吳晶金，李玲玉，栗榮，殷世云

云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南昆明650021

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病。我國大陸地區(qū)的RA患病率約為0.2%～0.4%。其主要結(jié)局是殘疾，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自然病程中，5～10年的致殘率為60%，病程30年的致殘率為90%，壽命縮短10～15年，而伴關(guān)節(jié)外表現(xiàn)者的5年生存率僅為50%［1］，極大影響了患病人群的生活質(zhì)量。開展干預(yù)RA研究對于人類健康具有重要意義。成纖維樣滑膜細胞類似腫瘤樣生長被認為是RA發(fā)生發(fā)展的重要機制，臨床抗腫瘤藥物如甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等亦可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。因此，從腫瘤發(fā)病學(xué)角度研究RA，有望發(fā)現(xiàn)全新的治療靶標(biāo)?；谑壬窠?jīng)侵襲（perineural invasion，PNI）在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，PNI相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在RA滑膜組織中亦有表達，該研究已為少數(shù)國外學(xué)者所重視，由此推測NI可能參與了RA的病理過程。本研究擬從Sema3A／NRP-1／PlexinA體系探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物SPF級DBA／1雄性小鼠90只，8周齡，體質(zhì)量（21±5）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（京）：2016-0011，飼養(yǎng)于云南省中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室SPF級動物房，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝水?dāng)z食。動物房溫度維持在22～24℃，濕度維持在65%～70%。

1.2 藥品與試劑溫陽通絡(luò)方（主要由附片、桂枝、麻黃、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中藥組成），由本院藥學(xué)部提供；甲氨蝶呤片，通化茂祥制藥有限公司生產(chǎn)（批號：H22022674）。牛Ⅱ型膠原（CⅡ），sigma公司；完全弗氏佐劑（CFA），美國BD公司；信號素（Sema3A）抗體（abcam，貨號：ab23393）；神經(jīng)纖毛蛋白-1（NRP-1）抗體（abcam，貨號：ab81321）；神經(jīng)叢素（PlexinA）抗體（abcam，貨號：ab23391）；β-actin抗體（abmart，貨號：T40104）；HRP標(biāo)記通用型二抗（Goat來源，CST，貨號：7074S）；蛋白酶抑制劑（Roche，貨號：11206893001）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas K1622）；SYBR Green master mix（KAPA KK4601）；DMEM（H）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco，貨號：12800-017）；胎牛血清（Gibco，貨號：10099-141）；0.25%胰酶（Gibco，貨號：1894145）；凋亡檢測試劑盒（東仁化學(xué)，貨號：AD10）。

1.3 儀器掌上離心機（其林貝爾）；HITACH低溫離心機（CF-16RX）；全波長分光光度計（上海UNICO）；酶標(biāo)儀（Thermo）；凝膠成像儀（BIO-RAD）；垂直電泳槽（BIO -RAD）；濕式轉(zhuǎn)膜槽（BIO-RAD）；定量PCR儀（ABI StepOne）；紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）；超聲破碎儀（美國Sonnic VCX310）；流式細胞分選儀（Partec GmbH CyFlow Space）。

2 方法

2.1 造模及給藥按隨機數(shù)字表法將DBA／1小鼠隨機分為空白組，模型組，甲氨蝶呤組（10 mg·kg-1），溫陽通絡(luò)方低、中、高劑量（2.0 g·kg-1、4.0 g·kg-1、8.0 g·kg-1）組，每組5只。除空白組外，其余小鼠均造模。配制濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原溶液，置于4℃冰箱過夜。冰浴下與CFA按1∶1比例充分混勻，制成乳劑。固定小鼠后于距鼠尾根部1 cm處注射，每只100μL。致炎第21天起每日給予相應(yīng)的藥物干預(yù)，模型組與空白組均給予生理鹽水灌胃10 mL·kg-1。第48天末次灌胃后禁食水，第49天脫臼處死。滑膜組織備測。

2.2 滑膜組織的收集小鼠處死后，置于冰上操作，仰位固定，迅速離斷四肢，用冷生理鹽水沖洗干凈后沿踝關(guān)節(jié)上方剪下整個關(guān)節(jié)囊，一部分常規(guī)脫鈣包埋，切片備用，一部分新鮮凍存于超低溫冰箱。

2.3 滑膜細胞（FLS）體外培養(yǎng)實驗取7周齡雄性DBA／1小鼠10只，完全去除皮膚和其他軟組織，無菌分離各組實驗動物踝關(guān)節(jié)，操作中始終避免破損導(dǎo)致骨髓細胞釋放，以漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）沖洗，70%乙醇清洗后將其放入盛有HBSS的100 mm組織培養(yǎng)板中，剪開關(guān)節(jié)間隙。加入含膠原酶IV（終濃度為1 mg·mL-1）的DMEM全培基，搖床中37℃恒溫震蕩消化1 h，渦旋釋放滑膜細胞后將上清移入新的離心管，加入DMEM 全培基后1 100 r·min-1室溫離心10 min，將沉淀重懸于全培基中，接種培養(yǎng)于37℃，5%CO2孵育箱。傳代培養(yǎng)至第3代，骨髓衍生系完全去除后，第4至8代細胞可用于后續(xù)實驗。將細胞分為空白組、脂多糖（lipoposaccharide，LPS）組、溫陽通絡(luò)方組、溫陽通絡(luò)方加LPS組，用流式細胞術(shù)檢測滑各組膜細胞凋亡情況。

2.4 指標(biāo)的檢測

2.4.1 W estern Blot法檢測滑膜組織每組隨機選擇3只小鼠的滑膜組織迅速稱重，每100 mg樣本加入8倍體積預(yù)冷的蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制劑，0.4 mM PMSF，1 mM Iodo，1μM Pepstatin A）勻漿30 min。提取液4℃下，離心半徑8 cm，12 000 r·min-1離心30 min后取上清，BCA法蛋白定量；用PBS調(diào)至等體積，加5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min；SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣20μg。配制 5% 積層膠、10% 分離膠，膠厚0.75 mm，膜于轉(zhuǎn)移液（含甲醇15%）中平衡10 min，80 V轉(zhuǎn)膜120 min后將膜取出，放入含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h。取出膜，對應(yīng)一抗1∶1 000稀釋，4℃過夜；TBST洗3次，每次5 min；熒光二抗1∶10 000稀釋，室溫結(jié)合1 h；分別用TBST和PBS各洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY 紅外雙色激光成像系統(tǒng)對Sema3A、NRP-1、PlexinA的蛋白相對表達量進行分析。

2.4.2 RT-PCR法檢測滑膜組織每組隨機選擇3只小鼠的滑膜組織于玻璃勻漿器中，滑膜細胞則直接加入Trizol，以離心柱法提取總RNA，進行實時定量RT-PCR實驗，檢測Sema3A、NRP-1、PlexinA基因表達水平。（在pubmed上查詢對應(yīng)物種的目的基因mRNA序列，以CDS序列設(shè)計引物。應(yīng)用beacon designer 7.90設(shè)計Q-PCR引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4.3 流式法檢測滑膜細胞凋亡將滑膜細胞隨機分為空白組、LPS組、溫陽通絡(luò)方組、溫陽通絡(luò)方加LPS組。每組設(shè)3個復(fù)孔，移除細胞培養(yǎng)基，PBS清洗細胞3次，0.25%胰酶消化收集細胞。PBS清洗收集好的細胞3次，離心半徑8 cm，1 000 rmp·min-1離心3 min，收集細胞，用400μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，每組每個復(fù)孔均勻分成4管。第1管為空白組（不加任何試劑）、第2管為FITC對照組（加入5μL的Annexin V-FITC）、第3管為PI對照組（加入5 μL的PI）、第4管雙染組（加入5μL Annexin VFITC和5μL PI），室溫避光孵育15 min。用PBS將每管液體量補至1 mL后，在流式細胞儀下檢測細胞凋亡，以1～3管為組合對照，以雙染組分析滑膜細胞凋亡情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 溫陽通絡(luò)方對小鼠滑膜組織PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表達的影響與空白組相比，模型組小鼠滑膜組織中PlexinA、Sema3A、NRP-1的表達量明顯升高（P＜0.05），與相關(guān)文章中趨勢一致；與模型組相比，溫陽通絡(luò)方各劑量和甲氨蝶呤組可明顯升高PlexinA的表達量（P＜0.05）；溫陽通絡(luò)方高劑量組和甲氨蝶呤組可明顯升高Sema3A的表達量（P＜0.05）；溫陽通絡(luò)方高、中劑量組和甲氨蝶呤組可明顯升高NRP-1的表達量（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 溫陽通絡(luò)方對小鼠滑膜PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表達水平的影響

表2 溫陽通絡(luò)方各組p lexinA、Sema3A、NRP-1的表達（±s）

表2 溫陽通絡(luò)方各組p lexinA、Sema3A、NRP-1的表達（±s）

注：與模型組相比，△P＜0.05

組別n plexinA Sema3A NRP-1空白組3 0.85±0.06△1.07±0.16△0.94±0.14△模型組3 0.41±0.15 0.64±0.09 0.65±0.05甲氨蝶呤組3 0.77±0.07△1.03±0.17△0.90±0.20△溫陽通絡(luò)方高劑量組3 0.81±0.19△1.02±0.18△0.94±0.08△溫陽通絡(luò)方中劑量組3 0.68±0.04△0.87±0.06 0.92±0.14△溫陽通絡(luò)方低劑量組3 0.61±0.06△0.70±0.04 0.76±0.10

3.2 溫陽通絡(luò)方對各組PlexinA m RNA、Sema3A m RNA、NRP-1 m RNA表達水平的影響與空白組相比，模型組可明顯降低PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表達量（P＜0.05）。與模型組相比，溫陽通絡(luò)方各劑量組和甲氨蝶呤組可升高PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表達量（P＜0.05）。見表3。

表3 溫陽通絡(luò)方對各組PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表達水平的影響（±s）

表3 溫陽通絡(luò)方對各組PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表達水平的影響（±s）

注：與模型組相比，△P＜0.05

mRNA空白組3 1.00±0.00△1.00±0.00△1.00±0.00組別n PlexinA mRNA Sema3A mRNA NRP-1△模型組3 0.24±0.03 0.23±0.03 0.22±0.03甲氨蝶呤組3 0.84±0.08△0.85±0.07△0.85±0.06△溫陽通絡(luò)方高劑量組3 0.86±0.06△0.86±0.07△0.89±0.05△溫陽通絡(luò)方中劑量組3 0.58±0.09△0.50±0.06△0.50±0.06△溫陽通絡(luò)方低劑量組3 0.30±0.02△0.29±0.04△0.30±0.06△

3.3 滑膜細胞凋亡實驗與正常組相比，溫陽通絡(luò)方＋LPS組、溫陽通絡(luò)方組滑膜細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與LPS組相比，溫陽通絡(luò)方＋LPS組、溫陽通絡(luò)方組滑膜細胞凋亡率明顯（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 溫陽通絡(luò)方對各組滑膜細胞凋亡率的影響

表4 溫陽通絡(luò)方對各組滑膜細胞凋亡率的影響（±s）

表4 溫陽通絡(luò)方對各組滑膜細胞凋亡率的影響（±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05，與LPS組相比，△P＜0.05

／%LPS組組別n凋亡率1.11±0.06正常組3 2.53±0.12溫陽通絡(luò)方＋LPS組3 15.01±0.03*△溫陽通絡(luò)方組3 37.02±1.61 3*△

4 討論

溫陽通絡(luò)方是國家級名老中醫(yī)吳生元教授基于“陽虛絡(luò)痹”理論總結(jié)出的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效驗方。全方由附片、桂枝、麻黃、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中藥組成，具有溫陽散寒、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功，主治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證或風(fēng)寒濕痹證。前期研究證實，溫陽通絡(luò)方具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及抑制骨破壞的作用［2-5］?！吨胁亟?jīng)》指出：“陽者生之本，陰者死之基，陰宜長損，陽宜長益，順陽者生，逆陽者死”“陽化氣，陰成形”，陽氣流通，陰氣無滯，自然百病不作。陽衰陰長，風(fēng)寒濕乘虛侵襲，具體表現(xiàn)在有形陰邪積聚。因此，陽虛邪乘，絡(luò)脈痹阻可能是滑膜發(fā)生嗜神經(jīng)侵襲的病機所在。

Sema3A／NRP-1／PlexinA復(fù)合體在RA滑膜組織的表達證實了嗜神經(jīng)侵襲可能是RA發(fā)病的重要機制。Sema3A具有免疫調(diào)節(jié)的作用，它能與血管內(nèi)皮生長因子165（VEGF165）競爭性結(jié)合NRP-1［6-15］。研究顯示，Sema3A能完全阻斷VEGF165信號通路，因此，其表達減少能加劇RA病程［16-20］。而NRP-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是由PlexinA共受體實現(xiàn)的。Sema3A／NRP-1／PlexinA復(fù)合體通過小G蛋白家族的Rac和Rho實現(xiàn)對細胞微絲骨架的調(diào)控。其中，Rac家族與B淋巴細胞增殖激活和樹突狀細胞介導(dǎo)的T淋巴細胞激活密切相關(guān)［21-22］。由此可見，Sema3A／NRP-1／PlexinA調(diào)控體系參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理進程，其對RA的調(diào)控可能通過免疫調(diào)節(jié)及抗滑膜新生血管形成發(fā)揮作用。

綜上所述，嗜神經(jīng)侵襲可能參與滑膜增殖，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要機制。Sema3A／NRP-1／PlexinA調(diào)控體系在滑膜病程中可能有重要作用，其可能通過影響滑膜細胞凋亡等抑制炎癥反應(yīng)發(fā)展。Sema3A／NRP-1／PlexinA體系可能是溫陽通絡(luò)方治療RA的效驗靶點。