盧陽 陳萍 林素仙 姜建昌 王勝男 張智勇 楊美綠

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的免疫性疾病。機(jī)體免疫系統(tǒng)改變，特別是細(xì)胞免疫異常，在RA發(fā)生過程中所起的關(guān)鍵性作用越來越受到重視[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的比例明顯下降，且存在以分泌IL-17為特征的CD4+T細(xì)胞（Th17）細(xì)胞增殖，這種Th17/Treg失衡是導(dǎo)致RA炎癥和損傷的重要因素[3-4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，生長停滯特異性蛋白 6（growth arrest-specific 6，Gas6）能促進(jìn)Treg功能活化（呈濃度依賴性），增強(qiáng)Treg對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制能力[5-6]。此外，缺失Gas6的小鼠Th17細(xì)胞顯著增殖，呈現(xiàn)出Th17/Treg失衡的現(xiàn)象，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7]。鑒于Treg在RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵作用，筆者推測(cè)Gas6能夠調(diào)控RA小鼠Th17/Treg平衡，從而減輕炎癥和關(guān)節(jié)損傷，為此，筆者通過建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠模型，探討 Gas6對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡和炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雄性SPF級(jí)DBA/1J小鼠24只（8周齡，體重22～25 g）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。弗氏完全佐劑（F5881）和弗氏不完全佐劑（F5506）購自美國Sigma公司，牛Ⅱ型膠原蛋白購自美國Chondrex公司（20022）。重組小鼠Gas6購自美國R & D公司（CF 8310-GS-050）。IL-10 ELISA試劑盒購自上海欽誠生物科技公司（QC-IL10-Mu），IL-17 ELISA試劑盒購自聯(lián)邁生物公（LM-IL-17-Mu）。FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4抗體（553046）、PE標(biāo)記大鼠抗小鼠叉頭蛋白翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 P3（Forkhead/winged helix transcription factor p3，F(xiàn)oxp3）抗體（560414）和PE標(biāo)記大鼠抗小鼠IL-17A抗體均購自美國BD公司（561020）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及CIA小鼠模型制備 將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即對(duì)照組、CIA組、CIA+生理鹽水組和CIA+Gas6組，每組6只。參考文獻(xiàn)[8]建立動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)遵循國際通行的動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則。第1天后3組小鼠在尾根部皮下注射0.1 ml由弗氏完全佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積（各0.05 ml）混合乳劑，第21天再次注射0.1 ml弗氏不完全佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積（各0.05 ml）混合乳劑，構(gòu)建CIA模型。對(duì)照組以0.9%氯化鈉注射液替代牛Ⅱ型膠原蛋白。CIA+Gas6組小鼠在第2次注射后立即腹腔注射30 μg/ml的Gas6 0.1 ml，以后每3天1次，共3次，總劑量為9 μg。CIA+生理鹽水組小鼠在第2次注射后，立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml，以后每3天1次，共3次。

1.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分 第1次注射后42 d，對(duì)小鼠四肢進(jìn)行AI評(píng)分，共分為5級(jí)。0分：正常，關(guān)節(jié)無紅腫；1分：足趾關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分；足趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下足爪紅腫；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪均有紅腫且伴有功能障礙。每只小鼠AI評(píng)分為四肢關(guān)節(jié)評(píng)分之和，總分最高為16分。

1.4 IL-10和IL-17水平檢測(cè) 第1次注射后42 d，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2 ml麻醉后打開腹腔，采集下腔靜脈血1.0 ml，EDTA抗凝，2500 r/min，離心15min（4℃），取上清液，采用ELSIA試劑盒檢測(cè)IL-17和IL-10水平。

1.5 Treg和Th17細(xì)胞檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。下腔靜脈取血完畢后處死小鼠，留取脾臟，置于40 μm孔徑濾網(wǎng)上研磨成勻漿，用PBS重懸細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×107個(gè)/ml。等分細(xì)胞懸液，每管 50 μl，再加 50 μl流式染色緩沖液。加入抗CD4-FITC，4℃避光孵育1 h，PBS洗2次后，分別染色I(xiàn)L-17A和Foxp3，以檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞比例。Th17細(xì)胞檢測(cè)：每個(gè)樣本加入2 ml流式染色緩沖液，400 g/min離心5 min，棄上清液，每管加入流式染色緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，并加入1 μg/ml的IL-17A抗體，室溫避光孵育1 h。Treg細(xì)胞檢測(cè)：以1 ml Foxp3 Fix/permeabilization工作液重懸細(xì)胞，輕柔震蕩，4℃避光孵育1 h后，每管加2 ml通透緩沖液，300 g/min室溫離心 5 min，棄上清液。加100 μl通透緩沖液重懸細(xì)胞后，加入抗Foxp3抗體，4℃避光孵育1 h。上機(jī)檢測(cè)前，每個(gè)樣品加2 ml流式染色緩沖液，400 g/min離心5 min，棄上清液。上述過程重復(fù)2次，每管加入流式染色緩沖液1 ml上機(jī)。

1.6 踝關(guān)節(jié)病理檢查 處死小鼠后，于雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)處截?cái)?，去外皮和肌肉?0%中性甲醛固定48 h，采用硝酸脫鈣2 h，二甲苯浸潤后，石蠟包埋，制成切片，常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠AI評(píng)分的比較 CIA小鼠顯示出明顯的關(guān)節(jié)腫脹，Gas6干預(yù)后，小鼠的關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，見圖1。在造模后第42天，CIA+生理鹽水組與CIA組相比AI評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CIA+Gas6組與CIA+生理鹽水組相比AI評(píng)分明顯下降（P＜0.01），見表1。

2.2 4組小鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的比較 病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，未見顯著的炎癥細(xì)胞浸潤和軟骨破壞現(xiàn)象。CIA組小鼠踝關(guān)節(jié)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤和嚴(yán)重的關(guān)節(jié)軟骨破壞。與CIA組小鼠相比，CIA+Gas6組小鼠踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞減少，關(guān)節(jié)軟骨破壞減輕，見圖 2（插頁）。

圖2 4組小鼠踝關(guān)節(jié)病理損傷的比較（a：對(duì)照組；b：CIA 組；c：CIA+ 生理鹽水組；d：CIA+Gas6組；HE 染色，×100）

2.3 4組小鼠IL-10、IL-17水平的比較 與對(duì)照組相比，CIA小鼠IL-10水平升高（P＜0.05）。與CIA組比較，CIA+Gas6組IL-10水平較高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，CIA組小鼠IL-17水平明顯升高（P＜0.01）。與CIA組相比，CIA+Gas6組 IL-17水平明顯下降（P＜0.01），見表2。

2.4 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細(xì)胞比例的比較 與對(duì)照組相比，CIA小鼠脾臟CD4+IL-17+細(xì)胞比例明顯升高，而CD4+Foxp3+細(xì)胞比例顯著下降（P＜0.01）。與CIA組小鼠相比，CIA+Gas6組小鼠脾臟CD4+IL-17+細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05），CD4+Foxp3+細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01），見圖3和表3。

圖1 4組小鼠關(guān)節(jié)圖（a：對(duì)照組；b：CIA 組；c：CIA+生理鹽水組；d：CIA+Gas6組）

表1 4組小鼠AI評(píng)分的比較（分）

表2 4組小鼠IL-10、IL-17水平的比較（pg/ml）

3 討論

RA總體發(fā)病率約為0.3%～1.5%，且晚期致殘率極高，嚴(yán)重威脅患者的身心健康[9]。已經(jīng)證實(shí)，RA關(guān)節(jié)腔和滑膜有包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞浸潤，釋放IL、TNF和IFN等炎癥因子；此外，炎癥因子的釋放可進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫細(xì)胞聚集，形成惡性循環(huán)，最終引起滑膜和關(guān)節(jié)損害[1-2]。鑒于此，靶向炎癥和免疫活化一直是RA治療學(xué)研究的重點(diǎn)，但迄今為止臨床上仍缺乏有效的干預(yù)策略和藥物。

TAM受體是機(jī)體重要的“炎癥開關(guān)”[5]。有研究證實(shí)，TAM受體家族缺失的小鼠，脾臟淋巴細(xì)胞大量擴(kuò)增和活化，可引起機(jī)體炎癥性損傷[10]。在肥胖相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn)，阻斷TAM受體家族Axl后，關(guān)節(jié)損傷明顯加重[11]。另據(jù)報(bào)道，Axl基因缺陷的關(guān)節(jié)炎小鼠，其滑膜炎癥、骨和軟骨的破壞明顯增加[12]。Gas6是TAM家族的天然配體[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，Gas6干預(yù)后，CIA小鼠AI評(píng)分明顯下降，踝關(guān)節(jié)的病理損害也顯著減輕。上述結(jié)果提示，激活Gas6-TAM通路對(duì)于減輕RA有著重要的保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不清楚。

CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞。在機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的影響下，CD4+T淋巴細(xì)胞可分化為包括Treg和Th17等多種細(xì)胞亞群[3-4]。Th17細(xì)胞通過分泌IL-17，激活細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等炎癥信號(hào)通路，介導(dǎo)促炎因子的分泌及基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，參與組織炎癥和組織損傷過程[8]。Treg根據(jù)其來源不同可以分為天然型和誘導(dǎo)型兩類，F(xiàn)oxp3是其共同的特征和標(biāo)志分子。Treg是機(jī)體免疫耐受得以維持的核心細(xì)胞，其可以通過多重機(jī)制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，包括表面抑制分子和分泌免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10等[6]。Th17/Treg失衡已經(jīng)被證實(shí)是RA 發(fā)生和發(fā)展的重要因素[3，8]。

圖3 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細(xì)胞流式圖（A：CD4+IL-17+細(xì)胞；B:CD4+Foxp3+細(xì)胞；a：對(duì)照組；b：CIA 組；c：CIA+生理鹽水組；d：CIA+Gas6組）

表3 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細(xì)胞比例的比較（%）

與既往研究類似[3，8]，本研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠脾臟Treg比例明顯降低，而CD4+IL-17+的比例明顯升高，且外周血IL-17水平也顯著升高。Gas6干預(yù)能夠調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，促進(jìn)Treg擴(kuò)增，抑制Th17的產(chǎn)生，提示Gas6對(duì)RA的治療作用可能與其對(duì)Treg/Th17平衡調(diào)控有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)RA小鼠的外周血IL-10水平也明顯增加，Gas6干預(yù)后IL-10水平進(jìn)一步增加。在炎癥狀態(tài)下，包括Treg、Th2細(xì)胞以及單核細(xì)胞等均可代償性分泌IL-10。IL-10一方面可抑制炎癥反應(yīng)，另一方面能通過刺激B細(xì)胞成熟，阻斷其凋亡而發(fā)揮潛在的致炎作用。鑒于IL-10已被證實(shí)能夠改善RA小鼠的關(guān)節(jié)損傷[13]，IL-10可能是介導(dǎo)Gas6抗炎作用的另一重要機(jī)制。

綜上所述，Th17/Treg失衡參與了RA的致病過程。Gas6能夠促進(jìn)Treg擴(kuò)增，抑制Th17細(xì)胞分化，起到減輕RA關(guān)節(jié)損害的作用。然而，Gas6調(diào)控Th17/Treg平衡的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。