漏。另外，添加DAPI（4，6-二脒基-2-苯基吲哚）可以穿透細(xì)胞并與核酸反應(yīng)形成熒光信號(hào)［43］。與對(duì)照組相比，LCEO處理MRSA后的熒光顯微照片細(xì)胞熒光斑點(diǎn)圖的數(shù)量和強(qiáng)度明顯降低。激光共聚焦顯微鏡圖譜分析結(jié)果表明，LC-EO處理在破壞細(xì)胞膜后可導(dǎo)致DNA泄漏。酶在催化細(xì)胞內(nèi)各種生理代謝過(guò)程中起著重要作用，因此，細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的代謝過(guò)程都需要酶催化來(lái)維持生命活動(dòng)。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)LC-EO對(duì)MRSA的破壞作用，采用ATP生物發(fā)光法測(cè)定LC-EO處理前后MRSA細(xì)胞中4種典型ATP酶Ca2+/Mg2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性的影響。Ca2+/Mg2+-ATP酶在肌肉收縮后能轉(zhuǎn)運(yùn)鈣，其活性依賴于ATP和Mg2+的結(jié)合；Na+/K+-ATP酶存在于細(xì)胞膜上，幫助細(xì)胞內(nèi)鈉離子交換細(xì)胞外鉀，與濃度梯度相反。在LC-EO處理過(guò)程中，4種ATP酶的活性均下降，可判斷LC-EO處理可以有效降低MRSA的酶活性，這被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)菌死亡的一個(gè)重要因素［44］。有機(jī)大分子蛋白質(zhì)是細(xì)胞的基本有機(jī)體，是生命活動(dòng)的關(guān)鍵元素。用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和蛋白檢測(cè)試劑盒分析LC-EO對(duì)MRSA蛋白的影響，可溶性蛋白的SDS-PAGE結(jié)果顯示，LC-EO處理過(guò)程中蛋白質(zhì)條帶減少，表明LC-EO可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)通過(guò)MRSA細(xì)胞膜滲漏。β-半乳糖苷酶是微生物的主要能量提供者，它催化乳糖水解成單糖［45］。在β-半乳糖苷酶的催化下，鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)一步水解為鄰硝基苯酚，紫外分光光度計(jì)可在405 nm處檢測(cè)到鄰硝基苯酚的存在。LC-EO處理后OD405nm值下降表明其有效地抑制了ONPG的水解。結(jié)果表明，LC-EO能有效抑制金黃色葡萄球菌β-半乳糖苷酶的活性，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)［42］。Gonelimali等［15］測(cè)量了植物提取物處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)pH值和膜電位的變化。結(jié)果表明，植物提取物顯著影響革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的細(xì)胞膜，表現(xiàn)為pH值的下降以及細(xì)胞膜超極化。Burt等［46］證明百里香的抗菌性能是由于其含有的百里香酚可以通過(guò)疏水鍵和氫鍵與膜蛋白結(jié)合，從而改變膜的通透性。

圖1 丁香酚［40］

圖3 2-甲氧基-4-丙基酚［40］

圖4 4-乙基愈創(chuàng)木酚［40］

表1 DNA/RNA、三磷酸腺苷、可溶性蛋白、β-半乳糖苷酶的含量判別作用機(jī)制[42]

4 植物提取物抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用

植物提取物中的酚類(lèi)、多糖、生物堿、有機(jī)酸、苷類(lèi)、精油等活性成分均具有調(diào)節(jié)免疫和抗炎抑菌的作用。已有多種植物成分被證明具有防控奶牛乳房炎的作用，大蒜中的大蒜素［47］、莪術(shù)中的生物 堿 和 黃 酮［48］、連 翹 中 的 連 翹 苷［49］、白 頭 翁 中 的白頭翁皂苷［50］、香菇中的多糖［51］、黃花蒿中的青蒿素［11］都對(duì)奶牛乳房炎具有良好的防控作用。

多酚化合物能夠影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如NF-κB（nuclear factorκB）、MAPK（mitogen-activated protein kinases）和JAK-STAT（just another kinase，signal transducer and activator of transcription），這些信號(hào)通路負(fù)責(zé)產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素IL-1β和IL-12，參與產(chǎn)生活性物質(zhì)的酶，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和超氧化物脫氫酶（superoxide dehydrogenase，SOD），以及參與產(chǎn)生二十烷類(lèi)化合物的酶，如環(huán)氧酶（cyclooxygenase，COX）和脂合酶（lipoxygenase，LO）［28］。一些研究認(rèn)為多酚可能通過(guò)抑制Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Laura等［52］在體外評(píng)估可可多酚提取物處理的人外周血的單核細(xì)胞（tamm horsfall protein，THP-1）時(shí)，證明可降低促炎巨噬細(xì)胞（M1巨噬細(xì)胞）的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞TNF-α和IL-12的分泌，從而誘導(dǎo)表型。減少巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6，以應(yīng)對(duì)干擾素-γ和脂多糖的刺激。沈留紅等［50］通過(guò)對(duì)患病奶牛進(jìn)行頸部肌肉注射白頭翁皂苷B4的試驗(yàn)，試驗(yàn)證明白頭翁皂苷B4可顯著促使臨床型奶牛乳房炎免疫因子IgA、IgD、IgG、IgE、IgM和血清炎性因子SAA、CRP、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、HP恢復(fù)到健康水平。

5 小結(jié)

植物提取物的提取率受提取時(shí)間、提取溫度、提取溶劑的極性以及提取方法的影響較大，因此，必須通過(guò)確定合適的溶劑類(lèi)型、方法和提取條件來(lái)優(yōu)化每個(gè)植物樣品的提取過(guò)程，以獲得最大的得率。植物提取物的提取方法也可以采取多種提取方法相結(jié)合以提高提取效果?；亓魈崛〗Y(jié)合超聲預(yù)處理對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的提取效果優(yōu)于超聲提取和單獨(dú)回流提?。?］。Garcia-Risco等［21］研究比較了二氧化碳超臨界流體萃取、綠色溶劑［乙醇、乙醇∶水（50∶50）］超聲波提取2種工藝，認(rèn)為所研究的品種，超臨界提取物的抗氧化活性最低，乙醇提取物的抗氧化活性最大。由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣復(fù)雜且會(huì)受到很多不確定因素的干擾，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，使用模型計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)過(guò)程以取得最佳實(shí)驗(yàn)方案會(huì)是未來(lái)趨勢(shì)。Oiagaray等［8］采用了響應(yīng)面方法（Box-Behnken Design，BBD）對(duì)提取蒲公英中的酚類(lèi)化合物進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，證明了該模型成功地用于預(yù)測(cè)萃取條件，優(yōu)化酚類(lèi)化合物的提取。通過(guò)應(yīng)用BBD，可以用較少的測(cè)試評(píng)估大量的參數(shù)及其相互作用，從而減少了工作量，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)有利于改進(jìn)工業(yè)流程以提高大規(guī)模萃取系統(tǒng)的效率。

植物提取物對(duì)細(xì)菌性奶牛乳房炎的防控作用是多方面多因素作用的結(jié)果，一方面植物提取物的活性成分可以通過(guò)提高牛體免疫力，刺激免疫因子和血清炎性因子恢復(fù)到正常水平來(lái)抵抗乳房炎的發(fā)生；另一方面也可以作用于主要致病菌的毒力因子，破壞致病菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，阻斷其繁殖途徑達(dá)到抑菌效果。研究植物提取物的有效成分，也可以對(duì)有效成分的分子式進(jìn)行進(jìn)一步探討，明確主要作用基團(tuán)，以期對(duì)抑菌成分進(jìn)行有效改進(jìn)，以達(dá)到抑菌效果最大化。Wang等［53］系統(tǒng)地繪制了黃酮的抗炎結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系，并與黃酮、黃烷醇和異黃酮進(jìn)行交叉比較。羥基（-OH）對(duì)黃酮的抗炎功能必不可少，C-5和C-4′位置的-OH增強(qiáng)抗炎活性，而C-6、C-7、C-8和C-3′位置的-OH減弱其活性。此外，C-3和b環(huán)上的C2-C3單鍵和-OH破壞了黃酮苷元的活性。Wu等［54］的研究也證實(shí)了這一結(jié)論。黃酮分子式見(jiàn)圖5。這一發(fā)現(xiàn)為今后研究提供了新思路，可以根據(jù)活性成分的分子結(jié)構(gòu)，明晰基團(tuán)對(duì)于抗炎功能的作用，整合不同成分的有效基團(tuán)，開(kāi)發(fā)出全新無(wú)毒的抗炎物質(zhì)，以提高生產(chǎn)效率。

圖5 黃酮分子式［54］