呂帥宜，林開(kāi)文，鄧雨婷，張婉君，張鈺蘋(píng)，林桃姑，屈慧娟，魏娜

(海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

胃潰瘍是以長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的周期性、節(jié)律性的上腹疼痛為主要臨床表現(xiàn)的消化系統(tǒng)疾病[1]，主要是由黏膜進(jìn)攻性因素(胃酸、活性氧等)與黏膜防御性因素(胃黏液和碳酸氫鹽分泌、前列腺素、NO等)不平衡引起[2-3]。乙醇是引發(fā)胃黏膜損傷的重要原因之一，乙醇刺激可直接損傷胃黏膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血漿滲出和出血，引起胃腔內(nèi)出血，加重組織缺血程度，從而影響胃黏膜正常的代謝及功能，減弱其抗損傷與修復(fù)的能力[4]。研究表明，乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍主要由炎癥和氧化應(yīng)激引起，表現(xiàn)為胃黏膜廣泛糜爛和出血斑塊，并伴隨大量促炎細(xì)胞和氧自由基產(chǎn)生和釋放，免疫細(xì)胞在潰瘍區(qū)域聚集，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化；此外，炎癥細(xì)胞的聚集和組織浸潤(rùn)參與潰瘍炎癥反應(yīng)導(dǎo)致局部或多發(fā)出血性潰瘍以及組織變性和壞死，從而加劇胃黏膜損傷程度[2,5-7]。治療胃潰瘍的傳統(tǒng)藥物主要包括組胺受體2型拮抗劑(雷尼替丁)、質(zhì)子泵抑制劑(奧美拉唑)及服用抗生素抑制幽門(mén)螺桿菌[8]。然而，上述傳統(tǒng)藥物均具有無(wú)法避免的不良反應(yīng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物與奧美拉唑或西咪替丁等傳統(tǒng)藥物的療效相當(dāng)甚至優(yōu)于傳統(tǒng)藥物，且具有較少的不良反應(yīng)[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，高良姜黃酮類(lèi)化學(xué)成分具有抗?jié)儭⒖寡趸?、抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種活性[10]，山奈素作為藥用植物高良姜根中黃酮類(lèi)化合物之一，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[11]，本課題組前期對(duì)高良姜總黃酮進(jìn)行了抗胃潰瘍研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)胃潰瘍具有一定療效[12]。為進(jìn)一步明確山奈素是否為高良姜抗乙醇型胃潰瘍的有效成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)山奈素進(jìn)行了抗?jié)兓钚约捌錂C(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及主要儀器

SPF級(jí)昆明小鼠60只，18～22 g，雌性，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證許可證號(hào)： SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)條件為12 h光/暗周期，室溫 (24±1) ℃，40%～60%濕度，自由飲食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《使用和照料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)際準(zhǔn)則》進(jìn)行。

IL-1β、IL-6、前列腺素E2(PGE2)、TNF-α、NO及環(huán)氧合酶-2(COX-2)試劑盒均購(gòu)自南京卡爾文生物科技有限公司；山奈素(成都麥德生物科技有限公司)；鹽酸雷尼替丁膠囊(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)；NF-κB p65、COX-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、β-肌動(dòng)蛋白兔抗小鼠單克隆抗體及HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光劑均購(gòu)自上海碧云天試劑公司；CX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；CS150GXL高速低溫離心機(jī)(日本Hitachi公司)；超聲勻漿機(jī)(美國(guó)BioSpec公司)。

1.2 動(dòng)物分組與給藥及急性胃潰瘍模型的建立

將60只小鼠隨機(jī)均分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，模型組，雷尼替丁組，山奈素低、中、高劑量組。正常對(duì)照組和模型組給予0.5% 羧甲基纖維素鈉，其他4組分別給予雷尼替丁(100 mg/kg)、低劑量山奈素(31.7 mg/kg)、中劑量山奈素(63.4 mg/kg)、高劑量山奈素(126.8 mg/kg)；所有小鼠灌胃容積均為20 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。在第7天最后一次給藥前24 h小鼠禁食不禁水，并在最后一次灌胃給藥后1 h，正常對(duì)照組用10 mL/kg生理鹽水灌胃，其余組用無(wú)水乙醇10 mL/kg灌胃建立急性胃潰瘍模型[13]，模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)為肉眼可見(jiàn)的胃黏膜出血和線型血斑。

1.3 樣本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率 建立急性胃潰瘍后1 h，采用異氟烷進(jìn)行麻醉，眼眶取血并迅速取出胃，沿著胃大彎剪開(kāi)，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，放置在白色蠟板上，用相機(jī)拍攝胃組織病變部分，根據(jù)出血黏膜病變面積評(píng)估潰瘍損傷指數(shù)，計(jì)算潰瘍抑制率。

潰瘍指數(shù)(UI)=1A+2B+3C；其中，A為≤1 mm的小潰瘍個(gè)數(shù)，B為>1 mm 且≤3 mm的潰瘍個(gè)數(shù)，C為>3 mm的線形潰瘍個(gè)數(shù)。

抑制率(%)=(UI1-UI2)/UI1×100%；其中，UI1為模型組潰瘍指數(shù)，UI2為山奈素各組潰瘍指數(shù)。

1.3.2 胃組織病理分析 取小鼠胃組織，用4%多聚甲醛溶液固定，通過(guò)不同梯度乙醇脫水，70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇各60 min，無(wú)水乙醇30 min；二甲苯透明20 min；石蠟包埋。切片厚3 μm；經(jīng)蘇木素染色5 min；水洗返藍(lán)；伊紅染色3 min；水洗、脫水透明，封片；倒置顯微鏡下觀察胃組織病理變化并進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)血清中炎癥相關(guān)因子含量 通過(guò)眼眶取血方式采集小鼠血液(未添加抗凝劑)，靜置4 h，于室溫3 000 r/min離心5 min，收集血清；根據(jù)ELISA試劑盒方法檢測(cè)血清中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2及NO含量。所有步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 免疫印跡法檢測(cè)組織NF-κB p65、COX-2和iNOS蛋白表達(dá) 用含蛋白抑制酶的蛋白裂解液(RIPA)裂解胃組織，4 ℃行12 000 r/min離心5 min；收集上清蛋白。用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用8% SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)樣品，采用90 V恒壓將樣品蛋白分離；恒壓將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，90 V，70 min(NF-κB p65、COX-2)和100 V，80 min(iNOS)；5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜1 h，加入1 ∶2 000稀釋的一抗(iNOS、NF-κB p65、COX-2及β-肌動(dòng)蛋白)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST清洗6次，每次5 min；加入二抗(1 ∶10 000稀釋)，室溫?fù)u床孵育2 h；用凝膠成像系統(tǒng)使用ECL超敏發(fā)光液檢測(cè)蛋白條帶，結(jié)果以目的蛋白/β-肌動(dòng)蛋白來(lái)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胃組織的大體評(píng)價(jià)

與模型組相比，山奈素低、中、高劑量組潰瘍指數(shù)顯著降低(P均<0.05)。山奈素組潰瘍抑制率呈劑量依賴(lài)關(guān)系，抑制率區(qū)間為44%～57%，其中高劑量抑制效果與雷尼替丁組相近，見(jiàn)表1。

正常對(duì)照組胃組織黏膜平整光滑，未見(jiàn)出血；與正常組相比，模型組表現(xiàn)為胃黏膜急劇損傷，表面粗糙，淺粉紅色凹凸不平且胃壁變薄，有大面積廣泛的出血性壞死和潰瘍性血斑形成，說(shuō)明成功建立乙醇誘導(dǎo)急性胃潰瘍模型；而與模型組比較，山奈素組和雷尼替丁組胃組織損傷有顯著改善，偶見(jiàn)出血點(diǎn)且高劑量組的抑制作用與雷尼替丁組相當(dāng)。見(jiàn)圖1。

表1 各組小鼠胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較

圖1 各組小鼠胃黏膜組織損傷情況(20×)

2.2 山奈素對(duì)胃潰瘍小鼠胃黏膜形態(tài)的影響

正常對(duì)照組小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜下層和固有層無(wú)血水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠胃黏膜細(xì)胞排列紊亂，黏膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，大量炎癥細(xì)胞(紅顆粒)浸潤(rùn)組織，細(xì)胞收縮，腺體間隙增大；與模型組相比，山奈素組和雷尼替丁組組織結(jié)構(gòu)完整性有所改善，黏膜損傷輕微，炎癥細(xì)胞積累和浸潤(rùn)較少，但仍有腺體排列紊亂。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠胃組織HE染色結(jié)果(400×)

2.3 山奈素對(duì)胃潰瘍小鼠血清中相關(guān)炎癥因子含量的影響

與正常組對(duì)照相比，模型組小鼠血清中COX-2、PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6、NO均顯著升高(P均<0.05)。與模型組相比，山奈素各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2及NO水平顯著降低(P<0.05或<0.01，表2)。由此表明，山奈素可以抑制炎癥因子分泌，減少胃潰瘍炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大化。

2.4 山奈素對(duì)胃潰瘍小鼠胃組織iNOS、COX-2、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組胃組織中iNOS、COX-2和NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高(P均<0.05)；與模型組相比，山奈素組與雷尼替丁組胃組織中iNOS、COX-2和NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05或<0.01)。由此表明，乙醇刺激激活NF-κB/COX-2通路，而山奈素和雷尼替丁的處理則抑制這些蛋白的激活，從而減輕胃潰瘍引起的炎癥損傷。見(jiàn)圖3。

表2 各組小鼠血清中相關(guān)炎癥因子含量的比較

①： 正常對(duì)照組；②： 雷尼替丁組；③： 山奈素低劑量組；④： 山奈素中劑量組；⑤： 山奈素高劑量組；⑥： 模型組；a： P<0.05，與正常組比較；b： P<0.05，c： P<0.01，與模型組比較

3 討論

研究表明，乙醇對(duì)胃黏膜的刺激可促進(jìn)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌，故炎癥也是乙醇誘發(fā)胃損傷的機(jī)制之一[14-15]。TNF-α含量升高可以增強(qiáng)微血管壁通透性，導(dǎo)致細(xì)胞解體釋放溶酶體、炎性遞質(zhì)、趨化中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖[16]；促炎因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)由TNF激活開(kāi)始，其次是IL-1β激活以及IL-6釋放[17]，TNF-α主要由T細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞分泌，IL-1β是另一種誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞積聚的細(xì)胞因子，可最終導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放[18]。IL-6作為典型的炎性細(xì)胞因子，能夠刺激炎癥部位的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生各種有害產(chǎn)物、活性氧自由基和溶酶體酶，在潰瘍的發(fā)生過(guò)程中起重要作用[19]。同時(shí)炎癥誘導(dǎo)的iNOS產(chǎn)生的NO具有細(xì)胞毒性作用，能產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞損傷[20]。本實(shí)驗(yàn)證明模型組小鼠NF-κB/COX-2通路處于激活狀態(tài)，促進(jìn)下游炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著性升高，iNOS活性增加，NO表達(dá)上調(diào)。

NF-κB是急性期炎癥中許多細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，NF-кBp65是其亞單位；在小鼠胃潰瘍組織中NF-κB被活化，抑制NF-κB活化則有利于潰瘍修復(fù)[13]。生理情況下胃黏膜分泌的COX-2較少，病理情況下則分泌增加；COX-2是PGE2合成酶，PGE2可以通過(guò)增加胃黏膜上皮碳酸氫鹽和黏液分泌、降低胃黏膜對(duì)H+的滲透性及維持黏膜血流等發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用[21-22]。抑制NF-κB/COX-2通路，可下調(diào)COX-2表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平，延緩炎癥發(fā)生發(fā)展[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山奈素和雷尼替丁均可以抑制NF-κB/COX-2蛋白表達(dá)并降低iNOS活性進(jìn)而減少NO產(chǎn)生，且高劑量在抑制效果方面優(yōu)于陽(yáng)性藥雷尼替丁。

綜上所述，山奈素可能通過(guò)抑制NF-κB/COX-2通路，下調(diào)下游炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量，降低iNOS活性，抑制NO產(chǎn)生；此外，山奈素可能是一種潛在有效的胃潰瘍補(bǔ)充藥物，且高劑量組在各個(gè)相關(guān)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)中均優(yōu)于中、低劑量，可為山奈素抗胃潰瘍實(shí)驗(yàn)提供一定的劑量參考。此外，NF-κB作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可經(jīng)多種上游信號(hào)靶點(diǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致自身活化，因此山奈素抗胃潰瘍與NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步研究。