韋春艷 秦騰飛 董 娜 李玉青 董 濤 郭 婷 孫家良 王清連

(1 河南科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省棉麥分子生態(tài)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000)

棉花黃萎病是一種土傳維管束真菌病害，被稱為棉花的“癌癥”，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，對棉花生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。我國棉花黃萎病的主要致病菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahlia)[2]。它是一種土傳的半活體營養(yǎng)型絲狀真菌，在世界各地分布廣泛，可以侵染660 多種植物引發(fā)黃萎病[3]，導(dǎo)致棉花、芥菜、馬鈴薯、甜菜、向日葵等許多重要經(jīng)濟(jì)作物連年發(fā)生病害[4-6]。由于大麗輪枝菌具有寄主范圍廣、類型多、變異快、存活時間久、抗逆性強(qiáng)等特點，致使棉花黃萎病難以防治[7-9]。且陸地棉抗性種質(zhì)資源匱乏，抗性育種進(jìn)展緩慢[5]，因此研究棉花和黃萎病菌互作的分子機(jī)制，挖掘棉花抗病基因，對提高棉花抗病性具有重要意義。

酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白之間互作的有效分子生物學(xué)方法[10]，在檢測蛋白之間互作和篩選未知蛋白方面得到了廣泛的應(yīng)用[11-13]，構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA 文庫則是運用酵母雙雜交技術(shù)的前提。王宇秋等[14]構(gòu)建了水稻酵母雙雜交cDNA 文庫并利用文庫篩選到了56 個與稻曲病菌效應(yīng)因子Uv_1261 互作的蛋白。李帥等[15]構(gòu)建了草莓酵母cDNA 文庫篩選到15 個與草莓鑲脈病毒P6 互作的寄主因子，為明確其互作機(jī)理提供了理論依據(jù)。甕巧云等[16]篩選擬南芥cDNA 文庫獲得了4 個可能與抗灰霉病基因T1N6-22 互作的蛋白，為闡明其調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。鄭凱等[17]構(gòu)建了海島棉纖維均一化酵母cDNA 文庫并篩選到了4 個與GbTCP5 互作的蛋白。還有研究者利用酵母雙雜交篩選到了一些參與小麥逆境反應(yīng)的候選蛋白[18-19]。但是，陸地棉酵母雙雜交cDNA 文庫的構(gòu)建鮮見報道，近年來國內(nèi)外學(xué)者對黃萎病的研究主要集中于抗病基因鑒定、病害循環(huán)、抗性品種培育等方面，并取得了一定的研究進(jìn)展，但對于黃萎病菌和棉花互作機(jī)制的研究較少，棉花抗黃萎病機(jī)理還不十分清楚。通過構(gòu)建棉花酵母雙雜交cDNA 文庫，研究黃萎病菌和棉花互作機(jī)理，可為提高棉花抗病性提供理論依據(jù)。研究表明，黃萎病菌效應(yīng)因子可激活植物免疫反應(yīng)提高植物抗病性[20]，植株的免疫反應(yīng)程度越強(qiáng)其抗病性也越強(qiáng)[21]。植物受病原體侵染時，可以通過模式識別受體(pattern recognition receptors， PRRs)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而放大先天性免疫，激活第一層防御反應(yīng)(PAMP triggered immunity， PTI)[22]。病原菌要成功定植必須克服寄主的免疫防衛(wèi)反應(yīng)，所以病原菌又分泌效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主植物抑制其PTI 反應(yīng)[23]。一些植物進(jìn)化出了抗性蛋白能特異性識別病原菌效應(yīng)因子觸發(fā)另一層更強(qiáng)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity， ETI)來抑制病原菌的侵染[23-25]。大麗輪枝菌就可以分泌效應(yīng)蛋白抑制宿主的防衛(wèi)反應(yīng)[26]，輪枝菌屬特異的外泌蛋白(VdSCP7)是一種靶向宿主細(xì)胞核的大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白，植物在大麗輪枝菌侵染過程中可以識別VdSCP7 并激活ETI 免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗病性[27]。但是，目前關(guān)于VdSCP7 在棉花抗病過程中作用的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究通過構(gòu)建棉花cDNA 文庫和誘餌載體pGBKT7-SCP7，從而利用酵母雙雜交系統(tǒng)從棉花cDNA 文庫中篩選與VdSCP7 互作的蛋白，為進(jìn)一步從分子水平上解析VdSCP7 和棉花互作機(jī)理和提高棉花對黃萎病的抗性奠定基礎(chǔ)，也為利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究黃萎病菌蛋白特別是病原菌效應(yīng)因子與棉花互作提供資源。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大麗輪枝菌Vd991 菌株由河南省棉麥分子生態(tài)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室保存；國審棉花品種百棉1 號由河南科技學(xué)院棉花研究所提供，26℃溫室中培養(yǎng)，光照時間為14 h.d-1，相對濕度為60%～70%。

1.2 棉花總RNA 提取及ds cDNA 合成

取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)上活化培養(yǎng)的大麗輪枝菌菌絲，經(jīng)完全培養(yǎng)基(complete medium，CM)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后過濾收集孢子，調(diào)整孢子濃度為1×107CFU.mL-1，用蘸根法[28]侵染生長2 周左右的棉花幼苗，孢子侵染根部后，分別于3、6、9、12 d 后取樣，將棉花根系樣品混合提取總RNA。具體步驟按照RNAiso Plus Reagent 試劑盒說明書(TaKaRa，日本)進(jìn)行，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性后，用Oligotex-dT30＜Super＞mRNA 純化試劑盒(TaKaRa，日本)對mRNA 進(jìn)行分離純化，具體步驟參照說明書，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA質(zhì)量。再以含XhoⅠ酶切位點的Oligo(dT)18Anchor Primer 為引物，用SMARTerTMPCR cDNA 合成試劑盒(Clontech，美國)合成cDNA 第一鏈。

以含EcoR Ⅰ酶切位點的SMART (switching mechanism at 5′ end of RNA template)寡核苷酸為引物經(jīng)long-distance PCR(LD-PCR)合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA 經(jīng)EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切后，用CHROMA SPIN+TE-1000 (Clontech，美國) 柱純化回收大于500 bp 的雙鏈DNA(double stranded cDNA，ds cDNA)，用于構(gòu)建棉花cDNA 文庫，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 cDNA 文庫的構(gòu)建及擴(kuò)增

將棉花ds cDNA 與pGADT7 質(zhì)粒載體(Clontech，美國)用酶切連接的方法完成cDNA 文庫的構(gòu)建。將經(jīng)EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切處理的pGADT7 載體回收產(chǎn)物與純化回收的ds cDNA 用T4-DNA 連接酶連接。連接體系：7 μL pGADT7、10 μL ds cDNA、1 μL ddH2O、2 μL T4DNA 連接酶，16℃連接20 h。

cDNA 文庫擴(kuò)增：取連接產(chǎn)物加到大腸肝菌E.coliDH5α Electro-Cells(TaKaRa，日本)中，冰浴10 min 后轉(zhuǎn)移到電擊杯中，電轉(zhuǎn)化條件：1．8 kV，200 Ω，25 μF，電轉(zhuǎn)儀：E.colipulser(美國Bio-Rad 公司)。電擊完成后立即加入1 mL 的SOC(super optimal broth with catabolite repression)液體培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，隨后轉(zhuǎn)移到50 mL SOC 液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r.min-1條件下復(fù)蘇1 h，然后涂布于LB+Amp 抗性平板上，37℃倒置過夜培養(yǎng)后用LB 液體培養(yǎng)基收集所有菌體，將得到的菌體懸浮液于37℃、250 r.min-1震蕩培養(yǎng)3 h左 右， 用Wizard ? Plus Maxipreps DNA purification System (Promega，美國)提取質(zhì)粒完成cDNA 文庫的擴(kuò)增。

1.4 cDNA 文庫質(zhì)量和滴度檢測

ds cDNA 和pGADT7 連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2 μL 分別稀釋10 倍、100 倍后涂到LB+Amp 平板上，37℃培養(yǎng)過夜后，統(tǒng)計單克隆數(shù)計算原始文庫容量。從平板上隨機(jī)挑取32 個單克隆，以pGADT7-F/pGADT7-R 為引物(表1)，通過PCR 擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定文庫平均插入片段的大小。取1．3 中震蕩培養(yǎng)好的菌液100 μL，按10-2、10-4、10-63 個稀釋度稀釋后分別取100 μL 涂LB+Amp 平板，37℃培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計平板上克隆數(shù)計算文庫滴度(文庫滴度：克隆數(shù)目/稀釋混合物涂板體積×稀釋倍數(shù)＝CFU.mL-1)[29]。

1.5 pGBKT7-SCP7 誘餌表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank 中VdSCP7 基因序列(Gen ID：VDAG_07157)設(shè)計帶有EcoR Ⅰ酶切位點的引物SCP7-F 與SCP7-R(表1)。液氮研磨大麗輪枝菌Vd991 菌絲體，用RNA 快速提取試劑盒提取大麗輪枝菌RNA，1%的瓊脂糖電泳檢測后；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得大麗輪枝菌cDNA；純化回收大麗輪枝菌cDNA 后。以Vd991 cDNA 為模板，SCP7-F 與SCP7-R 為引物擴(kuò)增VdSCP7 基因。

用EcoR Ⅰ酶切并純化回收載體pGBKT7，然后將VdSCP7 的PCR 回收產(chǎn)物用Assembly Mix 重組到pGBKT7 載體上，重組體系：0．5 μL pGBKT7、2 μLVdSCP7、2．5 μL 2×Assembly Mix，然后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μL Trans1-T1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化步驟參考Trans1-T1 Phage Resistant 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞說明書(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，再提取大腸桿菌中pGBKT7-SCP7 質(zhì)粒，經(jīng)EcoR Ⅰ酶切并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將誘餌載體pGBKT7-SCP7 送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序驗證。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 pGBKT7-SCP7 誘餌載體自激活及毒性檢測

參照Clontech 產(chǎn)品說明書，用LiAc 法制備酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞(Clontech，美國)。將5 μL pGBKT7-SCP7 質(zhì)粒、3 μL pGADT7 質(zhì)粒、77 μL 無菌水和5 μL 熱變性的Carrier DNA 加入酵母感受態(tài)細(xì)胞中混勻，再加入PEG/LiAc(240 μL 50%的PEG、36 μL 1 mol.L-1的LiAc)混勻，30℃、200 r.min-1震蕩培養(yǎng)30 min 后，42℃熱激30 min，12 000 r.min-1離心1 min，棄上清，用100 μL 0．9%NaCl 溶液重懸菌體。取適量菌液涂到SD/-Trp/-Leu 和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu 培養(yǎng)基(TaKaRa，日本)上，30℃培養(yǎng)3 d，觀察結(jié)果，分析誘餌載體自激活活性。

將含pGBKT7-SCP7 和pGBKT7 空載體的酵母菌AH109，分別接種于SD/-Trp/Kan 的液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r.min-1培養(yǎng)24 h，用722N 型分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)檢測菌液OD600，鑒定誘餌蛋白對細(xì)胞的毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花總RNA 提取及ds cDNA 的合成

提取被大麗輪枝菌侵染的棉花根系RNA，經(jīng)測定RNA OD260/OD280為1．91，電泳檢測，28S 和18S rRNA條帶清晰，無拖尾，亮度比接近2 ∶1，說明總RNA 完整性較好，未發(fā)生降解(圖1-A)。mRNA 純化后呈彌散狀分布，質(zhì)量較高(圖1-B)。合成的ds cDNA 于0．2～4．5 kb 之間呈彌散狀，說明不同大小和豐度的mRNA 均有效反轉(zhuǎn)錄(圖1-C)。ds cDNA 經(jīng)酶切純化去除小片段后，電泳檢測條帶仍呈彌散狀，片段大小分布在0．5～3．0 kb 之間，純化產(chǎn)物質(zhì)量較高，可用于構(gòu)建cDNA 文庫(圖1-D)。

2.2 文庫質(zhì)量和滴度檢測

將純化后的ds cDNA 連接到pGADT7 載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，涂布到平板上測定原始文庫庫容量大于2．0×106CFU。從平板上隨機(jī)挑取32 個克隆，進(jìn)行菌液PCR 檢測，部分電泳圖片如圖2 所示，插入的cDNA 片段大小不一，文庫多樣性良好，插入片段平均長度大于1 kb，32 個克隆僅有2 個未檢測到插入片段，重組率約94%。上述結(jié)果說明文庫質(zhì)量較高，可用于后續(xù)篩庫試驗。

取擴(kuò)增后的文庫菌懸液100 μL，按10-2、10-4、10-6稀釋后分別取100 μL 涂LB+Amp 平板，37℃培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計平板上克隆數(shù)計算文庫滴度，最后得到擴(kuò)增后的質(zhì)粒文庫滴度約2．0×109CFU.mL-1，滿足試驗要求所需的滴度。

2.3 誘餌載體(pGBKT7- SCP7)的構(gòu)建

將測序結(jié)果正確的VdSCP7 重組至pGBKT7 載體上，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB+Kan 培養(yǎng)基上。挑取單克隆，搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，EcoR Ⅰ酶切pGBKT7-SCP7 重組質(zhì)粒并電泳檢測，切下的目的片段(即圖3 中右圖下方片段)與VdSCP7基因片段(651 bp)大小一致(圖3)，且與生工生物工程(上海)股份有限公司測序結(jié)果比對正確，說明誘餌載體pGBKT7-SCP7 構(gòu)建成功。

圖1 cDNA 文庫的構(gòu)建Fig.1 Construction of cDNA library

圖2 PCR 檢測cDNA 文庫的插入片段Fig.2 PCR identification of inserts in the cDNA library

圖3 誘餌載體(pGBKT7-SCP7)的構(gòu)建Fig.3 Construction of bait vector pGBKT7-SCP7

2.4 誘餌載體pGBKT7-SCP7 自激活及毒性鑒定

含有pGBKT7-SCP7 和pGADT7 空載體的轉(zhuǎn)化菌在SD/-Trp/-Leu 中正常生長(圖4-A)，在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu 中無生長(圖4-B)，說明誘餌載體pGBKT7-SCP7 無自激活活性。含pGBKT7-SCP7 和pGBKT7 空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌分別在SD/-Trp/Kan 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，測定菌液OD600均大于0．8，說明誘餌載體pGBKT7-SCP7 對酵母細(xì)胞無毒性，可用于酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行下一步篩庫試驗。

圖4 pGBKT7-SCP7 的自激活驗證Fig.4 Auto-activation identification of pGBKT7-SCP7

3 討論

構(gòu)建cDNA 文庫是發(fā)掘新基因、研究基因功能的重要技術(shù)手段。已有研究構(gòu)建了纖維發(fā)育、花發(fā)育、鹽旱脅迫等相關(guān)的棉花cDNA 文庫，并挖掘到許多與棉花生長發(fā)育和抗逆相關(guān)的關(guān)鍵基因[30]。Zhang 等[31]以海島棉Pima90-53 為材料構(gòu)建了cDNA 文庫，得到了46 192 條高質(zhì)量表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)，獲得了23 126 個unigenes，并發(fā)現(xiàn)了1 條新的和植物抗性相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。馬建輝等[32]構(gòu)建了海島棉cDNA 文庫并篩選到了一系列在棉花花藥發(fā)育中起重要作用的基因。Zhang 等[33]利用cDNA文庫鑒定出了一些信號分子、轉(zhuǎn)錄因子等可能在棉花鹽脅迫應(yīng)答中起重要作用。張映霞等[34]和Zhang等[35]以黃萎病菌誘導(dǎo)處理后的陸地棉為材料構(gòu)建cDNA 文庫，得到了一些和抗病相關(guān)的基因。但這些棉花cDNA 文庫都不能直接用于酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)一步對篩到的關(guān)鍵基因進(jìn)行分子機(jī)制的解析。通過構(gòu)建棉花酵母雙雜交cDNA 文庫，篩選棉花中與黃萎病菌互作的蛋白，解析其互作的分子機(jī)理，對提高棉花抗病性至關(guān)重要。

酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)之間相互作用的高通量技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用，且效率高，篩選量大[36]，而高質(zhì)量的cDNA 文庫是運用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)。本研究以大麗輪枝菌侵染后的棉花根系為材料，誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá)，從而保證構(gòu)建的文庫基因信息更全面。RNA 質(zhì)量是構(gòu)建高質(zhì)量cDNA 文庫的前提，本試驗中提取的28S 和18S rRNA 條帶清晰，RNA 完整性較好，未發(fā)生降解，mRNA 也都被高效的反轉(zhuǎn)錄了。為提高文庫質(zhì)量，獲得的雙鏈cDNA 進(jìn)行過柱純化去除短片段，電泳檢測條帶基本均在0．5 kb以上，說明短片段已去除。通常以重組序列完整性和文庫代表性來評價cDNA 文庫質(zhì)量[37]，一般的cDNA文庫庫容須達(dá)到1×106CFU，文庫滴度須達(dá)到1×108CFU.mL-1[29]。本研究構(gòu)建的cDNA 文庫庫容大于2×106CFU，文庫滴度大于2×109CFU.mL-1，重組率達(dá)到了94%，PCR 鑒定文庫插入片段大小不一，多樣性良好，但有個別文庫克隆片段偏小，所能提供的基因信息少，可能需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因cDNA?？傮w來說，本試驗中文庫構(gòu)建較成功，為后續(xù)篩選病原菌中和棉花互作蛋白奠定了基礎(chǔ)。

黃萎病菌基因組編碼700 多種假定調(diào)節(jié)宿主免疫的分泌蛋白[38]。VdSCP7 是一種新鑒定的大麗輪枝菌分泌蛋白，它定位于植物細(xì)胞核，且VdSCP7 誘導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)依賴于其在植物的核定位[39]。植物在真菌侵染過程中可以識別VdSCP7 并激活ETI 反應(yīng)，增強(qiáng)抗病性，但目前尚不清楚這一過程的分子機(jī)制[27]。關(guān)于大麗輪枝菌一些效應(yīng)因子如大麗輪枝菌蛋白激發(fā)子(PevD1) 的研究已多見報道[40-42]，但棉花中與VdSCP7 互作蛋白的研究尚鮮見報道，篩選棉花中與VdSCP7 互作的蛋白，將有助于闡明這一作用機(jī)制。本研究構(gòu)建了無自激活活性及毒性的誘餌載體pGBKT7-SCP7 可直接用于下一步酵母雙雜交cDNA文庫的篩選。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了高質(zhì)量的棉花酵母雙雜交cDNA 文庫和無自激活活性及毒性的誘餌載體pGBKT7-SCP7，為進(jìn)一步研究VdSCP7 作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。利用本研究構(gòu)建的棉花cDNA 文庫和酵母雙雜交技術(shù)，可以大規(guī)模、快速篩選棉花抗病相關(guān)基因，為棉花和黃萎病菌互作機(jī)制的研究提供資源。