李真真，周真，羅卓迪，王智琴

廣東省婦幼保健院，廣州511400

尖銳濕疣是一種性傳播疾病，由HPV 感染引起，其在年輕成人中的患病率為0.5%～1%，且復(fù)發(fā)率高。HPV 多在人體溫暖潮濕的條件下繁殖，因此尖銳濕疣臨床表現(xiàn)為男性包皮、龜頭及女性陰部或肛門附近出現(xiàn)淡紅色柔軟的丘疹，數(shù)目逐漸增多，且體積逐漸增大，表面凸凹不平［1］。HPV 分為 100 多個(gè)亞型，臨床可見的尖銳濕疣90%以上由HPV6 或HPV11 引起。角質(zhì)形成細(xì)胞受損可引起多種皮膚疾病，過度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞可發(fā)展為鱗癌或基底細(xì)胞癌［2］。β 連環(huán)素（β-catenin）是環(huán)連蛋白家族中的一員，參與多種細(xì)胞的增殖和分化［3］。核因子κB（NF-κB）參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在多種腫瘤中表達(dá)異常［4］。c-myc 是原癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞的生長，在多種腫瘤中表達(dá)異常［5］。但有關(guān)NF-κB、c-myc 在尖銳濕疣皮損及角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)變化研究較少。本研究對尖銳濕疣皮損組織及角質(zhì)形成細(xì)胞中NF-κB、β-catenin、c-myc 的表達(dá)變化進(jìn)行觀察，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 1 月—2020 年 5 月本院皮膚科收治的尖銳濕疣患者70例，均符合尖銳濕疣的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中初診37 例、復(fù)發(fā)33 例。根據(jù)感染的HPV 分為HPV16/18 型32 例（高危型組）、感染HPV6/11型38例（低危型組）。高危型組男13例、女19 例，年齡 24～64（31.54 ± 4.93）歲，病程 1～15 年，皮損位于包皮（男）、宮頸（女）；低危型組男15例、女22 例，年齡22～65（32.50 ± 5.62）歲，病程1 個(gè)月～11年，皮損位于包皮（男）、宮頸（女）。另選志愿者30例作為正常對照組，為本院包皮環(huán)切或子宮肌瘤手術(shù)患者，均排除HPV 感染、無局部皮膚病或系統(tǒng)性疾病。其中男 10 例、女 20 例，年齡 26～64（33.70 ±6.15）歲。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。各組均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 組織中 NF-κB、β-catenin、c-myc 蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。取尖銳濕疣患者皮損組織及正常對照組正常包皮、宮頸組織，石蠟包埋，制備切片。取石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化，用pH7.4 的PBS 沖洗，修復(fù)抗原，用過氧化物酶阻斷溶液，室溫下孵育，10 min 后加入一抗（鼠抗人NF-κB、β-catenin、c-myc單克隆抗體），室溫孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育，10 min 后加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（50 μL）室溫下孵育，10 min 后加 DAB 顯色，復(fù)染，脫水、透明、封片，400 倍顯微鏡下觀察染色情況，選取5個(gè)視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞。對染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞百分比<5%為0分，陽性細(xì)胞百分比5%～25%為1 分，陽性細(xì)胞百分比>25%～50%為2 分，陽性細(xì)胞百分比>50%～75%為3 分，陽性細(xì)胞百分比>75%為4分。以上兩項(xiàng)評分相加，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.3 角質(zhì)形成細(xì)胞的提取及鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］采用無血清法提取角質(zhì)形成細(xì)胞。取尖銳濕疣患者皮損組織及正常對照組正常包皮、宮頸組織，用PBS溶液（含慶大霉素50 μg／mL）浸泡，10 min后用PBS（含青鏈霉素100 U／mL）洗滌3 次，將以上組織剪成小塊用PBS 洗滌2次，加入Dispase 酶，于4 ℃過夜，吸出酶液PBS 洗滌2 次，加混合消化液（0.25%胰酶和0.01%EDTA），于37 ℃下5 min，用胰酶抑制劑終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心5 min 棄上清液，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)板中，細(xì)胞長至70%～80% 進(jìn)行傳代。將培養(yǎng)好的細(xì)胞置于-196 ℃液氮中保存。經(jīng)免疫組化染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈鋪路石狀，鑒定為角質(zhì)形成細(xì)胞。

1.4 角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT 法。將原代角質(zhì)形成細(xì)胞制成懸液，接種至96 孔板（200 μL／孔），每組設(shè)3 孔，孵育48 h。加入MTT 溶液（終濃度5 g／L），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用DMSO（20 μL／孔）終止反應(yīng)，振蕩均勻，測定波長570 nm處的吸光度值。繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 角質(zhì)形成細(xì)胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR 法。提取角質(zhì)形成細(xì)胞總RNA，用紫光分光光度計(jì)測定其純度與濃度，篩選光密度值260/光密度值280為1.8～2.0的樣品。按照RT-PCR 兩步法試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（25 μL）包括 2×Ultasybr mix?ture（12.5 μL）、RNase free dH2O（9.5 μL）、cDNA（1 μL）、上游引物（1 μL）、下游引物（1 μL）。β-catenin反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性 95 ℃ 45 s、退火60 ℃ 45 s、延伸 72 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。NF-κB 反應(yīng)條件：預(yù)變性 94 ℃ 4 min；變性 94 ℃30 s、退火55 ℃ 60 s、延伸72 ℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。c-myc 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 30s；變性95 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。GAPDH：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；變性 95 ℃5s、退火 60 ℃ 30 s、延伸 60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。所用引物由上海生物工程有限公司合成。用 2-ΔΔct法計(jì)算 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 的相對表達(dá)量。β-catenin 上游引物序列5′-GCGTGGA?CAATGGCTACTCAAG-3′、下游引物序列 5′-TAT?TAACTACCACCTGGTCCTC-3′；NF-κB 上游引物序列 5′-CTAGTCGAGATGGCGCTGCAT-3′、下游引物序列 5′-CGCGGATCCACTACAACAGGCA-3′；c-myc上游引物序列5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGA-3′、下游引物序列5′-CTCCAGCAGAAGGTGATCCAGA-3′；GAPDH 上游引物序列 5′-GCACCGTCAAGGCT?GAGGAC-3′、下游引物序列 5′-TGGTGAAGACGC?CAGTGGA-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。β-catenin、NF-κB、c-myc蛋白陽性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用±s表示，比較采用重復(fù)測量方差分析或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組組織中 β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白表達(dá) 高危型組、低危型組組織中β-catenin 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，正常對照組組織中β-catenin蛋白定位于細(xì)胞膜；各組組織中NF-κB 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)；各組組織中c-myc 蛋白定位于細(xì)胞核。與正常對照組比較，高危型組、低危型組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白陽性表達(dá)率高（P均<0.05）；與低危型組比較，高危型組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白陽性表達(dá)率高（P均<0.05）。見表1。

表1 各組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc蛋白表達(dá)情況［例（%）］

2.2 各組角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72 h 各組角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；培養(yǎng)96 h，各組角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），高危型組、低危型組細(xì)胞增殖能力高于正常對照組（P均<0.05），高危型組細(xì)胞增殖能力高于低危型組（P<0.05）。見表2。

表2 各組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力（±s）

表2 各組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力（±s）

組別高危型組低危型組正常對照組光密度值培養(yǎng)24 h 0.402±0.034 0.407±0.029 0.401±0.036培養(yǎng)48 h 0.414±0.028 0.411±0.023 0.408±0.019培養(yǎng)72 h 0.422±0.031 0.420±0.027 0.412±0.035培養(yǎng)96 h 0.467±0.034 0.435±0.038 0.421±0.029

2.3 各組角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達(dá)比較 各組角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。高危型組、低危型組角質(zhì)形成細(xì)胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達(dá)量高于正常對照組（P均<0.05），高危型組角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達(dá)量高于低危型組（P均<0.05）。見表3。

表3 各組角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)情況（±s）

表3 各組角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)情況（±s）

組別高危型組低危型組正常對照組n 32 38 30 β-catenin mRNA 1.895±0.043 1.507±0.037 0.604±0.030 NF-κB mRNA 1.205±0.146 0.792±0.153 0.445±0.106 c-myc mRNA 0.020 4±0.002 2 0.015 4±0.002 1 0.006 2±0.001 5

2.4 初診與復(fù)發(fā)患者角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達(dá)比較 復(fù)發(fā)患者角質(zhì)形成細(xì)胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達(dá)高于初診患者（P均<0.05），見表4。

表4 初診與復(fù)發(fā)患者角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)情況（±s）

表4 初診與復(fù)發(fā)患者角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)情況（±s）

患者初診復(fù)發(fā)n 37 33 β-catenin mRNA 1.605±0.037 1.882±0.029 NF-κB mRNA 0.816±0.117 1.182±0.132 c-myc mRNA 0.016 7±0.002 4 0.019 2±0.001 9

3 討論

尖銳濕疣由HPV 感染導(dǎo)致肛周及生殖器部位發(fā)生的增生性病變，好發(fā)于性活躍人群（20～40 歲），是臨床比較常見的性傳播疾病。我國尖銳濕疣的發(fā)病率位居性傳播疾病的第三位，僅次于非淋菌性尿道炎、淋?。?］。與尖銳濕疣相關(guān)的HPV 亞型主要為6、11、16、18 型，HPV6/11 為低危型，HPV16/18 為高危型。低危型病毒（HPV6/11）主要引起良性病變，但高危型病毒（HPV16/18）則與惡性腫瘤相關(guān)，約95%的宮頸腫瘤可檢測到HPV DNA［8］。目前雖然尖銳濕疣的治療方法較多，但其復(fù)發(fā)率一直居高不下，嚴(yán)重影響患者生理與心理健康。本研究對尖銳濕疣皮損組織及角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc 的表達(dá)進(jìn)行檢測，觀察三者的表達(dá)變化，以期為尖銳濕疣的臨床診治及預(yù)防復(fù)發(fā)提供參考。

β-catenin 是新原癌基因的產(chǎn)物，可與20 多種蛋白質(zhì)結(jié)合，參與多種細(xì)胞的增殖和分化。β-catenin是一種重要的細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架成分，也是Wnt信號通路中的關(guān)鍵組成部分。β-catenin 可在細(xì)胞內(nèi)形成不同類型的復(fù)合體。因此其發(fā)揮的生物學(xué)功能也不同，其復(fù)合物可通過酪氨酸激酶和磷酸酯酶的活性調(diào)節(jié)平衡，影響細(xì)胞遷移及細(xì)胞間黏附；可調(diào)控細(xì)胞質(zhì)游離的β-catenin 水平及其進(jìn)入細(xì)胞核的量及上百種靶基因的轉(zhuǎn)錄［9-10］。有研究探討β-catenin 蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者病理分級的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中β-catenin 蛋白呈高表達(dá)，與患者病理分級存在直接關(guān)聯(lián)［11］。何旭等［12］研究證實(shí)，miR-21可能通過調(diào)控β-catenin表達(dá)，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌患者病情進(jìn)展，縮短其生存時(shí)間。研究結(jié)果顯示在尖銳濕疣發(fā)病過程中，β-catenin mRNA表達(dá)異常，細(xì)胞周期發(fā)生改變［6］。

NF-κB 與多種相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。NF-κB 可拮抗細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期蛋白 Dl 是 G1～S 期的正性調(diào)控因子，NF-κB可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白Dl 的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。尖銳濕疣的發(fā)病還與感染者免疫功能異常相關(guān)，而TLR在免疫應(yīng)答中起重要作用。TLR9可抗病毒感染。NF-κB 可作用于靶基因，促進(jìn)各種炎癥相關(guān)因子表達(dá)。TLR9 可激活 NF-κB 和子蛋白 1 釋放多種炎癥相關(guān)因子參與免疫應(yīng)答［13］。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，NF-κB 在多種腫瘤組織中高表達(dá)［14-17］。NF-κB通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成、免疫逃逸和抑制凋亡來參與尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展［18］。

原癌基因是一種正常細(xì)胞基因，可編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白，其在正常表皮中呈表達(dá)狀態(tài)，可抑制細(xì)胞增生及誘導(dǎo)細(xì)胞分化。c-myc 是一種原癌基因，目前有關(guān)其在惡性腫瘤中激活的研究較多，在尖銳濕疣中的表達(dá)研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中c-myc蛋白呈高表達(dá)［19］。在子宮內(nèi)膜樣腺癌［20］、結(jié)腸癌［21］、鼻咽癌［22］、乳腺癌［23］組織中也呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，c-myc 主要表達(dá)于正常人表皮細(xì)胞基底層，而在尖銳濕疣皮損中，其分布于除角質(zhì)層以外的表皮各層（基底層、棘層及顆粒層），陽性信號定位于細(xì)胞核［24］，這與HPV作用于角質(zhì)形成細(xì)胞的分布一致。

本研究首先用免疫組化法檢測β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白在尖銳濕疣皮損組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，高危型組、低危型組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白陽性表達(dá)率高于正常對照組，且高危型組組織中三種蛋白的陽性表達(dá)率最高。說明三者參與了尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展過程，且其表達(dá)變化與病毒分型有關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，提取了角質(zhì)形成細(xì)胞。HPV 最初感染的是角質(zhì)形成細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)病毒DNA 呈低水平合成狀態(tài)，逐步建立穩(wěn)定水平的病毒基因組，細(xì)胞恢復(fù)自身生長周期，然后使病毒周期進(jìn)入生產(chǎn)階段。角質(zhì)形成細(xì)胞是炎癥反應(yīng)始動者，與其他免疫細(xì)胞相互作用產(chǎn)生炎癥信號網(wǎng)絡(luò)通路影響自身增殖分化及皮膚局部炎癥反應(yīng)［25］。本研究用MTT 法檢測角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示高危型組細(xì)胞增殖能力>低危型組>正常對照組，可見感染HPV 的角質(zhì)形成細(xì)胞存在異常增殖。用RT-PCR 法檢測角質(zhì)形成細(xì)胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)，高危型組角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達(dá)量最高，正常對照組角質(zhì)形成細(xì)胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達(dá)量最低。提示 β-catenin、NF-κB、c-myc 可能參與了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖過程。另外，本研究對β-catenin、NF-κB、c-myc 與患者復(fù)發(fā)的關(guān)系也進(jìn)行了探討，復(fù)發(fā)患者角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)高于初診患者。說明，尖銳濕疣復(fù)發(fā)可能與β-catenin、NF-κB、c-myc有關(guān)。

綜上所述，尖銳濕疣皮損組織及角質(zhì)形成細(xì)胞中β-catenin、NF-κB、c-myc 呈高表達(dá)，三者表達(dá)變化與HPV 分型及復(fù)發(fā)有關(guān)。但本研究也存在不足，所選患者樣本數(shù)較少，也未對β-catenin、NF-κB、c-myc在尖銳濕疣分型及復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制深入探討，后期研究將擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。