賈 寧，邵珊珊,2，3，陳文斌,2,3，薄 濤,2,3，趙家軍,2,3，方 麗,2,3，何 釗,2,3，高 聆,2,3

(1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021；2. 山東省內(nèi)分泌與脂代謝重點實驗室，山東 濟(jì)南 250021；3. 山東省臨床醫(yī)學(xué)研究院內(nèi)分泌代謝研究所，山東 濟(jì)南 250021)

非酒精性脂肪肝是脂肪在肝臟的異位沉積導(dǎo)致的一系列肝臟病變，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌，其全球發(fā)病率為22.10%～28.65%[1]。非酒精性脂肪肝的病理影響不僅僅限于肝臟，而且涉及人體各個系統(tǒng)，影響慢性疾病如冠心病、高血壓、2型糖尿病、腫瘤、慢性腎病等的發(fā)生發(fā)展[2]。然而目前非酒精性脂肪肝的治療除了生活方式干預(yù)外，并無有效藥物獲批[3]。茵陳是肝膽系統(tǒng)疾病常用的中藥之一，具有保肝、利膽、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-5]，其單方用于慢性肝炎的治療效果較好[6-7]，但對非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用及機制尚不明確。本實驗通過高脂誘導(dǎo)制備非酒精性脂肪肝小鼠模型，探討了茵陳單方的可能作用機制，為茵陳的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡C57BL/6J雄鼠購自北京維通利華公司，于室溫22～24 ℃，相對濕度50%～70%，每日12 h日光燈循環(huán)照明的環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食飲水。動物研究經(jīng)山東省立醫(yī)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)(2018-011)。

1.2主要試劑及實驗設(shè)備 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)(深圳，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，組織三酰甘油(TG)含量測定試劑和組織總膽固醇(TC)含量測定試劑(北京，普利萊基因技術(shù)有限公司)，TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒(深圳，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，蘇木素、伊紅、油紅O染色試劑(武漢，谷歌生物科技有限公司)，4%多聚甲醛(美國，BOSTER)，裂解緩沖液(RIPA+PMSF)、蛋白濃度測定(BCA)法試劑盒(上海申能博彩生物科技公司), 4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，磷酸酶抑制劑(美國，Bimake)，抗磷酸化的p38 MAPK激酶抗體(Thr180/Tyr182)(美國，CST，1∶1 000)，抗總p38 MAPK 激酶抗體(美國，CST，1∶1 000)，抗p62抗體(美國，Abcam，1∶1 000)，抗LC3B抗體(美國，CST，1∶1 000)，抗GAPDH抗體(美國，Abcam，1∶7 500)，羊抗兔/羊抗鼠二抗(美國，Jackson ImmunoResearch，1∶5 000)；全自動生化分析儀(日本，奧林巴斯AU5400)，恒冷箱切片機 (德國，徠卡公司，CM1950)，正置熒光顯微鏡(德國，Zeiss Axio Imager A2)，酶標(biāo)儀(美國，Molecular Devices公司, Spectra MAX plus 384)，PVDF膜(美國，Millipore公司)，離心機(德國，eppendorf 5810R)，DK-600s型三用恒溫冰箱、THZ-312型臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備)，超純水儀(英國，ELGA公司，Purelab Classic UF)，電子分析天平(日本，A&D)，Western-blotting電泳儀/電泳槽/轉(zhuǎn)膜槽(美國，Bio-Rad)，化學(xué)發(fā)光儀(美國，Alpha Innotech，F(xiàn)lurochem Q)。

1.3藥物來源及制備 茵陳(綿茵陳)來自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房(河北春開制藥有限公司，批號170401209)，依據(jù)臨床常用藥物煎煮方法煎煮，即將干燥茵陳地上部分100 g加蒸餾水1 000 mL室溫(25 ℃)浸泡4 h，將浸透的茵陳水煮沸40 min，過濾出水煎液，向殘余的藥渣中再次加入1 000 mL蒸餾水，煮沸40 min，將兩次濾出的水煎液混勻,置通風(fēng)櫥的水浴鍋上加熱濃縮至1.25 g生藥/mL，期間及時排出水蒸氣，待晾至室溫后分裝儲存到-80 ℃，灌胃之前用蒸餾水稀釋。茵陳用藥劑量依據(jù)《中華人民共和國藥典( 2015年版)》中常用劑量15 g為低劑量、60 g為高劑量,通過人與動物體表面積折算等效劑量換算[8]。

1.4模型建立、分組及干預(yù) 42只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選12只為普食組，給予普通飲食(北京科澳協(xié)力大小鼠維持飼料)；剩余30只參照文獻(xiàn)[9]方法給予高脂飲食(60%kcal 脂肪, 美國Research Diets，D12492)，連續(xù)喂養(yǎng)12周建立非酒精性脂肪肝模型，隨機篩選3只確定造模成功后，將剩余小鼠隨機分為模型組、茵陳低劑量組、茵陳高劑量組，每組9只。茵陳低劑量組和茵陳高劑量組小鼠在高脂飲食同時分別給予茵陳1.95 g/(kg·d)和7.8 g/(kg·d)灌胃，模型組給予高脂飲食同時給予等量蒸餾水灌胃，普食組給予普通飲食同時給予等量蒸餾水灌胃，均每日1次，連續(xù)灌胃16周。觀察小鼠毛發(fā)、進(jìn)食飲水及活動情況，每周定時稱量小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量。

1.5樣本獲取及制備 干預(yù)16周末，小鼠禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘取一側(cè)眼球取血，3 000 r/min快速離心10 min，取上清液，分裝冷凍保存待檢測；分離肝臟組織迅速稱重，并在肝右側(cè)最大葉相同位置取2塊大小約4 cm×3 cm×2 cm肝組織，一塊放4%多聚甲醛固定，另一塊液氮冷凍，剩下的肝組織分裝后液氮存放。

1.6觀測指標(biāo)與方法

1.6.1血清學(xué)指標(biāo) 冷凍的血清4 ℃過夜，緩慢融化，根據(jù)相應(yīng)試劑說明使用全自動生化儀檢測血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.6.2肝臟組織病理學(xué) 肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后經(jīng)過脫水石蠟包埋后，切成5 μm石蠟切片，依照試劑盒說明進(jìn)行HE染色；部分液氮中肝組織制成10 μm冰凍切片，根據(jù)試劑說明進(jìn)行油紅O染色，并在蘇木素染液中復(fù)染3 min；在正置熒光顯微鏡下觀察組織病理結(jié)構(gòu)，每個切片隨機選3個視野拍照記錄。

1.6.3肝臟病理NAS評分 病理學(xué)專家不知道分組的情況下，參照文獻(xiàn)[10]對所有HE染色的肝臟病理切片進(jìn)行評分。脂肪沉積：<5%為0分，5%～33%為1分，34%～66%為2分，>66%為3分；小葉炎癥：無炎性灶為0分，<2個炎性灶/200×視野為1分，2～4個炎性灶/200×視野為2分，>4個炎性灶/20×視野為3分；肝細(xì)胞氣球樣變：無為0分，很少為1分，明顯或許多為2分。

1.6.4肝組織中TG和TC含量 快速稱取30 mg肝組織至高壓消毒過的1.5 mL EP管中，剪碎組織，加入1×PBS(組織用)1 000 μL洗滌3次，4 ℃下12 000×g離心1 min后棄上清，按照組織TG和組織TC含量測定試劑盒內(nèi)說明書加入相應(yīng)的裂解液各350 μL，用組織破碎儀制成肝臟勻漿，4 ℃下12 000×g離心15 min，取上清用BCA法測定蛋白質(zhì)的含量，沉淀物70 ℃水浴10 min，再次12 000×g離心15 min，取上清，按照測定試劑盒內(nèi)說明書測定組織中TG和TC含量。測得OD值用相應(yīng)的蛋白含量進(jìn)行校正后再進(jìn)行比較。

1.6.5肝組織中磷酸化p38(p-p38 MAPK)、總p38(p38 MAPK)、p62及LC3蛋白表達(dá)情況 每組隨機選3只，采用Western blot法檢測：快速稱取30 mg肝組織至高壓消毒過的1.5 mL EP管中，剪碎組織，加入1×PBS(組織用)1 000 μL洗滌3次，4 ℃下12 000×g離心1 min后棄上清，按照蛋白提取試劑盒說明提取蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液(3∶1)，100 ℃×10 min水浴變性。配置10% SDS電泳凝膠，將相同蛋白量的蛋白加入凝膠的梳孔中，進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入以下抗體4 ℃過夜：抗磷酸化的p38 MAPK激酶抗體，抗總p38 MAPK 激酶抗體，抗p65抗體，抗LC3B抗體，抗GAPDH抗體，第2天1×TBST洗膜 5 min×4次，加入相應(yīng)的二抗(兔抗或鼠抗)，室溫孵育1h，再次1×TBST洗膜 5 min×4次，用化學(xué)發(fā)光法檢測印記蛋白，并用顯影成像分析系統(tǒng)分析。使用Alpha-Q 軟件進(jìn)行灰度分析，用同一張膜上GAPDH灰度值校正靶蛋白水平。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、肝臟外觀比較 實驗過程中，各組小鼠進(jìn)食活動情況良好，未見異常死亡。與普食組比較，模型組、茵陳低劑量組、茵陳高劑量組小鼠體質(zhì)量均明顯增加(P均<0.05)，此3組小鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見圖1。4組小鼠每日進(jìn)食量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見圖2。與普食組比較，模型組、茵陳低劑量組、茵陳高劑量組小鼠肝臟彌漫性腫大，色澤偏黃，表面油膩感，邊緣變鈍；茵陳干預(yù)組較模型組小鼠肝臟腫大程度輕，色澤紅潤，其中茵陳低劑量組改變較輕，見圖3。

圖1 各組小鼠實驗過程中體質(zhì)量變化

圖2 各組每只小鼠每日平均進(jìn)食量

2.2各組小鼠血清生化指標(biāo)比較 模型組小鼠血清ALT、AST、TC、LDL-C、HDL-C水平均明顯高于普食組(P均<0.05)；茵陳低劑量組和茵陳高劑量組血清ALT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

圖3 各組小鼠肝臟大體形態(tài)

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.3各組小鼠肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色顯示，模型組肝細(xì)胞腫脹，肝內(nèi)廣泛分布脂滴空泡，部分肝細(xì)胞內(nèi)可見氣球樣變及少量炎性小體，茵陳干預(yù)組肝細(xì)胞腫脹減輕，脂滴空泡減少，其中茵陳低劑量組較高劑量組改善明顯，見圖4。油紅O染色顯示，模型組肝細(xì)胞內(nèi)可見紅染的脂滴，數(shù)量多、體積大，茵陳干預(yù)組脂滴數(shù)量、體積較模型組減少及縮小，其中茵陳低劑量組較高劑量組改善明顯，見圖5。

圖4 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×200)

圖5 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)油紅O染色表現(xiàn)(×100)

2.4各組小鼠肝臟組織病理學(xué)NAS評分 模型組小鼠肝臟脂肪變性積分、肝細(xì)胞氣球樣變積分均明顯高于普食組(P均<0.05)，茵陳低劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，茵陳高劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；各組小鼠肝小葉炎癥積分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)NAS評分

2.5各組小鼠肝臟組織中TG和TC含量 模型組小鼠肝臟組織中TG、TC含量均明顯高于普食組(P均<0.05)；茵陳低劑量組TG含量明顯低于模型組和茵陳高劑量組(P均<0.05)，茵陳高劑量組TG含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、茵陳低劑量組、茵陳高劑量組間TC含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖7。

圖7 各組小鼠肝臟組織中TG和TC含量

2.6各組小鼠肝臟組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p62、LC3蛋白表達(dá)情況 模型組小鼠肝臟組織中p-p38 MAPK、p62、LC3蛋白表達(dá)水平均明顯高于普食組(P均<0.05)；茵陳低劑量組小鼠肝臟組織中p-p38 MAPK、p62蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，LC3蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖8～10。

圖8 各組小鼠肝臟p-p38 MAPK及p38 MAPK表達(dá)情況(每組隨機抽取3只小鼠，每一條帶代表1只小鼠)

3 討 論

TG在肝臟的異位沉積在非酒精性脂肪肝發(fā)展過程中屬于相對“良性”“緩慢”的病理階段，因而臨床常常容易被忽視，但此階段是非酒精性脂肪肝后續(xù)病理變化的基礎(chǔ)[11-12]，在此時進(jìn)行積極的臨床干預(yù)能有效防止非酒精性脂肪肝不良結(jié)局的發(fā)生。基于此，本研究選擇高脂誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝小鼠模型，基本復(fù)制了臨床非酒精性脂肪肝第一階段即單純性脂肪肝階段，并通過NAS評分對非酒精性脂肪肝向脂肪性肝炎進(jìn)展進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茵陳單方能有效減少肝臟TG的沉積，延緩非酒精性脂肪肝進(jìn)展，且低劑量優(yōu)于高劑量。

圖9 各組小鼠肝臟組織中p62蛋白表達(dá)情況(每組隨機抽取3只小鼠，每一條帶代表1只小鼠)

圖10 各組小鼠肝臟LC3蛋白表達(dá)情況(每組隨機抽取3只小鼠，每一條帶代表1只小鼠)

茵陳又稱“白蒿”，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其歸于上品，謂其“味苦平”“主風(fēng)濕寒熱邪氣，熱結(jié)黃疸，久服輕身益氣耐老”，《本草正義》謂其“為利濕清熱專品，乃濕熱發(fā)黃之主藥”，《中藥學(xué)》將其功效總結(jié)為“清熱利濕，利膽退黃”，然而查閱古籍發(fā)現(xiàn)茵陳功效并不拘泥于此。例如吳鞠通在藿香正氣散加減方中“三焦?jié)裼?，升降失司，脘連腹脹，大便不爽”之證加用茵陳，注言“茵陳宣濕郁而動生發(fā)之氣”；又如張錫純在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》治療肝陽上亢之類中風(fēng)初時以龍骨、牡蠣、龜板、芍藥等鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，有患者服后有覺氣血上攻而加劇者，加用茵陳、麥芽、川楝子后癥狀緩解，張錫純認(rèn)為“肝為將軍之官，其性剛果，若但用藥強制，或轉(zhuǎn)激發(fā)其反動之力”，此處加茵陳，因其“得初春少陽生發(fā)之氣，與肝木同氣相求，瀉肝熱兼舒肝郁，實能將順肝木之性”，因此，茵陳又有理氣開郁、宣發(fā)濕氣之功。由此，茵陳可升可降，清輕主升，味苦主降，“理氣開郁，宣發(fā)濕氣”體現(xiàn)其生升之性，“清熱利濕，利膽退黃”體現(xiàn)其降泄特性，然而其升降之性是如何體現(xiàn)的呢？翻閱古籍發(fā)現(xiàn)，茵陳功效的不同體現(xiàn)，除與藥劑配伍有關(guān)外，跟劑量大小密不可分。例如，《傷寒論》治療濕熱黃疸經(jīng)典方劑“茵陳蒿湯”，茵陳六兩清利濕熱，按古今度量衡折算[13]相當(dāng)于現(xiàn)代劑量約93.72 g?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中茵陳二錢，疏肝開郁，僅相當(dāng)于現(xiàn)代劑量7.46 g。此外，現(xiàn)代醫(yī)家在臨證中亦發(fā)現(xiàn)茵陳劑量不同其功效各異[14]， 因此，茵陳單方應(yīng)用時應(yīng)注意其量效關(guān)系，大劑量性偏降，小劑量性偏升。本研究發(fā)現(xiàn)茵陳低劑量組肝臟病理改變較茵陳高劑量組輕，肝臟組織中TG含量明顯低于茵陳高劑量組，可見茵陳對非酒精性脂肪肝主要通過理氣開郁、宣發(fā)濕氣功效發(fā)揮作用，由此反推非酒精性脂肪肝的中醫(yī)證型當(dāng)以肝氣郁結(jié)、濕濁內(nèi)蘊為主，這與現(xiàn)代醫(yī)家基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)Ψ蔷凭灾靖尾⌒宰C素認(rèn)識一致[15]。

非酒精性脂肪肝是一種慢性進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，近年來越來越多的研究表明炎癥反應(yīng)和自噬在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[16-18]。p38 MAPK是促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生的主要因子，也是介導(dǎo)細(xì)胞自噬的重要效應(yīng)因子，研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK在脂多糖(LPS)刺激下通過酪氨酸磷酸化而被激活，刺激NF-κB、TNF-α、IL-6等促炎因子分泌，引起細(xì)胞損傷，促進(jìn)非酒精性脂肪肝進(jìn)展為脂肪性肝炎[19]。此外，p38 MAPK通過調(diào)節(jié)p62表達(dá)參與細(xì)胞自噬[20]，p62是一種泛素化蛋白和選擇性自噬底物，在各種因素刺激下與泛素化蛋白聚體堆積作為底物參與自噬[21]，而LC3是自噬體標(biāo)記分子，能在自噬小體形成前識別胞質(zhì)內(nèi)的廢物以激活自噬[22]，二者是自噬過程中最為關(guān)鍵的因子。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟組織中p-p38 MAPK、p62、LC3表達(dá)增加，提示小鼠肝臟p38 MAPK通路被激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)，p62泛素化蛋白聚體不斷形成，但不能被LC3識別而分解，因此自噬過程受到抑制；低劑量茵陳干預(yù)后，小鼠肝臟組織中p-p38 MAPK、p62蛋白表達(dá)水平降低，LC3蛋白表達(dá)水平有增高趨勢，說明小劑量茵陳干預(yù)能減輕肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)，激活肝臟自噬過程，從而促進(jìn)脂質(zhì)分解，減少TG沉積。

綜上所述，低劑量茵陳能減少高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠肝臟TG沉積，延緩非病情進(jìn)展，茵陳對非酒精性脂肪肝的治療作用可能與激活p38 MAPK通路，促進(jìn)自噬有關(guān)，為茵陳的臨床合理應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。