黃興法 ， 徐 鑫 ， 張 晶 ， 王秀英 ， 劉玉蘭 ， 汪文俊 ， 康 萍

（1.中南民族大學武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074；2.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大， 如何降低外界環(huán)境因素對養(yǎng)殖業(yè)帶來的經濟損失一直是研究者關注的重點。 環(huán)境中的微生物，如細菌、真菌和病毒等均會導致仔豬在飼養(yǎng)過程中產生免疫應激反應，進而誘導動物炎癥。 脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，在組織細胞中，能快速誘導促炎細胞因子的產生，進而引起炎癥反應（Irtegun 等，2016）。miRNA 是一種約含22 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA 分子，在大多數(shù)真核生物中存在高度保守性 （Geng 等，2014）。 許多哺乳動物miRNAs 可以調節(jié)免疫反應和炎癥反應 （Qiu 等，2019；O"connell 等，2012）。 腓腸肌是小腿后面淺層的大塊肌肉，其組織中的蛋白酶體標志物、氧化應激、炎癥、線粒體呼吸鏈（MRC）活性、耗氧量等指標一直被廣泛研究（Barreiro 等，2016）。 雖然目前對LPS 刺激后誘導的機體組織編碼基因關鍵信號通路研究很多， 但對相關非編碼基因在炎癥反應中調控的研究并不多。因此，本試驗旨在研究仔豬腓腸肌相關miRNA 在發(fā)生炎癥斷奶仔豬的基因表達情況，為后續(xù)研究miRNA 在肌肉組織中的炎癥調控作用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 選擇體重為（7.1±0.9）kg 的杜×長×大斷奶仔豬42 頭，飼喂基礎飼糧14 d 后，設置對照組（注射 LPS 之前 0 h）和 LPS 組（注射 LPS 之后 1、2、4、8、12、24 h）。分別按體重 100 μg/kg 腹腔注射生理鹽水和LPS，然后屠宰取腓腸肌樣品待測。

1.2 試驗飼糧 飼糧配方采用玉米-豆粕型基礎飼糧，參照NRC（1998）仔豬營養(yǎng)需要進行配制，具體組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗材料 本試驗注射LPS 的血清型、來源、配制方法與汪洋等（2019）的一致。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.4 飼養(yǎng)管理 動物飼養(yǎng)試驗在動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室進行。 本試驗飼養(yǎng)管理方法參照陳會甫等（2018）的方法進行。

1.5 測定指標與方法 用 RNAiso Plus 試劑（#9108，TaKaRa） 提取腓腸肌組織總 RNA。 根據(jù)PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser（#RR047A，TaKa-Ra）說明書進行基因組 DNA 去除，并用mirVanaTMqRT-PCR 引物套裝（吉瑪基因，上海）和 SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）qPCR Kit （#RR420A，TaKaRa） 進 行 成 熟miRNA 定量檢測。 以 U6 為內參，并參照 Livak 等（2001）的 2-△△CT法進行計算。

1.6 統(tǒng)計學分析 試驗采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，結果采用“平均值±標準誤”表示，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 試驗結果

LPS 刺激對斷奶仔豬腓腸肌miRNA 相關基因表達量的影響結果見表2。 與對照組相比，LPS刺激后2 h，仔豬腓腸肌miRNA-10b 的mRNA 表達量顯著降低 （P ＜ 0.01）；LPS 刺激后 1 h， miRNA-1 和miRNA-206 的mRNA 表達量顯著降低（P ＜ 0.01）；但 LPS 刺激后 miRNA-133a 的 mRNA表達量無顯著變化（P ＞ 0.05）。

3 討論

給斷奶仔豬注射一定劑量的LPS 是建立仔豬炎癥的良好模型（Zhu 等，2013）。研究表明，LPS刺激后4 h 可誘導肌肉炎性細胞因子大量表達（李先根等，2019）。 還有研究報道，先天性免疫細胞可以處于不同的狀態(tài)， 具有不同程度的促炎和抗炎表型（Hanke 等，2013；Stephanie 等，2009），并伴隨著對宿主防御和炎癥的不同后果（Marrotte等，2010）。 汪洋等（2019）的研究也表明，LPS 刺激激活了炎癥信號通路， 使炎性細胞表達量顯著上調，并在不同時間點，這些基因呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的變化。 隨著現(xiàn)在對miRNA 的深入關注，發(fā)現(xiàn)不同的miRNA 對機體組織炎癥有著不同的調控功能。 例如：通過有效下調miRNA-DAB2IP 可以增強癌細胞的運動和侵襲性，促進NF-κB 信號的激活， 進而促進促炎癥和促血管生成因子的表達（Bellazzo 等，2018）。 miRNA-19b 通過抑制胸腺基質淋巴生成素下調小鼠哮喘模型的STAT3 信號來減少氧化應激程度（Ling 等，2017）。 miRNA-125b 上調可激活NF-κB 途徑促進類風濕關節(jié)炎（RA）炎癥（Zhang 等，2017）。 此外，炎癥相關的miRNA 在牛乳中的表達水平受到乳腺炎的影響，牛奶中的miRNA 有可能作為牛乳腺炎的生物標志物（Lai 等，2017）。 以上研究表明，機體內這些小分子RNA 雖然不能編碼蛋白質，但是其也能夠調控機體的炎癥相關信號通路。 因此本試驗的目的是研究LPS 處理前后不同時間點不同miRNA的表達，為后續(xù)研究miRNA 在肌肉組織中的炎癥調控作用提供科學依據(jù)。

表2 LPS 處理前后不同時間點miRNA 表達

miRNA-10b 是最先被證明在癌癥中有異常表達的 miRNA 之一（Mal 等，2017）。 迄今為止，已有超過100 項關于miRNA-10b 與18 種癌癥轉移的研究。 Sheedy 和 Medarova（2018）認為 miRNA-10b 作為癌癥治療和診斷靶點的潛力是非常重要的。此外，miRNA-10b 還與骨形成呈正相關，可促進體外成骨和抑制體外成脂（Li 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 2 h 后，miRNA-10b 表達顯著降低， 說明miRNA-10b 可能對動物早期免疫應激后起到了負調控的作用。miRNA-1 是最先被證明在肌肉細胞衍生物中特異表達的miRNA 之一（Nicholas 等，2005）。 截止到目前，已有 50 余項關于miRNA-1 在肌肉相關信號通路調控的研究。Cai 等（2015）認為，miRNA-1 與轉錄后調控多種與心肌電活動相關的離子通道和蛋白有關。此外，miRNA-1 還對心肌細胞肥大、細胞外基質沉積以及心臟重塑至關重要 （Luo 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h 后， 腓腸肌中 miRNA-1 表達顯著降低， 說明miRNA-1 可能對動物早期免疫應激也起到了負調控的作用。miRNA-206 是最先被證明在小鼠骨骼肌中有異常表達的miRNA 之一（Mccarthy 等，2007）。迄今為止，已有 20 余項關于miRNA-206 在肌肉組織中的研究。 Zhang 等（2019） 認為，miR-206 在骨骼肌生長發(fā)育調控中非常重要。此外，miRNA-206 還與乳腺癌有關，可作為預測乳腺癌患者預后的重要指標 （Xing 等，2016）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h 后， 腓腸肌中miRNA-206 表達顯著降低， 說明 miRNA-206 可能對動物早期免疫應激起到了負調控的作用。miRNA-133a 首次被證明是在成人骨骼肌中有異常表達的 miRNA 之一（Mccarthy 等，2007）。 迄今為止， 已有200 余項關于miRNA-133a 在肌肉中差異表達的研究。Ramos 等 （2018）認為，miRNA-133a 通過耗盡肌肉細胞內儲存并釋放其對靶基因表達的抑制作用，潛在地介導運動的生理適應。此外，miRNA-133a 還與腰椎骨密度呈負相關，通過促進破骨細胞分化參與了絕經后骨質疏松癥的調節(jié)（Zhong 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h后，miRNA-133a 無顯著變化，說明在仔豬應激早期可能沒有參與機體的炎癥調控。 綜上， 在本試驗中， 通過建立仔豬LPS 炎癥損傷模型顯示，仔豬腓腸肌組織中的 miRNA-10b、miRNA-1、miRNA-206 的基因表達量均顯著下調， 但miRNA-133a 的基因表達量無顯著變化，這表明在LPS 刺激后同一個miRNA 在不同機體組織炎癥反應中的表達也不一致。

4 結論

LPS 刺激下誘導腓腸肌相關基因miRNA-10b、miRNA-1 和 miRNA-206 在不同時間點均有顯著降低，表明這些miRNA 可能參與了肌肉炎癥早期相關信號通路的調控，可為后續(xù)miRNA 在肌肉組織中具體調控作用提供科學依據(jù)。