朱文雄，袁軼峰，孫弘本，劉 濤，陳其華，賀菊喬

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

少弱精癥是引起男性不育的極為常見病因，但其發(fā)病機制仍不十分明確，臨床缺少有效的治療手段。近些年來，許多醫(yī)家開始研究依靠中醫(yī)辨證、采用中醫(yī)方劑及相關(guān)中醫(yī)制劑來治療少弱精子癥的方法，并取得了顯著療效[1-3]。調(diào)治天癸方是我院國家級名老中醫(yī)賀菊喬教授以“腎-天癸-腎子軸”[4]為理論基礎(chǔ)制定且經(jīng)多年臨床應(yīng)用治療少弱精癥的驗方，功可滋養(yǎng)肝腎，益氣填精。本實驗通過雷公藤多苷建立少弱精癥大鼠模型，觀察了調(diào)治天癸方對少弱精癥大鼠精子質(zhì)量及Fas表達的影響，旨在為該方的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～330 g，由北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供，動物許可證號：SCXK(京)2018-0010。

1.2實驗藥物 調(diào)治天癸方由黃芪15 g、黃精15 g、菟絲子15 g、枸杞子15 g、車前子10 g、熟地黃15 g、山茱萸10 g、紫河車9 g等組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一提供并熬制成藥液。生精膠囊由遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司提供，國藥準字Z20027672，規(guī)格：0.4 g/粒，產(chǎn)品批號：20170905。

1.3實驗試劑 PMSF，Amresco生產(chǎn)，貨號：329-98-6；羊抗鼠-HRP，Abmart生產(chǎn)，貨號：M21001L；cocktail，上海源葉生產(chǎn)，貨號：10557；溴酚藍，Amresco生產(chǎn)，貨號：BO449-5G；β-actin，杭州華安生產(chǎn)，貨號：1854-s；三硫叔糖醇(DTT)，Biosharp生產(chǎn)，貨號：Amresco0281；甘油，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，貨號：10010618；SDS，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，貨號：30166428；marker，TransGen Biotech生產(chǎn)，貨號：DM111；PVDF膜(0.45 μm)，Millipore生產(chǎn)，貨號：IPVH00010；ECL底物液，Thermo生產(chǎn)，貨號：NCI5079；Beta-actin，abcam生產(chǎn)，貨號：Ab8226。

1.4實驗主要儀器 電泳儀，Tanon生產(chǎn)，型號：EPS300；酶標儀，Thermo生產(chǎn)，型號：muLISKANMK3；PH計，德國Metter-Toledo GmbH公司生產(chǎn)，型號：LP115；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)，型號：CPA；水平搖床，ORBITAL SHAKER生產(chǎn)，型號：TS-1000；磁力攪拌器，江蘇省金壇市中大儀器廠生產(chǎn)，型號：T8-1；4 ℃離心機，Eppendorf生產(chǎn)，型號：Centrifuge 5415R。

1.5動物分組、造模及干預(yù) 將72只雄性SD成年大鼠隨機分為正常組、模型組、生精膠囊組和調(diào)治天癸方高、中、低劑量組，每組12只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常組繼續(xù)給予正常飲食外，其余組參考文獻[5-6]方法，連續(xù)給予雷公藤多苷片20 mg/(kg·d)灌胃5周建立少弱精癥模型。造模成功后,調(diào)治天癸方高、中、低劑量組給予調(diào)治天癸方水煎液3.38 g/(100 g·d)、1.69 g/(100 g·d)、0.85 g/(100 g·d)灌胃，生精膠囊組給予生精膠囊粉末0.06 g/100 g加等量溫開水(水溫40～50 ℃)充分攪拌后灌胃，正常組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每日2次，連續(xù)灌胃5周。

1.6取材 上述動物于末次灌胃結(jié)束后48 h內(nèi)，參考文獻[5]方法，應(yīng)用戊巴比妥鈉0.1 g溶于2 mL生理鹽水中腹腔注射麻醉大鼠，摘取大鼠睪丸及附睪，然后脫頸處死。摘取的睪丸組織在-80 ℃冰箱中保存。將一側(cè)附睪取尾部放入2 mL提前預(yù)熱好至37 ℃的生理鹽水中，將其剪碎并靜置2 min，收集附睪尾精子，制備精子混懸液。

1.7精子質(zhì)量檢測 按照文獻[7-8]方法，取100 μL精子混懸液，加入1 mL 37 ℃的生理鹽水中稀釋，37 ℃恒溫水浴2 min，之后取10 μL加到預(yù)溫的血細胞計數(shù)板上，選取6個視野，于2 min內(nèi)應(yīng)用計算機輔助精子分析方法檢測精子密度和精子活動率。

1.8睪丸組織中Fas表達檢測 采用Western blot法檢測大鼠睪丸組織中Fas蛋白表達情況。首先在基礎(chǔ)裂解液中加入PMSF、cocktail 、Triton-100和NaVO3制備蛋白裂解液，將各組大鼠睪丸組織取出后裂解制備樣品，將制得的樣品進行SDS-PAGE電泳。然后進行轉(zhuǎn)膜：將剪切好的PVDF膜放到甲醇中浸泡2 min；取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。按照黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板依次放好，夾緊板后放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)，黑色板的一面對照黑色負極。在轉(zhuǎn)膜槽中加滿電轉(zhuǎn)液開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜過程在4 ℃進行，轉(zhuǎn)膜條件為100 V/100 mA。通過ECL顯色系統(tǒng)實現(xiàn)免疫印跡顯色，具體操作方法：首先用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。再用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。之后TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，以洗去多余一抗。然后用封閉液稀釋HRP標記二抗(1∶1 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。同前方法洗去多余二抗。而后將ECL試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X射線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。最后晾干膠片并掃描，分析各膠片的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠附睪精子質(zhì)量比較 模型組大鼠精子密度、精子活動率均明顯低于正常組(P均<0.05)；生精膠囊組及調(diào)治天癸方各劑量組大鼠精子密度、精子活動率均明顯高于模型組(P均<0.05)，且調(diào)治天癸方各劑量均明顯高于生精膠囊組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠附睪精子質(zhì)量比較

2.2各組大鼠睪丸組織中Fas蛋白表達水平比較正常組、模型組、生精膠囊組及調(diào)治天癸方高、中、低劑量組睪丸組織中Fas蛋白表達水平分別為0.20±0.08，1.03±0.06，0.73±0.06，0.20±0.08，0.36±0.07，0.61±0.10，灰度圖見圖1。模型組Fas蛋白表達水平明顯高于正常組，生精膠囊組及調(diào)治天癸方各劑量組均明顯低于模型組，調(diào)治天癸方各劑量組均明顯低于生精膠囊組，且調(diào)治天癸方高劑量組明顯低于調(diào)治天癸方中劑量組，調(diào)治天癸方中劑量組明顯低于調(diào)治天癸方低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

A為正常組；B為模型組；C為生精膠囊組；D為調(diào)治天癸方高劑量組；E為調(diào)治天癸方中劑量組；F為調(diào)治天癸方低劑量組

3 討 論

在正常的精子發(fā)生過程中，生精細胞凋亡是維持精子質(zhì)量和數(shù)量的保證，但過度的凋亡則是導(dǎo)致少精和弱精的主要原因。這一現(xiàn)象受多種基因調(diào)控，其中Fas與Fas-L銜接可觸發(fā)生精細胞的生理性凋亡，這是Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)哺乳動物睪丸生精細胞凋亡的主要途徑。Fas-L特異性的與生精細胞膜上Fas結(jié)合后，通過胞內(nèi)肽段的死亡結(jié)構(gòu)域激活相關(guān)的半胱天冬氨酸酶(Caspase-3) 級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)其凋亡[9]。Fas/FasL系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能與男性生精功能密切相關(guān)[10-11]。

雷公藤多苷由植物雷公藤中分離而出，雷公藤制劑具有生殖毒性，可導(dǎo)致男性性欲減退、精子活力下降、少精或無精，長期用藥還可能導(dǎo)致睪丸萎縮等[12-13]。本實驗結(jié)果及文獻[5,12,14-15]均顯示雷公藤多苷可顯著降低精子活力、活率，可促進Fas表達。

少弱精癥在病因病機上有相互關(guān)聯(lián)的部分，但又有其不同之處。所謂精薄清冷，其實不能一概而論。少精癥多屬中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇，巢元方在《諸病源候論》中提到“腎主骨髓，而藏于精。虛勞腎氣虛弱，故精液少也”，即虛勞少精候，可以為之證。而弱精癥多屬中醫(yī)學(xué)“精寒”“精冷”范疇，因為陽者主升主動，故中醫(yī)辨證總屬陽虛范疇。調(diào)治天癸方中黃芪善補一身之氣；黃精長于益氣填精，《圣記總錄》記載：“常服精天草(黃精)能助氣固精，補填丹田、益脾益腎、潤心肺、駐顏”，與黃芪合用，補氣生精，為生育提供動力及物質(zhì)基礎(chǔ)；枸杞子填精補血、平補肝腎，菟絲子益腎精、補腎陽，車前子淡滲泄?jié)?，使全方補而不滯，三藥合用，正合五子衍宗丸方義，共奏補腎益精之功；肝經(jīng)環(huán)繞陰器，腎臟主司生殖，熟地黃、山茱萸補益肝腎之陰，是治療肝腎虛證的經(jīng)典藥對；紫河車為血肉有情之品，味甘咸，氣大溫，功可溫腎陽補腎精，益氣養(yǎng)血。全方切中病機，臨床應(yīng)用效果較好。

生精膠囊是中華醫(yī)學(xué)會男科學(xué)分會推薦的治療男性不育癥的藥物[16]，由鹿茸、枸杞子、人參、冬蟲夏草、菟絲子、沙苑子、淫羊藿、黃精、何首烏、桑椹、補骨脂、骨碎補、仙茅、金櫻子、覆盆子、杜仲、大血藤、馬鞭草、銀杏葉組成，組方以補腎溫陽填精為治療法則?，F(xiàn)代臨床研究表明生精膠囊具有調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸、抗氧化等功能，可改善精子質(zhì)量[17-18]，故選擇其為本實驗的陽性對照藥物。

本實驗結(jié)果顯示，生精膠囊組及調(diào)治天癸方各劑量組大鼠精子密度、活動率均高于模型組，睪丸組織中Fas蛋白表達水平均低于模型組，且調(diào)治天癸方各劑量組較生精膠囊組改善更明顯，且調(diào)治天癸方高、中、低劑量組Fas蛋白表達水平呈劑量依賴性降低。提示調(diào)治天癸方可明顯改善雷公藤多苷致少弱精癥大鼠的精子質(zhì)量，抑制睪丸組織中Fas的表達。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。