董 瑩，李麗寧△，郭華燕，張艷敏，張 琴，雷 鑫，閆 芳，徐 莉，舒汨汨

1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院血液病與腫瘤中心，陜西西安 710018；2.西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院輸血科，陜西西安 710018；3.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西西安 710032

急性髓系白血病(AML)是一種造血干細(xì)胞惡性增殖克隆性疾病，目前發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與染色體易位形成新的融合基因有關(guān)，其中6號(hào)染色體6p23的DEK基因與9號(hào)染色體9q34的NUP214基因重排，形成DEK-NUP214融合基因，產(chǎn)生DEK-NUP214融合蛋白，又名DEK-CAN蛋白。t(6;9)(p23;q34)是一種造血系統(tǒng)罕見的染色體異常，該染色體易位發(fā)生率很低，在成人AML中的發(fā)病率為0.7%～1.8%[1-3]。2008年WHO已將伴有t(6;9)(p23;q34)的AML添加到造血與淋巴組織腫瘤分類系統(tǒng)中，作為一種獨(dú)立的AML臨床亞型[4]，此類疾病預(yù)后極差，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，應(yīng)該在早期緩解后盡快行骨髓移植。由于這種染色體易位極為罕見，目前對(duì)它的認(rèn)識(shí)僅僅來(lái)源于一小部分患者，對(duì)它的認(rèn)知仍十分有限，其致病機(jī)制也不清楚，還有待進(jìn)一步研究。本研究對(duì)2013年1月至2018年12月在中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院血液內(nèi)科確診的8例伴有t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214融合基因陽(yáng)性的AML患者進(jìn)行回顧性分析，旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)此類疾病的臨床特征，探討其治療策略，加強(qiáng)對(duì)此類疾病的規(guī)范化管理。

1 資料與方法

1.1一般資料 8例AML患者均為2013年1月至2018年12月在中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院血液內(nèi)科收治的初發(fā)病例，其中男6例，女2例；年齡15～66歲，中位年齡48歲。所有病例均按照法、美、英協(xié)作組(FAB)標(biāo)準(zhǔn)和WHO血液系統(tǒng)腫瘤標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、白血病免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)確診。

1.2方法

1.2.1免疫分型分析 取肝素抗凝骨髓4 mL，采用常規(guī)四色免疫熒光法對(duì)8例患者進(jìn)行免疫表型分析。所用單克隆抗體包括CD2、CD7、CD20、CD10、CD34、HLA-DR、CD117、CD11b、CD14、CD13、CD19、CD33、CD56、CD64、CD61、CD41、cCD79、cMPO、cCD3、CD235a、CD71、CD138、CD15，用流式細(xì)胞儀(COULTER EPICS XL，美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司)和CXP2.0軟件獲取并分析10 000個(gè)細(xì)胞，通過(guò)CD45/側(cè)向角散射(SSC)設(shè)門法識(shí)別白血病細(xì)胞群，再分析計(jì)算該細(xì)胞群各相關(guān)抗原的表達(dá)，分析時(shí)以原始幼稚細(xì)胞群中抗原表達(dá)>20%作為陽(yáng)性。

1.2.2染色體制備和核型分析 抽取患者初次就診時(shí)的骨髓細(xì)胞，24 h短期培養(yǎng)后收獲細(xì)胞，并加入秋水仙酰胺使分裂的細(xì)胞停止在分裂中期，按要求制備染色體標(biāo)本，應(yīng)用G顯帶技術(shù)進(jìn)行染色體核型分析。核型異常命名根據(jù)《國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名法(ISCN)2005》進(jìn)行。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝的患者骨髓標(biāo)本2 mL，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，離心得到白細(xì)胞沉淀，Trizol經(jīng)典法提取骨髓細(xì)胞總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，用急性白血病43種融合基因檢測(cè)試劑盒(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)檢測(cè)患者是否含有特異性融合基因，檢測(cè)的基因包括BCR-ABL1、RUNX1-RUNX1T1、CBF-MYH1、PML-RARa、DEK/NUP214、SIL/TAL1、E2A/HLF、TEL/AML1、E2A/PBX1、NMP/MLF1、TEL/PDGFRB、TLS-ERG、SET/CAN、ETV6/PDGFRA、FIP1L1/PDGFRA、NPM/ALK、RARa相關(guān)基因、TEL相關(guān)基因、MLL相關(guān)基因、NUP98相關(guān)基因、AML1相關(guān)基因等。

1.2.4骨髓細(xì)胞DNA提取及AML相關(guān)基因突變檢測(cè) 取EDTA-Na2抗凝的患者骨髓標(biāo)本2 mL，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)提取總DNA。用一代測(cè)序儀(3500Dx，ABI公司)檢測(cè)FLT3-TKD、FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、C-Kit 8、C-Kit 17基因突變。

2 結(jié) 果

2.1血常規(guī)和骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 8例患者均伴有外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，白細(xì)胞計(jì)數(shù)為(12.35～114.61)×109/L，血紅蛋白為46～99 g/L，血小板計(jì)數(shù)為(18～160)×1012/L。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、骨髓形態(tài)學(xué)、骨髓病理學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，并參照免疫分型結(jié)果，按照FAB標(biāo)準(zhǔn)分型，臨床診斷如下：AML未分化型M1 1例，AML部分分化型M2 5例，急性粒-單核細(xì)胞白血病M4 2例。

2.2免疫分型結(jié)果 根據(jù)CD45熒光強(qiáng)度與SSC把病例中的骨髓有核細(xì)胞區(qū)分成3群細(xì)胞，包括異常細(xì)胞群、正常粒細(xì)胞群、正常淋巴細(xì)胞群。8例患者中，主要表達(dá)HLA-DR(7/8)、cMPO(7/8)、CD33(8/8)、CD13(8/8)、CD34(6/8)、CD11b(4/8)、CD117(7/8)，未發(fā)現(xiàn)染色體核型，基因與免疫表型之間有明顯關(guān)聯(lián)。

2.3染色體核型檢測(cè)結(jié)果 對(duì)8例AML患者進(jìn)行染色體核型分析，觀察分析250個(gè)分裂中期細(xì)胞，其中2例沒有分裂相，剩余6例中20個(gè)中期分裂相的所有細(xì)胞均顯示t(6;9)(p23;q34)染色體。

2.4基因檢測(cè)結(jié)果 8例AML患者進(jìn)行43種急性白血病融合基因檢測(cè)，結(jié)果均檢出DEK-NUP214融合基因陽(yáng)性(附其中1例結(jié)果見圖1)。其中4例進(jìn)行基因突變(FLT3-TKD、FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、C-Kit 8、C-Kit 17)檢測(cè)，2例檢出FLT3-ITD突變陽(yáng)性。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AML患者DEK-NUP214融合基因陽(yáng)性的擴(kuò)增曲線

2.5臨床治療及預(yù)后 對(duì)8例AML患者治療情況進(jìn)行分析，其中3例未在中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院治療；1例入院后未行化療即死亡；剩余4例患者，2例先用小劑量EA預(yù)處理，再行標(biāo)準(zhǔn)劑量IDA方案化療，1例患者化療2個(gè)療程未緩解死亡，1例患者化療3個(gè)療程后死于感染，剩余2例行地西他濱聯(lián)合CAG方案化療，鞏固4個(gè)療程后，1例緩解后轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院行異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)，術(shù)后1.5年因肺部感染死亡，1例接近緩解(原始粒細(xì)胞接近5%)，但是很快復(fù)發(fā)，再更換化療方案治療，治療無(wú)效死亡。

3 討 論

血液系統(tǒng)疾病在病程發(fā)生過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)某些非隨機(jī)性染色體異常，這些染色體的相互易位形成特定的融合基因，最終表達(dá)生物學(xué)特性異常的融合蛋白，這些蛋白與血液病的發(fā)生關(guān)系密切[2,5-6]。伴t(6;9)(p23;q34)的AML是一類性質(zhì)獨(dú)特、預(yù)后極差的疾病，此類疾病以年輕患者居多，發(fā)病率低，化療效果差，緩解率低，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，生存期短[2]。本研究報(bào)道的8例患者中免疫分型都表達(dá)CD13、CD33，與文獻(xiàn)報(bào)道類似[2,7-8]。盡管有報(bào)道稱，伴t(6;9)異常的AML患者骨髓形態(tài)學(xué)檢查易出現(xiàn)骨髓病態(tài)造血或者嗜堿性粒細(xì)胞增多[3,9]，但是中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西京醫(yī)院確診的8例患者，其中2例患者出現(xiàn)病態(tài)造血，8例患者骨髓形態(tài)學(xué)檢查均未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞增多，分析可能與收集的病例數(shù)量有限，或者疾病的異質(zhì)性有關(guān)。YOSHIMOTO等[10]發(fā)現(xiàn)，在青年AML患者中，F(xiàn)LT3-ITD基因的突變率為20%～30%，F(xiàn)LT3-TKD基因的突變率為7%，STONE等[11]、ALSABEH等[8]和OYARZO等[7]總結(jié)出這些基因在AML伴t(6;9)患者中的突變率為71%～88%，且基因突變與患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究中有4例患者進(jìn)行預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)，F(xiàn)LT3-ITD的檢出率為50%(1例為未化療即死亡，1例為化療2個(gè)療程未緩解死亡)，因?yàn)槭占降牟±邢?，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于伴有t(6;9)(p23;q34)的AML患者預(yù)后差，且患者緩解期短暫，因此，獲得完全緩解后的患者宜盡早進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植，以期獲得長(zhǎng)期生存的機(jī)會(huì)。

伴t(6;9)(p23;q34)的AML代表一類獨(dú)特的AML亞型，盡管其分子生物學(xué)研究取得了一些進(jìn)展，但目前，對(duì)DEK-NUP214融合基因和其產(chǎn)生的蛋白在腫瘤發(fā)生中的作用及臨床意義了解得很少，針對(duì)此類患者的治療方案仍處于研究階段，有研究指出尋找到針對(duì)DEK-NUP214融合基因的靶向治療藥物可能是此類疾病治療的突破口和轉(zhuǎn)折點(diǎn)[12-13]。