王小明，蔣婷奇，方 蕾，譚躍浪，陳 浩

（1.浙江巨泰藥業(yè)有限公司；2.普洛藥業(yè)股份有限公司：浙江 衢州 324000）

頭孢克肟是一種口服的第3代頭孢菌素，抗菌譜廣，臨床上廣泛使用。頭孢克肟治療兒童細菌感染總有效率高于阿莫西林克拉維酸鉀[1]；用于治療小兒急性細菌性腸炎總有效率明顯高于頭孢克洛，已成為兒科常用的抗菌藥物[2]。但近年來，第3代頭孢菌素不良反應(yīng)發(fā)生率呈日趨增多，頭孢類抗生素中存在的分子雜質(zhì)是引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原[3-4]。此類抗生素用于注射用時必須控制產(chǎn)品中的高分子聚合物的含量。

頭孢克肟及其制劑聚合物檢測項在各國藥典中均未收載，目前《中國藥典》2015版收載的頭孢呋辛納、頭孢尼西鈉、頭孢噻肟鈉等聚合物檢測方法大多采用Sephadex G-10 凝膠色譜系統(tǒng)測定[5]。但該方法缺陷日益突出，如分析時間長，樣品輔料干擾，聚合物無法完全締合從而檢出誤差大等[6]。因此建立TSK gel 2500PWxl 凝膠色譜系統(tǒng)檢測聚合物的方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

頭孢克肟顆粒，生產(chǎn)商I，批號T41181202、T41181203、T41181204，規(guī)格50 mg；參比制劑頭孢克肟細粒，生產(chǎn)商II，DE061；規(guī)格50 mg；頭孢克肟原料，生產(chǎn)商III，批號AP004-1805-2048，頭孢克肟的質(zhì)量分數(shù)99.8%；頭孢克肟對照品，生產(chǎn)商IV，批號130503-201706，頭孢克肟計的質(zhì)量分數(shù)89.2%。雜質(zhì)對照品信息見表1。

表1 雜質(zhì)對照品信息Tab 1 Information table of impurity reference substance

磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，分析純；乙腈，甲醇，色譜純；水，超純。

Agilent 1260 高效液相色譜儀，包括Agilent VWD、Agilent Openlab CDS 工作站；XS 105 電子天平，XPE26電子天平。

1.2 溶液的配制

樣品溶液：取本品適量（約相當于頭孢克肟50 mg），置25 mL 量瓶中，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

對照品溶液：取頭孢克肟對照品約20 mg，精密稱量，置50 mL 量瓶，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取5 mL，置100 mL 量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

系統(tǒng)適用性實驗溶液：取樣品溶液適量，于70 ℃水浴加熱30 min，冷卻。

1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以剛性、球形、親水的多孔聚甲基丙烯酸酯樹脂鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L磷酸氫二鈉溶液、0.5 mol/L磷酸二氫鈉溶液體積比61:39）與乙腈（體積比97:3）為流動相（流動相1），體積流量0.6 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30℃。精密量取系統(tǒng)適用性實驗溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

系統(tǒng)適用性實驗溶液中雜質(zhì)峰E（與頭孢克肟相對保留時間約為0.89）與頭孢克肟峰的分離度應(yīng)不低于1.0；系統(tǒng)適用性實驗溶液中雜質(zhì)A 峰與頭孢克肟相對保留時間約為0.77；與頭孢克肟雜質(zhì)A峰相鄰的雜質(zhì)E 峰與頭孢克肟相對保留時間約為0.72，樣品溶液中保留時間小于雜質(zhì)E的聚合物雜質(zhì)峰與雜質(zhì)E峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

1.4 流動相選擇

頭孢克肟聚合物檢測項在各國藥典中均未收載，參考2015 年版《中國藥典》收載的頭孢地嗪鈉、頭孢米諾鈉聚合物的檢測方法，以剛性、球形、親水的多孔聚甲基丙烯酸酯樹脂鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（TSKgel G2500PWxl，7.8 mm×30 cm，7 μm），以磷酸鹽緩沖液為流動相對頭孢克肟的聚合物進行相關(guān)研究[5]。詳見表2。

表2 流動相配制Tab 2 Mobile phase preparation

1.5 色譜柱選擇

參考文獻[7]中頭孢克肟高分子雜質(zhì)的檢測條件，采用不同色譜柱、波長對本品（頭孢克肟工作對照品）聚合物進行考察。

色譜柱，正相柱，TOSOH TSKgel G2000HHR 30 cm×7.8 mm；色譜柱，反相柱，TSKgel G2500PWxl，7.8 mm×30 cm。流動相DMF+30 mmol/L LiBr+10mmol/L H3PO4（流動相7，DMF為N,N-二甲基甲酰胺），柱溫25 ℃，體積流量0.33 mL/min，樣品的質(zhì)量濃度2 g/L，進樣量5 μL，檢測波長288 nm（根據(jù)紫外吸收光譜，288 nm 處為最大吸收擬定）、280 nm（文獻條件）、254 nm（同類品種聚合物測定波長）。

1.6 測定方法及限度

精密量取對照品溶液、樣品溶液10 μL分別注入液相色譜儀，在系統(tǒng)適用性實驗符合上述要求的條件下，記錄色譜圖。樣品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，按外標法以頭孢克肟峰計算。除溶劑峰外，所有保留時間小于雜質(zhì)E峰保留時間的雜質(zhì)總量不得過1.0%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

按1.4節(jié)方法，結(jié)果見表3。

表3 色譜柱篩選Tab 3 Column screening

由表2 可知，按文獻條件用正相柱在288 nm波長處測定的對照品的聚合物結(jié)果，與擬定條件用反相色譜柱在波長288 nm 處測定的頭孢克肟工作對照品的聚合物結(jié)果基本一致，但雜質(zhì)個數(shù)反相柱更佳。但正相柱條件不適合于考察頭孢克肟相關(guān)制劑在熱水中聚合物的變化情況，且文獻條件流動相中DMF的紫外截止波長為268 nm，無法選擇254 nm 作為其檢測波長，故頭孢克肟聚合物的測定未選擇文獻色譜條件作為檢測條件。

2.2 檢測波長選擇

由樣品紫外吸收光譜可知，樣品在288 nm 波長處有最大吸收；而同類產(chǎn)品聚合物的檢測波長均為254 nm，故比較在2種波長條件下對頭孢克肟工作對照品的聚合物進行測定，結(jié)果表明，對照品在波長288 nm 處測定的聚合物結(jié)果低于在波長254 nm 處測定的聚合物結(jié)果，故參考同類品種聚合物測定的波長，選擇254 nm 為本品聚合物的檢測波長。

2.3 流動相選擇

在考察頭孢克肟顆粒在熱水中聚合物變化情況的實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在熱水中降解產(chǎn)生的雜質(zhì)E峰與主峰以及聚合物峰分離較差，產(chǎn)生的雜質(zhì)E對聚合物的測定有一定的干擾，故對流動相進行篩選，以排除可能產(chǎn)生的雜質(zhì)E對本品聚合物測定的干擾。因此，在該實驗中對磷酸鹽緩沖液及有機相乙腈比例進行考察，結(jié)果見表4。

表4 流動相篩選結(jié)果Tab 4 Mobile phase screening results

由表4可知，綜合考慮主峰保留時間、雜質(zhì)E與雜質(zhì)峰分離度、雜質(zhì)E與主峰分離度、主峰理論板數(shù)等相關(guān)指標，選擇流動相4作為頭孢克肟聚合物測定的流動相，其色譜見圖1。

圖1 流動相4色譜Fig 1 Chromatogram of mobile phase 4

2.4 專屬性

2.4.1 空白實驗

取空白溶劑（質(zhì)量分數(shù)20%甲醇）過濾，直接進樣；取樣品空白輔料約5 mg，置25 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇振搖溶解5 min，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜，結(jié)果表明，空白溶劑、空白輔料不干擾本品聚合物測定。

2.4.2 系統(tǒng)適用性

取樣品細粉適量（約相當于頭孢克肟50 mg），置25 mL量瓶中，加5 mL甲醇振搖溶解5 min，加水稀釋至刻度，搖勻，于70 ℃水浴加熱30 min，冷卻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜，結(jié)果見表5。

表5 頭孢克肟顆粒聚合物系統(tǒng)適用性結(jié)果Tab 5 Applicability results of cefixime granules polymer system

由表5可知，雜質(zhì)E峰（與頭孢克肟相對保留時間約為0.89）與頭孢克肟峰的分離度應(yīng)不低于1.0，各成分之間的分離度均符合要求。

2.4.3 雜質(zhì)定位

頭孢克肟特定雜質(zhì)（雜質(zhì)A、B、C、D、E、F）在聚合物條件下相對保留時間的確認。

雜質(zhì)溶液：精密稱取頭孢克肟雜質(zhì)A、B、C、D、E、F 約2 mg，分別置25 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過。

藍色葡聚糖2000 樣品溶液：精密稱取藍色葡聚糖2000（SLBW8211）約30 mg，置25 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，結(jié)果見表6。

表6 特定雜質(zhì)的定位研究結(jié)果Tab 6 Location study results of specific impurities

由表6可知，在聚合物含量統(tǒng)計中應(yīng)扣除特定雜質(zhì)。

2.5 定量限與檢測限

聚合物雜質(zhì)的定量限與檢測限以頭孢克肟定量限與檢測限代替。

按照要求，測定溶液中信噪比（S/N）約為3為檢測限，S/N約為10為定量限。

2.5.1 定量限

取頭孢克肟工作對照品適量（C16H15N5O7S2的質(zhì)量濃度4.04 mg/L），精密稱定，加甲醇溶解，用水逐步稀釋，濾過，進樣測定，使頭孢克肟峰S/N≈10，作為定量限溶液。進樣，計算精密度，結(jié)果詳見表7（A為峰面積）。

表7 聚合物定量限結(jié)果Tab 7 Results of quantitative limits of polymers

由表7 可知，峰面積和保留時間的精密度（RSD）分別為2%和0.11%，符合要求。

2.5.2 檢測限

取頭孢克肟工作對照品適量（C16H15N5O7S2的質(zhì)量濃度1.33 mg/L），精密稱定，加甲醇溶解，用水逐步稀釋，濾過，進樣測定，使頭孢克肟峰S/N≈3，作為檢測限溶液。進樣，結(jié)果詳見表8。

表8 聚合物檢測限結(jié)果Tab 8 Polymer detection limit results

由表8可知，信噪比大于3，符合要求。

2.6 線性與范圍

精密稱取頭孢克肟對照品114.2 mg，置25 mL量瓶中，加10 mL 甲醇振搖5 min 溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，作為線性貯備液。取貯備液配制不同含量的線性溶液1～線性溶液6。取線性溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。以濃度和峰面積計算線性方程，結(jié)果詳見表9。

由表9 可知，擬合線性方程為A/(AU·min)=[3 1017ρ/(mg·L-1)]+353.7，R2=1.000，RSD 為3.4%。頭孢克肟（以C16H15N5O7S2計）在質(zhì)量濃度4.04～2 423 mg/L內(nèi)與峰面積呈良好線性，符合驗證要求，線性回歸系數(shù)符合≥0.999 的驗證要求；y軸（峰面積）截距在測定含量的100%響應(yīng)量的2.0%以內(nèi)，符合驗證要求。

表9 聚合物線性與范圍Tab 9 Polymer linearity and range

2.7 精密度

2.7.1 重復(fù)性

取頭孢克肟對照品約20 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取5 mL，置100 mL量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；另精密稱取本品適量1.0 g（約相當于頭孢克肟50 mg），置25 mL 量瓶中，加甲醇5 mL，振搖溶解5 min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為樣品溶液，分別配制6份，由1名分析人員進行測定，結(jié)果表明，6次測定聚合物的質(zhì)量分數(shù)分別為0.53%、0.53%、0.53%、0.52%、0.53%、0.53%，RSD為0.8%（≤5.0%）重復(fù)性良好。

2.7.2 中間精密度

由另一個分析人員使用不同的儀器配制6份相同含量的樣品進行測定，結(jié)果表明，6次測定聚合物的質(zhì)量分數(shù)分別為0.51%、0.52%、0.51%、0.51%、0.51%、0.51%，RSD為0.8%（≤5.0%），2人所得12 個聚合物結(jié)果的RSD 為1.9%（RSD≤5.0%），精密度良好。

2.8 耐用性

2.8.1 溶液穩(wěn)定性

取頭孢克肟聚合物測定樣品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、6、8 h 進樣，考察聚合物變化情況，結(jié)果表明，樣品溶液在室溫避光條件下放置，聚合物個數(shù)一致；聚合物含量逐漸增大，樣品溶液應(yīng)臨用新制。

2.8.2 色譜參數(shù)變動

取樣品溶液，適當?shù)恼{(diào)節(jié)柱溫、檢測波長及流速，考察色譜條件變化后的聚合物結(jié)果情況。結(jié)果表明：通過考察柱溫（±2 ℃）、檢測波長（±2 nm）、體積流量（±0.05 mL/min）的改變，樣品聚合物個數(shù)與聚合物量均無明顯差異，本法耐用性良好。

2.9 樣品測定結(jié)果

3 批 頭 孢 克 肟 顆 粒T41181202、T41181203、T41181204，聚合物的質(zhì)量分數(shù)分別為0.094%、0.12%、0.12%。參比制劑（批號DE061）聚合物測定結(jié)果為0.086%，均符合限度要求（不超過1.0%）。

3 結(jié) 論

通過對不同色譜條件進行篩選，建立TSK 凝膠色譜法測定頭孢克肟顆粒聚合物。通過分析方法驗證，進行專屬性中溶劑空白、輔料空白無干擾，聚合物的質(zhì)量分數(shù)精密度中重復(fù)性與中間精密度在0.51%～0.53%，2 組結(jié)果RSD 為1.9%＜5.0%，在C16H15N5O7S2的質(zhì)量濃度4.04～2 423 mg/L時線性良好。溶液在常溫下放置不穩(wěn)定，需臨用現(xiàn)配，定量限、檢測限、耐用性實驗結(jié)果均符合要求，表明本研究中建立的凝膠色譜法操作簡單、專屬性強，對頭孢克肟顆粒聚合物測定方法提供借鑒。