從 青 倪曉祥 程龍軍

(浙江農(nóng)林大學/亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300)

植物在生長發(fā)育過程中，極易遭受干旱、鹽堿、極端溫度等非生物逆境脅迫的影響。同時，在長期進化中，植物自身也形成了一套應對環(huán)境脅迫的機制，在逆境脅迫產(chǎn)生時，使其能夠迅速感受到逆境信號，進而從分子、細胞、生理和發(fā)育水平上提高植物對逆境脅迫的適應能力和抗性[1-2]。分子水平上，轉錄因子作為控制基因時空表達的開關，在植物逆境脅迫響應中發(fā)揮重要功能[3-4]。參與植物非生物逆境脅迫的轉錄因子種類眾多，包括NAC、bZIP、WRKY、MYB、DREB、ERF等[5]。其中，NAC(NAM、ATAF1/2 和CUC2)轉錄因子是植物特有的大型轉錄因子家族之一。NAC 轉錄因子不僅參與植物生長和發(fā)育[6]，而且在抵抗低溫、干旱、高鹽、病原菌等多種生物和非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[7]。

最早在矮牽牛(Petumnia hybrida)中發(fā)現(xiàn)NAC基因，該基因缺失影響根尖分生組織和葉片發(fā)育[8]。NAC基因還被證明參與植物側根發(fā)育[9-10]、頂端分生組織分化[11]、次生細胞壁形成[12]、器官衰老[13]和花發(fā)育[14]等過程。近年研究表明，NAC與非生物脅迫的響應密切相關。參與非生物逆境響應的NAC基因統(tǒng)稱為SNAC(stress-relatedNAC)[15]，如水稻(Oryza stativa)SNAC1 基因超表達轉基因株系在田間遭受嚴重干旱情況下，結實率仍比對照組高22%～34%，其營養(yǎng)生長階段的抗寒性與耐鹽性也顯著提高[16]。鷹嘴豆(Cicer arietinumL．)CarNAC6 在擬南芥(Arabidopsis thliana)中超表達也能提高轉基因株系的抗旱和耐鹽性[17]。同一植物中不同NAC 轉錄因子發(fā)揮的功能不同，胡楊(Populus euphratica)中的PeNAC036 在擬南芥中超表達能顯著提高轉基因株系對干旱和高鹽的抗性；而PeNAC034 的超表達擬南芥轉基因株系卻提高了對干旱和高鹽脅迫的敏感性；楊樹中超表達另一個NAC 基因PeNAC045，則會使植株在鹽和干旱脅迫下降低氣孔導度、呼吸速率和凈光合速率[18]。由于在逆境響應中NAC 發(fā)揮的功能多樣且復雜，因此有必要對在非生物逆境響應中發(fā)揮重要功能的NAC 基因進行深入研究。

桉樹(Eucalyptus)作為我國南方栽培的重要用材樹種，低溫、干旱等逆境一直是影響其栽培效益和限制其栽培范圍的主要原因。浙江農(nóng)林大學桉樹抗逆分子育種課題組前期在巨桉中發(fā)現(xiàn)一個參與非生物逆境響應的NAC基因EgrNAC1(Eucgr.I00058)，其在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達，都有明顯的誘導效應，同時還參與脫落酸(abscisic acid，ABA)的信號轉導，推測其可能在桉樹非生物逆境響應中發(fā)揮重要功能[19]。本研究利用異源轉化手段，在擬南芥中超表達EgrNAC1，初步分析轉基因株系在低溫、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫下的響應，以期為深入研究該基因在非生物逆境響應中的功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型(Col)。EgrNAC1 基因來自于浙江農(nóng)林大學保存的巨桉G5 無性系材料。擬南芥生長環(huán)境條件為25℃/15 h(光)、22℃/9 h(暗)，相對濕度65%，光照強度為100 μmol.m-2.s-1。

1.2 EgrNAC1 超表達載體構建、擬南芥遺傳轉化

超表達載體構建采用Gateway 技術，載體選用pGWB 系列含35S 啟動子的pGWB402Ω。以巨桉葉片中提取的mRNA 為模板逆轉錄為cDNA。根據(jù)EgrNAC1 mRNA 序列設計Gateway 載體引物(表1)。以逆轉錄后獲得的cDNA 為模板進行PCR 擴增，利用BP ClonaseTMEnzyme Mix(賽默飛，美國)將擴增產(chǎn)物與入門載體pDONR221 進行重組反應。獲得的陽性克隆測序正確后，再用LR ClonaseTMEnzyme Mix(賽默飛，美國)進行Gateway 重組反應。重組的陽性克隆提取質粒后，利用電擊法轉入農(nóng)桿菌GV3101 中，利用蘸花法轉化擬南芥。侵染植株種子在含60 mg.L-1卡那霉素(Kanamycin)的1/2 MS 培養(yǎng)基上進行篩選，獲得的陽性株系通過分子檢測后，繼續(xù)進行繁殖，篩選，直至獲得T3 轉基因純合株系。

1.3 轉基因擬南芥株系中EgrNAC1 的表達

將獲得的3 個超表達EgrNAC1 擬南芥T3 轉基因純合株系和Col 于基質中培養(yǎng)10 d，剪取完全展開的蓮座葉片，利用RNA 提取試劑盒(北京天根生物技術公司)提取RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa，日本)反轉錄為cDNA，設計引物(表1)，以AtACTIN為內(nèi)參，進行半定量PCR 試驗。同時，用Bio-Rad CFX96(Bio-Rad， 美國)進行實時熒光定量PCR(quanitative real-time PCR， RT-qPCR)試驗，用系統(tǒng)自帶的Bio-Rad CFX Manager(Ver 1．5．5．34)軟件進行結果計算，分析轉基因純合株系中EgrNAC1 的表達情況。

1.4 低溫、干旱和高鹽處理試驗

將EgrNAC1-OE1 和EgrNAC1-OE8 純合轉基因株系與Col 種子均勻撒播至濕潤的育苗基質中，4℃處理2 d，轉移至擬南芥生長室培養(yǎng)。子葉展開后，移栽至含相等重量基質的育苗盆中培養(yǎng)2 周，進行低溫、干旱和高鹽處理試驗。野生型和不同轉基因株系各處理3盆，每盆9 株苗，重復3 次。

低溫處理：將長勢一致的幼苗轉移至Snijders 微氣候控制生長箱(MC1000，荷蘭)，參考Steponkus等[20]和閻依超等[21]的方法，根據(jù)預試驗結果進行調整。將幼苗放置于-6℃處理12 h 后，再于4℃處理1 d，然后轉移至生長室恢復5、9 d 后，拍照并統(tǒng)計存活率。

干旱處理：選取長勢一致的幼苗，對育苗盆稱重，用水調整各育苗盆使其重量一致，停止?jié)菜林仓耆~片完全萎蔫后再恢復澆水3 d，拍照并統(tǒng)計存活率。

高鹽處理：參考Liu 等[22]的方法，選取長勢一致的幼苗，澆灌NaCl 溶液(300 mmol.L-1)，每盆每天澆灌100 mL，每天1 次，處理至產(chǎn)生鹽漬化并呈現(xiàn)差異(約2 周左右)后，拍照。

1.5 離體葉片失水率測定

選取長勢一致的2 周苗齡幼苗，于稱量紙上快速剪取第3 ～第6 片蓮座葉，每20 片為一個樣本，稱重(m0)，設置3 次重復，每隔1 h 稱重1 次(m1)。按照公式計算失水率：

1.6 低溫響應相關基因的定量表達分析

將14 d 苗齡的擬南芥幼苗轉移至低溫培養(yǎng)箱進行低溫處理(方法見1．4)，提取RNA，進行反轉錄。同時，參考劉靜妍等[23]的方法設計擬南芥低溫響應相關基因AtCBF1、AtCBF2 及AtRD29A等定量引物，進行RT-qPCR，試劑由大連TaKaRa 公司提供，定量引物由南京金斯瑞生物工程技術有限公司合成，具體序列如表1 所示。

表1 引物列表Table 1 The list of primers used

1.7 ABA 處理方法

取Col 和EgrNAC1 超表達株系EgrNAC1-OE1，EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8 純合株系的種子，用75%乙醇消毒10 min，均勻點播在含0．5 μmol.L-1ABA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上，同時點播在未添加ABA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上(對照)，均在4℃冰箱中放置48 h，然后正常培養(yǎng)10 d 后，觀察ABA 對轉基因株系的影響。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

RT-qPCR 結果利用2-ΔΔCt法[24]計算獲得。采用GraphPad Prism (ver 5．01)軟件作圖并進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 超表達 EgrNAC1 擬南芥轉基因株系中EgrNAC1 的表達

將構建好的載體遺傳轉化擬南芥植株后，篩選陽性株系并繁育至T3，獲得3 個純合體株系：EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8，并對這3 個株系進行EgrNAC1 表達情況分析(圖1-A)。結果表明，3個株系中EgrNAC1 都有較高豐度的表達。定量表達結果(圖1-B)進一步表明，EgrNAC1 在EgrNAC1-OE8株系中的表達量最高，EgrNAC1-OE1 次之，EgrNAC1-OE6 最低。

2.2 超表達EgrNAC1 轉基因擬南芥低溫處理下的表型分析

為了解EgrNAC1 在非生物逆境響應中的功能，對轉基因株系中EgrNAC1 表達量高的2 個轉基因株系EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE8 進行-6℃低溫處理。正常生長條件下，轉基因株系EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE8 生長2 周的植株與同苗齡野生型植株長勢一致。-6℃處理12 h 后，轉基因株系與野生型都產(chǎn)生不同程度凍害，然后，再于正常生長條件下恢復生長到第5天，轉基因株系的生長恢復情況明顯好于野生型，恢復9 d 后，轉基因株系幾乎完全恢復生長(圖2-A)，EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE8 的存活率分別達到了88．9%和81．5%，而野生型只有29．6%(圖2-B)。由此可見，EgrNAC1 的表達顯著提高了轉基因擬南芥的抗寒能力。

圖1 擬南芥野生型和EgrNAC1 超表達轉基因株系中EgrNAC1 的半定量(A)和定量(B)表達Fig.1 Semi-quantitative (A) and quantitative (B)expression analysis of EgrNAC1 in wide type and EgrNAC1 overexpression transgenic lines

2.3 超表達EgrNAC1 轉基因擬南芥低溫處理下抗寒相關基因的表達分析

參與植物低溫響應的分子調控途徑主要為CBF(CRT/DRE-binding factor)轉錄因子介導的植物低溫響應途徑[25]。針對ICE(inducer of CBF expression)-CBF 途徑中的重要基因AtICE1、AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、AtRD29A、AtCOR15、AtCOR47 等，分析了低溫處理下轉基因株系中上述基因的表達。由圖3 可知，4℃低溫處理下，2 個轉基因株系中AtCBF1、AtCBF2 和AtRD29A的表達量顯著上調，而其他基因無顯著變化。暗示轉基因株系抗寒能力的提高可能是通過EgrNAC1促進AtCBF1、AtCBF2 和AtRD29A的表達引起的。

2.4 超表達EgrNAC1 轉基因擬南芥干旱、高鹽處理下的表型分析

圖2 野生型和EgrNAC1 超表達轉基因株系-6℃低溫處理后恢復5 d 和9 d 的表型(A)與存活率(B)Fig.2 Phenotype of wide type and EgrNAC1 overexpression lines after 12 h treatment of -6℃and recover for 5 and 9 days under normal temperature (A). And, survival ratio of wide type and EgrNAC1 overexpression lines under low temperature treatment(B)

由圖4-A 可知，干旱處理后，恢復供水3 d，野生型擬南芥葉片從失水萎蔫狀態(tài)中逐漸恢復，而轉基因株系EgrNAC1-OE1 和EgrNAC1-OE8 則無法恢復，存活率為0，而野生型存活率為100%， 表明超表達EgrNAC1 的轉基因擬南芥植株對干旱的敏感程度提高。進一步對離體葉片的失水率進行比較，發(fā)現(xiàn)2 個轉基因株系離體葉片失水率均高于野生型(圖4-B)，表明干旱條件下轉基因株系對干旱敏感性的提高可能與葉片過快的失水反應有一定的關系。

圖3 4℃低溫處理12 h 野生型和EgrNAC1 超表達株系中AtICE1,AtCBF1,AtCBF2,AtCBF3,AtRD29A,AtCOR15 和AtCOR47 的表達分析Fig.3 Analysis of gene expression of AtCBF1,AtCBF2 and AtRD29A under 4℃treatment for 12 hours in wide type and EgrNAC1 overexpression lines

高鹽(300 mmol.L-1NaCl)處理2 周后，野生型和轉基因株系都表現(xiàn)葉片黃化、焦枯等鹽漬化傷害表型。但EgrNAC1-OE1 和EgrNAC1-OE8 的鹽害更為嚴重，葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，植株生長受到更加明顯的抑制作用，表明EgrNAC1 轉基因擬南芥株系對鹽的敏感度也高于野生型(圖5)。

圖4 野生型和EgrNAC1 轉基因株系干旱處理下的表型(A)與葉片離體失水率比較(B)Fig.4 Phenotype(A) and water loss ratio(B) of wide type and EgrNAC1 overexpression lines under drought treatment

圖5 野生型和EgrNAC1 超表達轉基因株系高鹽處理表型Fig.5 Phenotype of wide type and EgrNAC1 overexpression lines under salt treatment

2.5 超表達EgrNAC1 轉基因擬南芥ABA 處理下的表型分析

ABA 影響植物對非生物逆境的響應[26]。為了進一步分析逆境響應中影響EgrNAC1 發(fā)揮功能的因素，對EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8 進行ABA 處理。由圖6 可知，與野生型相比，EgrNAC1超表達轉基因株系葉柄更長，展開葉更大，根系更壯，說明EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8對ABA 的敏感程度大幅度降低，EgrNAC1 的表達影響了植株對ABA 的反應，進而可能會影響植株對ABA依賴性非生物逆境信號的響應。

3 討論

圖6 野生型和EgrNAC1 超表達轉基因株系ABA 處理10 d 后的表型Fig.6 Phenotype of wide type and EgrNAC1 overexpression lines treated with ABA after 10 days

NAC 是參與非生物逆境響應的一類重要轉錄因子，在調控植物抵抗低溫、干旱和高鹽等非生物逆境響應中發(fā)揮了重要作用。植物NAC 類轉錄因子中，大約有20%～25%的成員參與了至少1 種以上的非生物逆境響應，而且這些NAC 類轉錄因子在進化上親緣關系很近，大都屬于同一個進化分支，統(tǒng)稱其為SNAC(stress-responsive NAC)[15]。EgrNAC1 也 屬 于SNAC類轉錄因子，為SNAC-A 亞類[19]。該亞類中的成員廣泛參與植物的低溫、干旱、高鹽和氧化脅迫等逆境響應[15]。擬南芥中的ANAC019、ANAC055、ANAC072 和ATAF1 都屬于該類成員，均受干旱和高鹽的強烈誘導[27-28]。同時，超表達ANAC019、ANAC055 和ANAC072 的擬南芥轉基因株系還顯著增強了對干旱的耐受性[29]。而ATAF1 被認為是非生物逆境響應的負調控因子，突變體ataf1 對干旱的耐受性強于野生型，同時，超表達ATAF1 的轉基因擬南芥株系對ABA、高鹽和氧化逆境的敏感性也增強[27]。水稻中屬于SNAC-A 亞類的SNAC1、SNAC2 和OsNAC3 ～5 也都被高鹽、干旱、低溫和ABA 誘導，水稻中超表達SNAC1能提高轉基因植株對干旱的抵抗能力，同時增加植株對ABA 的敏感性[30]。這表明SNAC-A 類的NAC 類轉錄因子廣泛參與了植物的非生物逆境響應過程。而EgrNAC1 同樣表現(xiàn)出明顯的非生物逆境響應，其在低溫、干旱、高鹽和ABA 處理后的表達都表現(xiàn)出明顯誘導效應[19]。

本研究在EgrNAC1 表達分析基礎上，通過超表達載體構建和擬南芥的異源轉化，進一步分析了EgrNAC1 在非生物逆境響應中發(fā)揮的功能，結果表明，超表達EgrNAC1 的轉基因擬南芥純合株系，對ABA的敏感性降低，對高鹽和干旱處理的敏感程度增強。同時，轉基因株系對低溫的抵抗能力卻大幅度增強。-6℃凍害處理12 h 后的存活率，相當于對照的29．6%，轉基因株系存活率達到80% 以上，表明EgrNAC1 對不同的非生物逆境產(chǎn)生的響應不同。很多植物中的NAC 類轉錄因子也有類似的現(xiàn)象，如南荻(Miscanthus lutarioriparius)MlNAC5 基因的超表達，提高了轉基因擬南芥株系對NaCl 的敏感性，但同時增強了植株的抗寒與抗旱能力[31]。GmNAC2 在煙草中超表達后，轉基因植株對干旱、高鹽和低溫的敏感性都增強，但抵抗氧化逆境的能力得到大幅度提高[32]。水稻OsNAC095 在干旱和低溫逆境中發(fā)揮的功能也表現(xiàn)出雙面性，抑制OsNAC095 的表達能夠提高水稻植株的抗旱性能，卻降低了其對低溫的耐受能力[33]。這反應了NAC 類轉錄因子在植物非生物逆境響應中功能的復雜性。EgrNAC1 可能也具有這種特點，對干旱、高鹽和低溫有不同的響應。

在非生物脅迫條件下，EgrNAC1 與很多植物中的NAC 類基因也有不同的表現(xiàn)。如水稻中超表達SNAC1 提高對ABA 的敏感性，在干旱信號產(chǎn)生時迅速關閉氣孔，降低了組織內(nèi)部水分損失，進而提高植株的抗旱性[30，34]。小麥(Triticum aestivum)TaNAC29 也有類似特征[35]。但檸條(Caragana intermedia)CiNAC3和CiNAC4 基因超表達株系卻降低了對ABA 的敏感性，其耐鹽性提高[28]。EgrNAC1 超表達擬南芥植株對ABA 敏感性降低，同時對干旱、高鹽的敏感性增強。超表達EgrNAC1 擬南芥植株抗旱能力減弱可能是由于其對ABA 敏感性降低，導致干旱時植株葉片不能及時接收ABA 信號，氣孔關閉延遲而導致植株抵抗干旱的能力下降，這也與葉片離體試驗結果吻合。

ICE-CBF 途徑是植物響應低溫逆境，調控低溫脅迫適應性的重要分子途徑[36-37]。研究表明，NAC 類轉錄因子也通過參與該條途徑調控植物對低溫脅迫的響應。香蕉(Musa acuminata)中的MaNAC1 是MaICE1的直接調控蛋白，同時還與MaCBF1 互作影響香蕉植株對低溫的響應[38]。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中MfNAC3 則可直接結合在MfNAC3 的啟動子上，作為一個正向調控因子調控植株的低溫逆境響應[39]。大豆GmNAC20 還可以直接結合在低溫響應下游基因RD29A的啟動子上發(fā)揮作用[10]。本試驗對低溫處理下EgrNAC1 超表達轉基因擬南芥株系中ICE-CBF 途徑及低溫響應的部分下游基因的表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)轉基因株系中2 個CBF基因AtCBF1 和AtCBF2，以及AtRD29A的表達量相對于野生型都有顯著升高，表明超表達株系低溫抗性提高很可能與EgrNAC1 對ICE-CBF 途徑基因的調控有關。

由于NAC 類轉錄因子處于多個非生物逆境信號交叉互作的位置，NAC 接受到不同的逆境信號后，會通過與其他響應蛋白的互作調控不同的下游基因，產(chǎn)生不同響應，從而導致NAC 基因功能的復雜性。EgrNAC1 可能也具有這種特性。因此，進一步研究EgrNAC1 在桉樹中參與ABA 信號轉導與低溫、干旱和高鹽逆境信號之間的交叉互作和調控機制，對了解其在桉樹抗逆中的地位及應用具有重要意義。

4 結論

巨桉中受低溫、干旱、高鹽和ABA 誘導表達的EgrNAC1，其超表達轉基因擬南芥株系對ABA 的敏感性下降。轉基因植株抗寒性顯著增強，但提高了對干旱和高鹽的敏感性。基因表達結果表明，EgrNAC1 參與低溫抗性增強效應可能與EgrNAC1 對ICE-CBF 途徑基因的調控有關。因此，EgrNAC1 可能參與了巨桉低溫、干旱和高鹽等非生物逆境的響應過程。這些結果有利于進一步研究和明確EgrNAC1 在桉樹中的功能和調控機制，為桉樹抗逆分子輔助育種工作提供了理論依據(jù)。