趙?，摚?萌，林曉靜，趙圓圓，梁慧琳，葉澤萍，楊錦芬*

? 藥材與資源 ?

陽春砂3個(gè)萜類合酶基因啟動(dòng)子的克隆及其參與萜類調(diào)控的分析

趙?，?，李 萌1，林曉靜1，趙圓圓1，梁慧琳1，葉澤萍2，楊錦芬1*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510000

獲得藥用植物陽春砂萜類合酶基因AvBPPS（bornyl diphosphate synthase）、AvLIS（linalool synthase）和AvHUS（humulene synthase）的啟動(dòng)子，探究其順式作用調(diào)控元件參與萜類合成的調(diào)控。從陽春砂葉片基因組DNA（genomic DNA，gDNA）中分別克隆獲得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA序列，據(jù)此設(shè)計(jì)特異引物，再通過FPNI-PCR（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR）方法分別克隆其啟動(dòng)子并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及對(duì)應(yīng)萜類含量數(shù)據(jù)，分析其較為關(guān)鍵的順式作用調(diào)控元件與萜類調(diào)控的關(guān)系。獲得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA長(zhǎng)度分別為2374、2295、2362 bp，均包含相應(yīng)基因的完整編碼區(qū)和7個(gè)外顯子。進(jìn)一步克隆獲得470、934、762 bp的啟動(dòng)子。AvBPPS啟動(dòng)子含有參與胚乳表達(dá)的順式作用調(diào)控元件GCN4-motif，結(jié)合基因表達(dá)量的分析，該順式作用調(diào)控元件調(diào)控了AvBPPS在陽春砂藥用部位種子中的特異表達(dá)，進(jìn)而影響了主要藥效萜類成分龍腦、乙酸龍腦酯等在種子中的積累。AvLIS和AvHUS啟動(dòng)子均含有參與茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件，轉(zhuǎn)錄組和萜類含量的分析顯示AvLIS響應(yīng)高濃度MeJA的誘導(dǎo)，而AvHUS沒有表現(xiàn)出對(duì)MeJA的響應(yīng)。首次從藥用植物陽春砂的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了參與胚乳表達(dá)和MeJA反應(yīng)的調(diào)控元件，為深入探究萜類合成關(guān)鍵酶的種子表達(dá)特異性和對(duì)MeJA響應(yīng)的機(jī)制提供了基礎(chǔ)，為萜類代謝的調(diào)控提供了操作元件。

啟動(dòng)子；陽春砂；萜類合酶；萜類化合物；茉莉酸甲酯

萜類化合物是自然界存在的一類由異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元組成的化合物[1]，包括含有2個(gè)異戊二烯單位的單萜類化合物，如芳樟醇；含有3個(gè)異戊二烯單位的倍半萜類化合物，如青蒿素；含有4個(gè)異戊二烯單位的二萜類化合物，如紫杉醇；以及含有6個(gè)異戊二烯單位的三萜類化合，如植物甾醇。萜類不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆防御等有重要作用，還具有重要的藥用價(jià)值，如青蒿素是治療瘧疾的特效藥[2]；紫杉醇是治療多種癌癥最有效的化療劑之一[3]等。陽春砂仁為姜科豆蔻屬陽春砂Lour.的干燥成熟果實(shí)，是我國(guó)著名的“四大南藥”之一，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效[4]。其揮發(fā)油中富含乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦等單萜類成分[5]。

植物細(xì)胞中萜類合酶以異戊二烯焦磷酸——香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）、法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）為底物，合成大量結(jié)構(gòu)功能多樣的萜類化合物[6]。按形成產(chǎn)物的不同，可分為單萜合酶、倍半萜合酶、二萜合酶等。目前，已有多種萜類合酶被報(bào)道，如‘西伯利亞’百合（Lilium‘Siberia’）中的LoTPS1催化底物GPP產(chǎn)生芳樟醇[7]；檀香樹L.中的SaTPS2催化FPP產(chǎn)生多種倍半萜化合物，其主產(chǎn)物為()-α-佛手柑[8]。課題組從陽春砂中克隆并鑒定了多個(gè)萜類合酶，如單萜合酶——蒎烯合酶（pinene synthase，AvPS）、龍腦基二磷酸合酶（bornyl diphosphate synthase，AvBPPS）和芳樟醇合酶（linalool synthase，AvLIS），它們對(duì)應(yīng)的主產(chǎn)物分別為蒎烯[9]、龍腦基二磷酸[9]和芳樟醇；還有倍半萜合酶——葎草烯合酶（humulene synthase，AvHUS）催化FPP生成倍半萜石竹烯和葎草烯，以葎草烯為主產(chǎn)物[10]。其中AvBPPS除了以龍腦基二磷酸為主產(chǎn)物，還生成莰烯、檸檬烯和月桂烯，而龍腦基二磷酸是陽春砂主要藥效物質(zhì)乙酸龍腦酯、樟腦和龍腦的直接或間接前體。因此AvBPPS是陽春砂萜類藥效物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶[9]。AvLIS和AvHUS的主產(chǎn)物芳樟醇和葎草烯是香料以及醫(yī)藥和食品工業(yè)的重要原料。

啟動(dòng)子（promoter）是位于基因上游的一段提供RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的DNA序列[11]。啟動(dòng)子通常有G-box、GCN4-motif、TATA-box、CGTCA-motif等順式作用調(diào)控元件[12-13]，其能夠在種子中特異表達(dá)，也能夠響應(yīng)激素如MeJA或脫落酸等，因而在植物種子萌發(fā)、衰老、抗逆反應(yīng)等生物過程基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。如刺五加L. mevalonate diphosphate decarboxylase（MDD）的2個(gè)茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）順式作用調(diào)控元件可根據(jù)MeJA的濃度來調(diào)控其皂苷類化合物的含量[14]。萜類合酶基因啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控會(huì)影響植物萜類產(chǎn)物的合成，克隆并分析藥用植物次生代謝相關(guān)功能基因的啟動(dòng)子，對(duì)深入了解藥用植物的萜類合成機(jī)制有重要的意義。課題組已從陽春砂中克隆了AvPS的啟動(dòng)子，并驗(yàn)證了其活性[15]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，克隆陽春砂的AvBPPS、AvLIS和AvHUS的基因組DNA（genomic DNA，gDNA），進(jìn)而克隆其啟動(dòng)子并分析其順式作用調(diào)控元件，以期了解其表達(dá)模式及其調(diào)控相應(yīng)萜類合成的機(jī)制。

1 材料與試劑

1.1 材料

樣品栽培于廣州中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)珍山，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)何國(guó)振教授鑒定為陽春砂Lour.，取其嫩葉保存至?80 ℃冰箱。

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、pLB零背景快速克隆試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PCR酶PrimerSTAR、LA Taq、DL2000 Maker、DNA切膠回收試劑盒購(gòu)于Takara公司；引物合成和基因測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 陽春砂葉片DNA的提取

參照植物gDNA提取試劑盒的操作說明書，提取陽春砂葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA完整性及濃度。

2.2 AvBPPS、AvLIS和AvHUS gDNA序列擴(kuò)增、分析及提交

以陽春砂葉片gDNA為模板，使用Primer STAR高保真酶對(duì)AvBPPS、AvLIS和AvHUS編碼區(qū)的gDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物與從cDNA中克隆基因編碼區(qū)的引物一致（表1）。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃，預(yù)變性5 min；98 ℃，變性10 s，按相應(yīng)退火溫度退火30 s，72 ℃，延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物純化后連接至pLB載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α，進(jìn)行菌落PCR篩選陽性重組子并測(cè)序獲得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA序列。利用Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalo/）和DNAMAN軟件，將測(cè)序結(jié)果分別與已獲得的AvBPPS、AvLIS和AvHUS序列比對(duì)，確定其gDNA序列后，登錄GenBank https: //www.ncbi. nlm.nih.gov/genbank/submit/，用BankIt提交gDNA序列。

表1 擴(kuò)增gDNA的引物

2.3 啟動(dòng)子克隆

根據(jù)fusion primer and nested integrated PCR（FPNI-PCR）引物設(shè)計(jì)原則和“2.2”項(xiàng)獲得的AvBPPS、AvLIS和AvHUS gDNA序列，在5’端分別設(shè)計(jì)3條方向一致的特異性引物（gene specific primers，GSP），見表2。FPNI-PCR分為3輪擴(kuò)增，第1輪PCR取適量陽春砂葉片gDNA，用9條通用簡(jiǎn)并引物FP1～9[15]分別與AvBPPS、AvLIS和AvHUS特異引物GSP TPS3/TPS12/TPS6-1進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR；第2輪PCR取第1輪PCR產(chǎn)物為模板，巢式特異引物FSP1分別與3個(gè)基因的特異引物GSP TPS3/TPS12/TPS6-2進(jìn)行普通PCR；第3輪方法與第2輪類似，以逐步分離目的DNA片段。將3輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用第3輪PCR產(chǎn)物直接測(cè)序或連入pLB載體測(cè)序。利用Clustal Omega對(duì)測(cè)序結(jié)果與已獲得的目的基因 gDNA序列分別比對(duì)，確認(rèn)3’端與其gDNA序列的5’端部分序列是否重疊。對(duì)于AvBPPS，在第1次FPNI-PCR獲得部分啟動(dòng)子序列的基礎(chǔ)上再設(shè)計(jì)3條特異引物GSP TPS3-4～6進(jìn)行第2次FPNI-PCR，將獲得的延長(zhǎng)序列與第1次擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接后，根據(jù)拼接序列5’末端設(shè)計(jì)上游引物TPS3-0F（表2），與GSP TPS3-3配對(duì)，擴(kuò)增完整更長(zhǎng)的片段。

表2 克隆啟動(dòng)子的特異性引物

TPS3對(duì)應(yīng)AvBPPS，TPS6對(duì)應(yīng)AvHUS，TPS12對(duì)應(yīng)AvLIS

TPS3 corresponds to AvBPPS, TPS6 corresponds to AvHUS, TPS12 corresponds to AvLIS

2.4 啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

用Neural Network Promoter Predictio（http:// www. fruitfly.org/seq-tools/promoter.html）預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，以預(yù)測(cè)值0.5為cut-off值進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)；將擴(kuò)增得到的啟動(dòng)子序列提交到啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件預(yù)測(cè)網(wǎng)PlantCARE（http://bioin formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子潛在的順式作用調(diào)控元件。

2.5 AvBPPS、AvPS、AvLIS和AvHUS在陽春砂2個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)量分析

從陽春砂果實(shí)轉(zhuǎn)錄組[10]和MeJA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組[16]中提取AvBPPS、AvPS、AvLIS和AvHUS對(duì)應(yīng)的RPKM（reads per kb per million reads）值表征其表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 gDNA的克隆和分析

PCR分別獲得大于2 kb的AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA片段（圖1），測(cè)序獲得其序列長(zhǎng)度分別為2374、2295、2362 bp，均包含了對(duì)應(yīng)基因完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）（表2）。向GenBank提交了AvBPPS、AvLIS 和 AvHUS的gDNA序列，分別獲得序列號(hào)MG763230、MN829545、MN829547，同時(shí)得到各基因外顯子（E1～7）的分布數(shù)據(jù)（表3）。

M-Marker 1-AvBPPS 2-AvHUS 3-AvLIS

表3 gDNA外顯子分布

對(duì)AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其均包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子（圖2），其中外顯子3（E3）的核苷酸序列最長(zhǎng)。單萜合酶基因AvBPPS（圖2-A）和AvLIS（圖2-B）的結(jié)構(gòu)相似，而倍半萜合酶基因AvHUS（圖2-C）與它們的結(jié)構(gòu)略有不同，其外顯子E1的核苷酸序列比單萜合酶基因的E1序列短，因?yàn)楸栋胼坪厦钢胁淮嬖谫|(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。與植物萜類合酶催化功能密切相關(guān)的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（R，K）X8W、RXR、DDXXD和(N、D)D(L、I、V)X(S、T)XXXE分別位于E1、E4以及E6和E7，其中(N，D)D(L、I、V)X(S、T)XXXE分布在2個(gè)外顯子中（圖2）。

3.2 啟動(dòng)子克隆

用FPNI-PCR法克隆啟動(dòng)子，AvBPPS在引物FP2第3輪PCR結(jié)果中出現(xiàn)特異性目的條帶（圖3-A），測(cè)序結(jié)果表明該片段與gDNA 5’端有264 bp重疊序列，初步確認(rèn)獲得其部分啟動(dòng)子序列。由于獲得的凈啟動(dòng)子片段較短，再次設(shè)計(jì)引物延長(zhǎng)擴(kuò)增后，在FP3第3輪PCR中出現(xiàn)特異性目的條帶（圖3-B）；測(cè)序結(jié)果表明該片段的3’端與前述的啟動(dòng)子序列5’端153 bp的序列一致，初步確認(rèn)獲得AvBPPS啟動(dòng)子的延長(zhǎng)片段。將2次擴(kuò)增獲得的序列進(jìn)行拼接，獲得795 bp的序列，根據(jù)其5’端設(shè)計(jì)上游引物與下游引物GSP TPS3-3配對(duì)（表2），擴(kuò)增獲得約800 bp的長(zhǎng)片段，并克隆到載體中測(cè)序（圖3-C）；測(cè)序結(jié)果表明長(zhǎng)片段與拼接序列的相似度為99%。

AvLIS和AvHUS分別在引物FP3和FP2第3輪PCR結(jié)果中出現(xiàn)特異性目的條帶，測(cè)序結(jié)果表明AvLIS和AvHUS目的片段分別與其gDNA 5’端有156 bp和220 bp的一致序列，初步確認(rèn)獲得了AvHUS和AvLIS的啟動(dòng)子序列（圖4）。

E1～7-外顯子1～7，框中數(shù)字為該外顯子編碼的氨基酸個(gè)數(shù) I1～I(xiàn)6-內(nèi)含子1～6

A-FPIN-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 B-FPIN-PCR延長(zhǎng)擴(kuò)增片段 C-長(zhǎng)片段 M-Marker

1～3-重復(fù)次數(shù)

3.3 啟動(dòng)子的順式作用調(diào)控元件及比較

AvBPPS、AvLIS和AvHUS啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于其起始密碼子ATG上游59、23、389 bp處，截取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列，最終分別獲得470、934、762 bp啟動(dòng)子序列。為了區(qū)分堿基的位置和正負(fù)鏈，從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)左邊第1個(gè)堿基位置設(shè)為“?1”，依此類推。分別分析AvBPPS、AvLIS和AvHUS啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件的類型、數(shù)量及位置。AvBPPS（圖5-A）、AvLIS（圖5-B）和AvHUS（圖5-C）啟動(dòng)子均包含多個(gè)真核生物啟動(dòng)子保守元件，如TATA-box和CAAT-box。AvBPPS啟動(dòng)子中包含GCN4-motif（TGAGTCA）—參與胚乳表達(dá)的順式作用調(diào)控元件，還有G-Box—與光響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件，此外，還含有參與脫落酸反應(yīng)、低溫響應(yīng)、MYB結(jié)合位點(diǎn)等順式作用調(diào)控元件。預(yù)測(cè)得分（matrix score）超過5分的元件見表4。其中，GCN4-motif是本研究最為關(guān)注的順式作用調(diào)控元件。

圖5 AvBPPS (A)、AvLIS (B) 和AvHUS (C) 啟動(dòng)子序列及其順式作用調(diào)控元件

表4 AvBPPS啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的順式作用調(diào)控元件

“＋”鏈以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)左邊第1個(gè)堿基的位置為?1；“*”當(dāng)預(yù)測(cè)的TATA-box數(shù)目超過3個(gè)時(shí)，僅展示得分最高的3個(gè)，下表同

Position of first base at left of transcription initiation site was ?1 in + chain; When number of predicted TATA-boxes exceeded three, only top three with highest matrix score were shown, same as below table

AvLIS和AvHUS啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件大體相似，均含有涉及MeJA反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件CGTCA-motif/TGACG-motif；還含有參與脫落酸反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件AAGAA-motif和ABRE以及參與光響應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件G-box。AvHUS啟動(dòng)子中含有與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)和厭氧誘導(dǎo)所必需的順式調(diào)節(jié)元件；而AvLIS啟動(dòng)子中含有參與低溫響應(yīng)和生長(zhǎng)素反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件，還含有MYB、MYC、I-box、W-box等元件。W-box可以與WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行特異性結(jié)合從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)[17]。啟動(dòng)子元件AvLIS和AvHUS預(yù)測(cè)得分超過5分的見表5、6。

3.4 AvBPPS在種子中特異表達(dá)及其對(duì)應(yīng)萜類產(chǎn)物在種子中富集

課題組前期的研究比較了AvBPPS在陽春砂在多個(gè)組織部位的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AvBPPS表現(xiàn)出種子特異表達(dá)的模式[10]。本實(shí)驗(yàn)利用陽春砂的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[10]，比較4個(gè)萜類合酶基因AvBPPS、AvPS、AvLIS和AvHUS的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诜N子中均有表達(dá)，但AvBPPS在種子中的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)基因的表達(dá)量，表現(xiàn)出在種子中特異表達(dá)的模式（圖6-A）。分析這4個(gè)酶對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物含量，其中AvBPPS的催化主產(chǎn)物BPP是陽春砂主要藥效成分乙酸龍腦酯、龍腦和樟腦的關(guān)鍵前體，AvBPPS在種子中的高表達(dá)與其對(duì)應(yīng)的萜類成分（包括直接產(chǎn)物與間接產(chǎn)物）在種子中的富集模式一致（圖6-B）。AvBPPS在種子中的特異表達(dá)與其啟動(dòng)子含有的參與胚乳表達(dá)的元件GCN4-motif相符，而其余3個(gè)基因的啟動(dòng)子均無GCN4-motif，與它們?cè)诜N子中的低表達(dá)相符。

3.5 MeJA處理后的AvLIS、AvHUS表達(dá)量及其對(duì)應(yīng)萜類產(chǎn)物的分析

已克隆的4個(gè)萜類合酶基因AvBPPS、AvPS、AvLIS和AvHUS啟動(dòng)子中，只有AvLIS和AvHUS含有MeJA調(diào)控的順式作用調(diào)控元件，其中AvLIS有3個(gè)此類元件，而AvHUS有2個(gè)。根據(jù)本課題組之前對(duì)MeJA處理陽春砂的研究數(shù)據(jù)[16]，分析AvLIS和AvHUS在MeJA誘導(dǎo)后其分別在果皮中的表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物含量，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因均在低劑量（200 μmol/L）組表達(dá)量最低，與溶劑對(duì)照組（CK）相比，AvLIS（圖7-A）在高劑量（600 μmol/L）組中表達(dá)量提高且其對(duì)應(yīng)的萜類成分也相應(yīng)提高，表明AvLIS響應(yīng)高濃度的MeJA誘導(dǎo)，與其啟動(dòng)子含有MeJA調(diào)控的順式作用調(diào)控元件相符；而AvHUS（圖7-B）在2個(gè)劑量組中的表達(dá)量均低于溶劑對(duì)照組，其對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物含量也變化不大，AvHUS未表現(xiàn)出對(duì)MeJA的響應(yīng)。

表5 AvLIS啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的順式作用調(diào)控元件

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過FPNI-PCR獲得了陽春砂AvBPPS、AvLIS和AvHUS的啟動(dòng)子，對(duì)其順式作用調(diào)控元件的分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)啟動(dòng)子均包含光響應(yīng)元件G-box，這3個(gè)基因可能受光照的調(diào)控。文獻(xiàn)報(bào)道G-box參與UV-A誘導(dǎo)，擬南芥COX5b-2基因編碼細(xì)胞色素C氧化酶5b亞基，該基因受UV-B誘導(dǎo)表達(dá)，其啟動(dòng)子中有一個(gè)保守的G-box元件，突變此元件會(huì)使該基因喪失對(duì)UV-B誘導(dǎo)的響應(yīng)[18]。增強(qiáng)光照是否會(huì)提高AvBPPS、AvLIS和AvHUS在陽春砂果實(shí)中的表達(dá)，進(jìn)而增加其對(duì)應(yīng)萜類化合物的積累量，有待進(jìn)一步研究。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[16]，MeJA處理陽春砂果實(shí)后，大部分萜類的積累量明顯上升，如芳樟醇、蒎烯等，說明MeJA能有效調(diào)控陽春砂中部分揮發(fā)性萜類成分的代謝[16]。MeJA處理陽春砂比較轉(zhuǎn)錄組顯示，MeJA誘導(dǎo)的代謝路徑和次生代謝物生物合成路徑中注釋到的Unigene更多，說明MeJA誘導(dǎo)促使較多的參與次生代謝的基因被激活[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AvLIS和AvHUS啟動(dòng)子含有涉及MeJA調(diào)控的CGTCA-motif/TGACG-motif元件，AvLIS響應(yīng)MeJA的誘導(dǎo)且其對(duì)應(yīng)萜類產(chǎn)物芳樟醇的含量也相應(yīng)提高，而AvHUS未表現(xiàn)出對(duì)MeJA的響應(yīng)；這2個(gè)基因啟動(dòng)子中涉及MeJA調(diào)控元件的數(shù)目不同，有可能影響了其對(duì)MeJA響應(yīng)的程度。

表6 AvHUS啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的順式作用調(diào)控元件

萜類含量數(shù)據(jù)來源于文獻(xiàn)報(bào)道[10]；B中AvPS對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物為α-蒎烯和β-蒎烯，AvBPPS對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物包括直接產(chǎn)物檸檬烯和月桂烯及間接產(chǎn)物樟腦、龍腦和乙酸龍腦酯，AvHUS對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物包括葎草烯和石竹烯，AvLIS對(duì)應(yīng)的萜類產(chǎn)物為芳樟醇

CK-溶劑對(duì)照組 M1-200 μmol·L?1 MeJA噴施組 M2-600 μmol·L?1 MeJA噴施組

GCN4-motif是胚乳特異性表達(dá)所必需的順式作用調(diào)控元件之一，存在于大多數(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因和一些代謝關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子中[19]。GCN4-motif的功能在水稻中已經(jīng)很明確，該順式作用調(diào)控元件不但指導(dǎo)谷蛋白基因在胚乳中的特異表達(dá)，還對(duì)其啟動(dòng)子的活性具有正調(diào)控作用[20-21]。如在水稻種子貯藏蛋白中各種谷蛋白（glutelin）的編碼基因都含有GCN4基序，當(dāng)其發(fā)生突變時(shí)，大部分啟動(dòng)子活性會(huì)喪失，還會(huì)使谷蛋白基因在葉片中表達(dá)[21]。水稻中的轉(zhuǎn)錄因子OsSMF1與GCN4-motif相互作用，可以調(diào)節(jié)種子貯藏蛋白的合成，是淀粉合成的關(guān)鍵調(diào)控因子[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AvBPPS啟動(dòng)子中含有GCN4-motif，熒光定量PCR和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明AvBPPS在種子中特異表達(dá)，且其相應(yīng)的萜類產(chǎn)物乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦等在種子中富集。砂仁以干燥成熟的果實(shí)入藥，其果實(shí)的結(jié)構(gòu)以種子團(tuán)為主，干燥后果皮的占比更小，因此，種子實(shí)際上是砂仁（包括陽春砂仁）的主要藥用部位。AvBPPS啟動(dòng)子中含有的參與胚乳表達(dá)的順式作用調(diào)控元件GCN4-motif為AvBPPS的種子表達(dá)特異性提供了支撐，也為進(jìn)一步揭示陽春砂乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦等藥效成分在藥用部位種子中富集的機(jī)制提供了重要線索。

本實(shí)驗(yàn)首次從藥用植物陽春砂的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了參與胚乳表達(dá)和MeJA反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件，為深入探究萜類合成關(guān)鍵酶的種子表達(dá)特異性和對(duì)MeJA響應(yīng)的機(jī)制提供了基礎(chǔ)，為萜類代謝的調(diào)控提供了操作元件。后續(xù)將通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證啟動(dòng)子的功能，特別是探究AvBPPS啟動(dòng)子的種子表達(dá)特異性，以期更深入地探討啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)和萜類合成的機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and bioinformatics analysis of promoters of three terpene synthase genes and their terpenoid regulation in

ZHAO Hai-ying1, LI Meng1, LIN Xiao-jing1, ZHAO Yuan-yuan1, LIANG Hui-lin1, YE Ze-ping2, YANG Jin-fen1

1. Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan, Ministry of Education, Joint Laboratory of National Engineering Research Center for Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. College of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

To obtain the promoters of terpenoid synthase genes AvBPPS (bornyl diphosphate synthase), AvLIS (linalool synthase) and AvHUS (humulene synthase) of medicinal plants, and investigate the regulation of-acting regulatory elements involved in terpenoid synthesis.The gDNA of AvBPPS, AvLIS, and AvHUS were cloned from genomic DNA (gDNA) of leaves from, and then specific primers were designed accordingly. The promoters were cloned by FPNI-PCR subsequently and bioinformatics analysis was performed. The relationship between key-acting regulatory elements and terpene regulation was analyzed by combining the transcriptome data and terpenoid contents.The gDNA lengths of AvBPPS, AvLIS and AvHUS were 2374 bp, 2295 bp and 2362 bp, respectively, and all contained complete coding regions of the corresponding genes and seven exons. The promoters of AvBPPS, AvLIS and AvHUS were cloned, respectively. The promoter of AvBPPS contained GCN4-motif, a-acting regulatory element involved in endosperm expression. Combined with the analysis of gene expression, it was speculated that this-acting regulatory element regulated the specific expression of AvBPPS in seeds, and then affected the accumulation of major terpenoids such as borneol and borneol acetate in seeds. Both AvLIS and AvHUS promoters contained-acting regulatory elements involved in methyl jasmonate (MeJA) reaction. Transcriptome and terpene content analysis showed that AvLIS responded to the induction of high-concentration-MeJA, while AvHUS showed no response to MeJA.-acting regulatory elements involved in endosperm expression and MeJA response were discovered from promoters of medicinal plants, which provided a basis for in-depth exploration of seed expression specificity of key enzymes of terpene synthesis and the mechanism of response to MeJA, and provided operating elements for regulation of terpene metabolism.

promoter;Lour.; terpene synthase; terpenoids; methyl jasmonate

R282.12

A

0253 - 2670(2021)04 - 1117 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.025

2020-08-06

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872954）

趙?，摚?993—），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参锎紊x。Tel: 15625132812 E-mail: 965301844@qq.com

楊錦芬（1978—），女，研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参镙祁惢衔锷锖铣膳c調(diào)控。Tel: (020)39358331 E-mail: yangif@gzucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]