王復(fù)標(biāo) 戎玲玲 安 婷 余世洲 孫惠敏

(1井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 吉安 343009；2西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

葉片早衰是水稻生理代謝機能過早衰退的一種生理現(xiàn)象，是由遺傳因子調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程。我國大面積推廣種植的雜交水稻，在生育后期普遍穗大粒多，而葉片生育后期早衰已成為限制產(chǎn)量和品質(zhì)提高的重要因素[1-2]。水稻上部3 片功能葉分化起步晚、受光條件優(yōu)越、功能期較長，在生育后期主要為籽粒灌漿提供光合碳水化合物[3-4]。研究表明，水稻功能葉提供了籽粒灌漿結(jié)實所需光合碳水化合物的70%～80%[5-6]。因此，研究水稻生育后期不同葉位功能葉的光合生理特性衰老變化，對充分挖掘水稻品種的產(chǎn)量潛力，制定高產(chǎn)甚至超高產(chǎn)育種及栽培措施具有重要意義。

葉片衰老的原因較為復(fù)雜，其過程涉及葉綠素降解、葉片結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞、活性氧(reactive oxygen species， ROS)及抗氧化保護酶類活性降低以及衰老相關(guān)基因的表達(dá)等諸多代謝途徑[7-12]。目前研究葉片早衰的方法大多集中在高溫、高鹽、重金屬、紫外等逆境脅迫下誘導(dǎo)葉片衰老；分析脅迫條件下葉片衰老的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性及基因表達(dá)的變化[13-15]。然而，逆境脅迫往往會對植物造成較大傷害；且逆境脅迫誘導(dǎo)的早衰與水稻葉片自然衰老過程的生理代謝差異巨大。因此，逆境脅迫誘導(dǎo)葉片衰老的研究結(jié)果難以直接應(yīng)用于水稻生育后期耐早衰品種的選育指導(dǎo)。

研究人員通過物理、化學(xué)或輻射誘變等多種手段，獲得了小麥、玉米、大麥、水稻等農(nóng)作物的葉片早衰突變體，并對其調(diào)控基因進行了定位與克隆[16-18]。然而，這些突變體的株高和生育期普遍與野生型有明顯差異，大多數(shù)突變體在苗期或營養(yǎng)生長階段就顯示出較為明顯的葉片早衰癥狀[18-21]。孫出等[20]利用60Coγ 射線輻射浙恢7954 成熟種子，獲得了1 份早衰突變體els-R7954，該突變體基部葉片在分蘗期就出現(xiàn)較明顯的褐色早衰癥狀；至孕穗期，其上部3 片功能葉表現(xiàn)出早衰癥狀；到灌漿期，各功能葉基本枯萎死亡，生育期均難以持續(xù)至水稻成熟期。由于前人篩選獲得的突變體功能葉早衰癥狀基本在生育早期就已顯現(xiàn)，且功能葉生育期普遍較短，因此，已報道的突變體難以用來研究不同葉位功能葉在生育后期自然衰老過程中葉綠素?zé)晒夂涂寡趸x生理特性的變化。本研究選用經(jīng)60Co-γ 輻射誘變獲得的株高和生育期與野生型基本一致的葉片早衰突變體水稻材料，該突變體功能葉的衰老起始于生育后期，且生育期基本可以持續(xù)到水稻成熟期，比較分析了突變體與野生型上部3 片功能葉在生育后期自然衰老過程中葉綠素?zé)晒饧捌淇寡趸x的差異，旨在為進一步研究分析水稻葉片早衰機理及不同功能葉對籽粒灌漿的影響奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為抽穗后劍葉開始早衰的突變體(oryza sativapremature leaf senescence 2，ospls2)及其野生型浙恢7954(WT)。該突變體是通過對野生型浙恢7954成熟種子進行60Co-γ 射線輻射后篩選獲得，已種植到M8，突變體早衰性狀遺傳表現(xiàn)穩(wěn)定。突變體ospls2 的遺傳表現(xiàn)為，在水稻苗期到分蘗拔節(jié)期之前，其株高、葉片顏色、分蘗數(shù)與WT 幾乎無差別，外觀未表現(xiàn)出明顯的葉片早衰癥狀；但在孕穗期后，突變體葉片由下到上逐漸表現(xiàn)出衰老癥狀；到抽穗期，中部和下部功能葉(分別指倒2 葉和倒3 葉)已表現(xiàn)出較明顯的早衰癥狀，3～4 d 后，上部功能葉(劍葉)葉尖開始出現(xiàn)早衰癥狀。首先是葉尖處出現(xiàn)鐵銹狀斑點癥狀，之后早衰斑點癥狀沿葉脈逐漸擴展至整個葉片，到抽穗后28 d 左右，早衰癥狀覆蓋整個劍葉，隨后逐漸卷曲枯死，倒3 葉也在抽穗后21 d 左右逐漸卷曲枯死(ospls2 倒3 葉的生理指標(biāo)測定不包括28 d)，此時WT 上部3 片功能葉除倒2 葉和倒3 葉在抽穗后的28 d 表現(xiàn)正常的衰老黃化外，其他時期葉色基本保持正常的綠色(圖1)。

試驗于2019年在井岡山大學(xué)教學(xué)實驗農(nóng)場進行。5月下旬播種，6月下旬移栽，常規(guī)大田水肥管理。每品種種植3 個小區(qū)，每小區(qū)種植6 行×8 列。待水稻抽穗時，每品種選取同一天抽穗的植株掛牌標(biāo)記，在上午9：00-11：00 進行取樣，分別采集ospls2 和野生型上部3 片功能葉(劍葉、倒2 葉和倒3 葉)，每7 d 取樣一次，用于后續(xù)各項生理指標(biāo)的測定。隨機取樣，重復(fù)3 次。

1.2 測定項目與方法

1．2．1 葉綠素和葉綠素?zé)晒鉁y定 葉綠素含量測定：參照Lichtenthaler[22]的方法，80%丙酮提取后，采用UV-VIS-spectrophotometer-756(上海光譜儀器有限公司)測定葉綠素含量。光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，PSⅡ)葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定：采用Dual-PAM-100 雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(德國walz 公司)測定各時期功能葉葉綠素初始熒光(initial chlorophy fluorescence，F(xiàn)0)和PS Ⅱ最大光化學(xué)效率(maximum photochemical efficiency of PSⅡ，F(xiàn)v/Fm)。測定前試驗材料先遮光暗處理25 min，儀器測定模式選擇Fluo，分析模式選擇飽和脈沖分析(SP analysis)，其他參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置。

1．2．2 相對電導(dǎo)率和H2O2含量測定 相對電導(dǎo)率測定參照Pradhan 等[14]方法，采用浸泡法，將葉片用自來水沖洗干凈后用去離子水沖洗3 次，擦干水分，去除葉片主脈，葉片剪成2 cm 左右的長條。稱取0．1 g樣品于裝有10 mL 去離子水的試管中，重復(fù)3 次，室溫浸泡12 h，用雷磁DDS-307 電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定浸泡液電導(dǎo)率(R1)，然后沸水浴30 min，冷卻至室溫再次測定電導(dǎo)率(R2)，相對電導(dǎo)率＝R1/R2×100%。H2O2含量測定采用硫酸鈦法[23]。

1．2．3 抗氧化保護酶活性測定 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX) 活性測定參照Cakmak等[24]的方法。SOD 活性測定采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光還原法，以黃嘌呤氧化酶抑制率為50%時作為一個酶活力單位；APX 活性以抗壞血酸(ascorbic acid， ASA)被氧化時，溶液在290 nm 波長外的下降速率來計算。過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(catalase，CAT) 活性測定參照Scebba等[25]的方法，POD 活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定；CAT 活性利用H2O2在240 波長下有最大吸收進行測定，以1 min 內(nèi)A240吸光值下降0．1 為1 個酶活力單位(U)。

1．2．4 可溶性糖含量測定 將新鮮樣品先在120℃烘箱殺青，然后75℃烘干至恒重，研磨至粉末，稱取0．05 g 干樣粉末，為避免淀粉對測定的干擾，提取液采用80%乙醇，利用蒽酮法測定可溶性糖含量[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與制圖采用Microsoft Excel 2010 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ospls2 和WT 葉綠素和葉綠素?zé)晒獾牟町?/h3>

由圖2 可知，在水稻生育后期葉片自然衰老過程中，ospls2 除劍葉葉綠素含量在抽穗后0 d 與WT 劍葉無明顯差異外，倒2、倒3 葉均明顯低于同時期的WT，且隨著葉片的衰老，葉綠素含量迅速下降，至抽穗后21 d， 其劍葉、倒2 葉和倒3 葉葉綠素含量分別僅為抽穗期0 d 的49．70%、37．62%和35．09%。同一時期，WT 各功能葉間葉綠素含量差異不明顯，且均隨著葉片衰老而緩慢下降。在抽穗后21 d，WT 劍葉、倒2 葉和倒3 葉葉綠素含量分別較抽穗后0 d 下降了23．94%、30．59%和22．83%；同一時期的ospls2 劍葉、倒2 葉和倒3 葉的葉綠素含量分別下降了50．30%、62．38%和64．91%，ospls2 下降幅度明顯大于WT。將葉片葉綠素含量降低50%作為葉片功能期持續(xù)時間的衡量標(biāo)準(zhǔn)[1，8]，ospls2 各功能葉的功能期均小于21 d，而WT 各功能葉的功能期均大于21 d。對相同葉位的功能葉，ospls2 在整個取樣時期葉綠素a/b 值均明顯低于WT，且隨著葉齡的增加呈降低趨勢；從不同葉位的功能葉來看，ospls2 下部功能葉的葉綠素a/b 值明顯低于上部功能葉。WT 功能葉間的葉綠素a/b 值差異不明顯。

由圖3-A 可知，在整個取樣時期(除抽穗期0 d外)，ospls2 各功能葉的F0均明顯高于WT，且隨著葉片衰老明顯上升；從不同葉位功能葉來看，下部功能葉的F0明顯大于上部功能葉。WT 不同功能葉在取樣的早期(抽穗后0 ～14 d)F0均維持在較低水平，不同葉位功能葉間差異不明顯，抽穗后21 d 開始呈上升趨勢。由圖3-B 可知，WT 上部3 片功能葉中的Fv/Fm差異不明顯，僅在自然衰老后期(抽穗后14 d)開始下降。ospls2 除劍葉的Fv/Fm在衰老早期階段(抽穗后0～7 d)與WT 無明顯差別外，其他取樣時期，各功能葉的Fv/Fm均明顯低于WT，且隨著抽穗后天數(shù)的增加呈明顯下降趨勢，就不同葉位功能葉而言，表現(xiàn)為劍葉＞倒2 葉＞倒3 葉。

2.2 ospls2 和WT 相對電導(dǎo)率和H2O2 含量差異

ROS 的增加被認(rèn)為是引起葉片衰老的主要原因[3，7]。由圖4 可知，除倒3 葉外ospls2 另外2 片功能葉的H2O2含量和相對電導(dǎo)率均隨著葉片衰老呈明顯的上升趨勢，且總體表現(xiàn)為倒2 葉大于劍葉。不同取樣時期，ospls2 各功能葉的H2O2含量和相對電導(dǎo)率均明顯高于相同葉位的WT。WT 各功能葉之間的H2O2含量差異不明顯，但整體均隨葉片衰老而明顯上升。WT 各功能葉的相對電導(dǎo)率在葉片衰老早期(抽穗后0～7 d)均維持在較低水平，但倒2 葉和劍葉在葉片衰老后期(抽穗后21 ～28 d)明顯上升，倒3 葉則在抽穗后7～21 d 明顯上升(圖4)。

圖4 突變體ospls2 和浙恢7954(WT)抽穗后功能葉H2O2 和相對電導(dǎo)率的變化Fig.4 Variation of H2O2 and relative conductivity in functional leaves of the ospls2 mutant and its wild type Zhehui 7954 after anthesis

2.3 ospls2 和WT 抗氧化保護酶活性差異

抗氧化保護酶在植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除ROS 的功能，其活性的高低與植物葉片的衰老密切相關(guān)[6，8，17]。由圖5-A 可知，ospls2 各功能葉中的SOD 活性均隨著葉片衰老呈明顯下降趨勢，且倒3 葉明顯低于同一取樣時期的劍葉和倒2 葉。整個取樣時期(除抽穗期0 d外)，ospls2 各功能葉的SOD 活性均明顯低于WT。WT各功能葉SOD 活性高低表現(xiàn)為劍葉＞倒2 葉＞倒3 葉，其中，倒2 葉和倒3 葉均隨著葉片衰老呈緩慢下降趨勢，而劍葉表現(xiàn)為緩慢上升趨勢。由圖5-B、C 可知，整個取樣時期(除抽穗后0 ～7 d 外)，ospls2 各功能葉的CAT 和APX 活性均明顯低于WT，CAT 活性在抽穗后7～14 d 明顯降低，而APX 活性(除劍葉外)在抽穗后0～7 d 快速下降。WT 各功能葉的CAT 活性基本在抽穗后14 d 達(dá)到最大，APX 活性則在抽穗后0～7 d 較高，然后隨著葉片衰老明顯下降。由圖5-D 可知，POD 活性變化趨勢則相反，ospls2 劍葉和倒2 葉的POD 活性均隨著葉片衰老呈明顯的上升趨勢，而倒3葉呈下降趨勢。ospls2 各功能葉中POD 活性均明顯高于相同葉位的WT。WT 不同功能葉之間的POD 活性在葉片衰老早期(抽穗后0 ～7 d)差異不明顯，且均在抽穗后14～21 d 緩慢上升。

圖5 突變體ospls2 和浙恢7954(WT)抽穗后功能葉抗氧化保護酶的變化Fig.5 Variation of the activities of antioxidant protective enzyme in functional leaves of the ospls2 mutant and its wild type Zhehui 7954 after anthesis

2.4 ospls2 和WT 可溶性糖含量的差異

水稻可溶性糖含量可直接反映生育后期功能葉光合碳同化能力，其含量降低被認(rèn)為是葉片衰老的基本特征[7，13]。由圖6 可知，在整個取樣時期，ospls2 各功能葉可溶性糖含量均明顯低于相同葉位的WT，且均在抽穗后7～14 d 明顯下降，其中下部功能葉可溶性糖含量明顯低于上部功能葉。WT 劍葉可溶性糖含量在整個取樣時期(除抽穗后21 d 外)明顯大于倒2 葉和倒3 葉，其中，劍葉在抽穗后21 d 下降至最低，倒2葉和倒3 葉均在抽穗后14 d 下降至最低。

3 討論

圖6 突變體ospls2 和浙恢7954(WT)抽穗后功能葉可溶性糖含量Fig.6 Variation of the soluble sugar in functional leaves of the ospls2 mutant and its wild type Zhehui 7954 after anthesis

目前已有關(guān)于部分水稻葉片早衰突變體的相關(guān)報道，其葉片早衰表型分別為：osled葉片為枯斑早衰[2]，es5 葉片為苗期早衰[5]，es3(t)[10]和esl5[16]葉片均為黃化早衰，els-R7954[20]為葉片出現(xiàn)褐色斑點早衰。本試驗研究的突變體ospls2 和els-R7954 選育途徑相同，均采用60Co-γ 射線輻射誘變浙恢7954 成熟種子選育。但2 個突變體在表型上存在明顯區(qū)別，els-R7954 葉片在分蘗期即表現(xiàn)出早衰癥狀，其功能葉在孕穗期表現(xiàn)出明顯的早衰癥狀，且在灌漿期全部枯萎死亡，導(dǎo)致els-R7954 在成熟期株高、葉片大小、分蘗數(shù)和莖稈粗細(xì)均明顯低于WT；ospls2 葉片的衰老明顯晚于els-R7954，其葉片在分蘗拔節(jié)期之前與WT 基本相同，均保持正常的綠色，功能葉則在生育后期開始衰老且生育期基本可以維持到水稻成熟期。究其原因，可能是ospls2 在整個生育期葉片衰老時間較els-R7954 推遲導(dǎo)致的。

葉綠素a/b 值的下降是衡量水稻葉片衰老的重要生理特征[8]。前人研究表明，水稻、玉米等農(nóng)作物的葉片衰老時，葉綠素和凈光合速率均明顯下降，且葉綠素a 的降解速率比葉綠素b 快[26-29]。其原因可能與葉綠素a 和葉綠素b 在光反應(yīng)過程中的功能不同有關(guān)。在葉綠體中，葉綠素a 主要存在于光系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ， PSⅠ)和PSⅡ中，其中，少量處于激發(fā)態(tài)的葉綠素a 在光能轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用，極易遭受ROS 的氧化損傷；而葉綠素b 主要存在于PSⅡ中，與特異性的天線蛋白結(jié)合成捕光色素蛋白復(fù)合物，主要在光反應(yīng)過程中起捕獲光能和聚集能量的作用[30-31]。Foyer 等[32]研究表明，葉綠體光反應(yīng)產(chǎn)生的ROS 含量約占植物細(xì)胞的90%，且葉綠素a 對ROS 的反應(yīng)較葉綠素b 更為敏感。Dietz 等[33]研究也顯示，隨著葉片的衰老作物葉肉細(xì)胞將產(chǎn)生大量的ROS。本研究中，隨著灌漿結(jié)實及葉片的衰老，早衰突變體各功能葉中的H2O2含量明顯高于WT，且下部功能葉總體高于上部功能葉，這可能是ospls2 葉綠素a/b 值下降速率大于WT 的重要生理因素之一。

通過對水稻生育后期葉片衰老過程中葉綠素?zé)晒獾挠^測，可以探究葉片自然衰老過程中光合生理特征變化與細(xì)胞結(jié)構(gòu)間的生理聯(lián)系[34-35]。F0是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放狀態(tài)時的熒光產(chǎn)量，代表不參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的初始光能輻射部分，其大小與葉綠素含量有關(guān)。李小蕊等[34]研究表明，F(xiàn)0隨著葉綠素含量的降低而下降，但PSⅡ光反應(yīng)中心損傷或者失活又可以使其升高，因此，在葉片衰老過程中F0的升高或者降低主要與引起其變化的關(guān)鍵因素有關(guān)。本研究表明，ospls2 功能葉Fv/Fm總體明顯小于WT，且衰老程度大的下部功能葉明顯小于上部功能葉，表明早衰突變體的PSⅡ光反應(yīng)中心損傷或者失活明顯高于WT，這可能是引起其初始熒光F0上升的主要原因之一，說明在水稻生育后期功能葉自然衰老過程中，早衰突變體F0變化的方向主要取決于其PSⅡ光反應(yīng)中心的損傷與破壞。

酶促抗氧化系統(tǒng)是植物清除ROS 的重要系統(tǒng)，可以迅速清除逆境脅迫、氧化損傷等各種代謝過程產(chǎn)生的ROS，使葉片ROS 始終維持在較低水平，保護植物免遭ROS 的氧化損傷[17，36]。在本研究中，ospls2 各功能葉中的SOD、CAT 和APX 活性明顯低于相同葉位的WT，且均隨著葉片的衰老明顯下降，表明在水稻生育后期葉片衰老過程中，抗氧化保護酶活性的降低導(dǎo)致ROS 不能被及時清除，這可能是引起早衰突變體葉片過早衰老的主要原因。生育后期ospls2 功能葉葉綠素含量降低和相對電導(dǎo)率增加都表明其葉片結(jié)構(gòu)遭遇了氧化損傷。前人研究表明，當(dāng)植物遭遇短暫的生物或非生物脅迫時，可以誘導(dǎo)植物抗氧化保護酶活性瞬時增加[2，7，14]。本研究結(jié)果顯示，ospls2 劍葉的抗氧化保護酶活性在葉片衰老的起始階段(抽穗后0～7 d)并未表現(xiàn)出瞬時上升現(xiàn)象，而WT 劍葉的抗氧化保護酶活性在葉片衰老的起始階均有不同程度的緩慢上升，這可能是WT 功能葉ROS 含量明顯低于ospls2 的重要原因。值得注意的是，在生育后期水稻功能葉衰老過程中，兩試驗材料功能葉中不同抗氧化保護酶活性下降的起始時間不同。其中，ospls2 功能葉CAT 活性在抽穗后7～14 d 才明顯下降，而APX 活性則在抽穗后0～7 d 即表現(xiàn)出明顯的下降趨勢；WT 功能葉CAT 活性的下降時間也明顯晚于APX。表明ospls2 功能葉衰老起始階段H2O2的積累可能主要與其APX 活性的降低有關(guān)，而衰老的中后期(抽穗后7 ～14 d)H2O2的積累可能主要源于CAT 活性的快速下降。

POD 是植物遭遇逆境脅迫時清除ROS 的關(guān)鍵酶，但關(guān)于葉片衰老過程中POD 活性的變化卻不明確。Hui 等[17]研究小麥生育后期劍葉的衰老發(fā)現(xiàn)，小麥滯綠突變體(tag1)和野生型的劍葉POD 活性隨著葉片的衰老明顯上升。王貴民等[6]研究高產(chǎn)雜交水稻生育后期劍葉的衰老發(fā)現(xiàn)，劍葉POD 活性隨著葉片的衰老明顯降低。本研究中，ospls2 各功能葉的POD 活性均明顯高于WT，且均隨著葉片衰老明顯上升。Vianello 等[37]對植物與微生物互作過程的研究顯示，POD 可以催化植物質(zhì)膜NADPH 氧化酶產(chǎn)生大量的ROS。此外，前人研究也表明，在各種逆境脅迫過程中，POD 具有雙功能酶活性：一方面，在逆境脅迫時，其可以催化H2O2生成水；另一方面，它還可以催化質(zhì)膜NADPH 氧化酶使植物產(chǎn)生ROS[25，36-37]。本研究推測POD 可能主要起促進ROS 產(chǎn)生致使葉片加速衰老的作用，而未起到抗氧化保護的功能。ospls2 功能葉葉綠素含量和可溶性糖含量的降低以及相對電導(dǎo)率的上升也可能是POD 在葉片衰老過程中對葉片結(jié)構(gòu)的損傷作用導(dǎo)致的。

4 結(jié)論

水稻突變體ospls2 功能葉葉綠素?zé)晒夂涂寡趸副Ｗo系統(tǒng)與生育后期葉片衰老密切相關(guān)。在整個抽穗灌漿結(jié)實期，ospls2 各功能葉葉綠素含量，葉綠素a/b值，F(xiàn)v/Fm，SOD、CAT 和APX 活性均明顯低于相同葉位的WT，且均隨著葉片的衰老明顯降低；POD 活性變化趨勢則相反。在功能葉衰老早期，ospls2 ROS 的積累主要源于APX 活性的降低，在衰老中后期則可能主要與CAT 活性的降低有關(guān)。因此，可能是早衰突變體抗氧化保護酶系統(tǒng)的過早崩潰造成其葉片結(jié)構(gòu)過早損傷，導(dǎo)致使其功能葉在生育后期光合碳水化合物供應(yīng)不足而衰老。