張武華，張明龍，景偉偉，謝冰，畢海濤，于峰，叢斌，馬春玲，文迪

河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室 河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 石家莊050017

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）是一種嚴(yán)重威脅公共健康和社會安全的興奮性合成毒品，長期或高劑量使用會導(dǎo)致顯著的神經(jīng)損傷[1-2]。八肽膽囊收縮素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）是一種腦腸肽，可抑制METH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥作用[3-5]。CCK-8 通過與膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）受體結(jié)合發(fā)揮作用，主要包括膽囊收縮素1 受體（cholecystokinin 1 receptor，CCK1R）和CCK2R兩種亞型。同時，CCK-8 與CCK 受體結(jié)合后可激活β-制動蛋白（β-arrestin）偏向性信號途徑，發(fā)揮抗凋亡作用[6-7]。本研究擬探討CCK-8 參與METH 誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的受體機(jī)制以及β-arrestin偏向性信號途徑在其中的作用，從而進(jìn)一步闡明METH 的毒理學(xué)機(jī)制，為METH 濫用相關(guān)案件的法醫(yī)學(xué)鑒識提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞（上海拜力生物科技有限公司），人胚腎細(xì)胞HEK-293［青旗（上海）生物技術(shù)發(fā)展有限公司］。DMEM 培養(yǎng)基、DMEM/F-12 培養(yǎng)基、Opti-MEMTMI 減血清培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。METH 由北京市公安局提供。CCK-8（26-33，德國Merck 公司）。鼠抗Bax、鼠抗Bcl-2、鼠抗caspase-3/p17/p19、鼠抗β-actin（美國Proteintech Group 公司），兔抗CCK-AR（F-6）、兔抗CCK-BR（E-3）（美國Santa Cruz Biotechnology 公司），兔抗β-arrestin 2（C16D9，美國Cell Signaling Technology 公司），兔抗cleaved caspase-3（Asp175，美國Affinity 公司），羊抗鼠二抗（IRDye800CW）、羊抗兔二抗（IRDye700CW）（美國LI-COR 公司），羊抗兔IgG 二抗（DyLight 594 熒光標(biāo)記）、羊抗兔IgG 二抗（DyLight 488 熒光標(biāo)記）（武漢Abbkine Scientific 公司）。FITC Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit Ⅰ（美國BD 公司）。Hoechst 33258 溶液（德國Merck 公司）。聚凝胺（polybrene）助轉(zhuǎn)染試劑［漢恒生物科技（上海）有限公司］，LipofectamineTM2000 CD 轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。慢病毒空載體LVCMV-mCherry-WPRE、LV-CMV-EGFP-WPRE 和 慢病毒過表達(dá)載體LV-CMV-mCherry-CCK1R-Flag-WPRE-pA、LV-CMV-EGFP-CCK2R-HA-WPRE-pA均由武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司合成。

FACSAriaTMⅢ細(xì)胞分選儀（美國BD 公司），Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR 公司），Trans-Blot?TurboTM全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），TCS SP8 CARS 共聚焦顯微鏡、DMI4000B型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司），二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞采用DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，人胚腎細(xì)胞HEK-293 采用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2，待細(xì)胞貼壁面積達(dá)80%～90%時，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)，以1×105個/mL計算傳代比例進(jìn)行傳代。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R 細(xì)胞的構(gòu)建

為了確定CCK-8 抑制METH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的受體機(jī)制，采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h，以5×104～10×104個細(xì)胞/孔的密度接種至24 孔板，使細(xì)胞在病毒轉(zhuǎn)染時的融合度達(dá)50%～60%。設(shè)置轉(zhuǎn)染的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）梯度為12、25、50、100，根據(jù)計算公式［MOI×1 000×接種細(xì)胞數(shù)目/病毒滴度（TU/mL）］計算每孔所需的病毒載體和空載病毒的體積，棄去原培養(yǎng)液，加入含聚凝胺（polybrene）助轉(zhuǎn)染試劑（終質(zhì)量濃度為8 g/mL）的5%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，加入慢病毒孵育，轉(zhuǎn)染16～24 h 后換液，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h（轉(zhuǎn)染后72 h）后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)及表達(dá)率。若細(xì)胞密度達(dá)80%～90%則可進(jìn)行傳代，改用10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，確定最適MOI 后進(jìn)行正式實驗，并采用免疫熒光染色觀察CCK1R 和CCK2R 的表達(dá)情況。

1.4 干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h，將5×103～1×104個/孔SH-SY5Y 細(xì)胞接種于不含抗生素的10% DMEM/F-12 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度為30%～50%，分別使用25 μL Opti-MEMTMⅠ減血清培養(yǎng)基稀釋siRNA 和LipofectamineTM2000 CD 轉(zhuǎn)染試劑配制siRNA 稀釋液和轉(zhuǎn)染復(fù)合物，先對每孔用50 μL 不含抗生素的3%胎牛血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基進(jìn)行換液，再將轉(zhuǎn)染復(fù)合物以50 μL/孔加入每孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻，培養(yǎng)4～6 h 后換為3%胎牛血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基。

1.5 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶染色和流式細(xì)胞術(shù)

采用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin Ⅴ-FITC/PI）染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，取細(xì)胞懸液100 μL經(jīng)過磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗、離心和重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)FITC AnnexinⅤApoptosis Detection Kit Ⅰ說明書要求，加入5 μL FITC 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 和5 μL PI 于細(xì)胞懸液中，室溫避光孵育15 min，加400 μL 1×結(jié)合液至每管中混勻，冰上放置等待檢測。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)報告圖中右上和右下象限的細(xì)胞計數(shù)總和計算細(xì)胞凋亡率。

1.6 Hoechst 33258 染色

將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞接種培養(yǎng)于10% DMEM/F-12培養(yǎng)基中，待貼壁細(xì)胞達(dá)80%時，棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，PBS 重懸細(xì)胞，以離心半徑10 cm，1 000 r/min，離心5 min，制備細(xì)胞懸液涂片，用溶液（V甲醇∶V冰乙酸=3∶1）固定后避光保存，使用Hoechst 33258 溶液處理，雙蒸水洗滌2 次后封片，在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 Western 印跡法

采用Western 印跡法對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 和活化型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）進(jìn)行檢測?；玖鞒蹋毫呀饧?xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、半干轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，一抗［鼠抗β-actin、鼠抗Bax、鼠抗Bcl-2、鼠抗caspase-3/p17/p19、兔抗CCK-AR（F-6）、兔抗CCK-BR（E-3）、兔抗β-arrestin 2（C16D9）、兔抗cleaved caspase-3（Asp175）］孵育，洗膜，二抗［羊抗鼠二抗（IRDye800CW）、羊抗兔二抗（IRDye700CW）］孵育，采用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)顯影和ImageJ 1.0軟件（https://imagej.nih.gov/ij/）進(jìn)行灰度分析。

1.8 實驗流程

1.8.1 METH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型的建立

實驗分為3 組：對照組、1 mmol/L METH組和2 mmol/L METH組。將SH-SY5Y 細(xì)胞以2×105個/mL接種于6 孔板或含圓形玻片的24 孔板，采用無血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞12 h。將200 mmol/L METH 用無血清培養(yǎng)基稀釋至終濃度為1、2 mmol/L，并分別處理SHSY5Y 細(xì)胞24 h。對照組使用空白的無血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。每組設(shè)置3 個復(fù)孔。收集細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y 細(xì)胞的凋亡率。采用4%多聚甲醛溶液固定后，Hoechst 33258 溶液染色，共聚焦顯微鏡下觀察不同濃度METH 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.8.2 METH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

實驗分為5組：0、6、12、18和24 h組。將SH-SY5Y細(xì)胞以2×105個/mL 接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。每組均用2 mmol/L METH 處理，在上述時間點收取細(xì)胞。采用Western 印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3 和caspase-3的表達(dá)變化。

1.8.3 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的作用

實驗分為8 組：對照組、2 mmol/L METH 組、0.01 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組、0.1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組、1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組、0.01 μmol/L CCK-8 組、0.1 μmol/L CCK-8 組、1 μmol/L CCK-8 組。其中，對照組不予METH 和CCK-8 處理。將CCK-8 用無血清培養(yǎng)基稀釋至終濃度為0.01、0.1、1 μmol/L 3 個濃度，細(xì)胞先用不同濃度CCK-8 預(yù)處理（對照組用無血清培養(yǎng)基預(yù)處理）12 h，再給予2 mmol/L METH 作用24 h。應(yīng)用FACSAriaTMⅢ細(xì)胞分選儀和Hoechst 33258 染色檢測SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率。

1.8.4 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的凋亡相關(guān)蛋白的作用

實驗分為5 組：對照組、2 mmol/L METH 組、0.01 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組、0.1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組、1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組。不同濃度CCK-8 預(yù)處理12 h 后再用2 mmol/L METH 作用18 h，采用Western 印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和caspase-3 的表達(dá)變化。

1.8.5 HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率檢測

慢病毒空載體LV-CMV-mCherry-WPRE、LVCMV-EGFP-WPRE分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h 后，于熒光顯微鏡下觀察病毒空載熒光表達(dá)，確定病毒轉(zhuǎn)染和熒光蛋白表達(dá)正常。隨后采用慢病毒過表達(dá)載體LV-CMV-mCherry-CCK1R-HA-WPRE-pA和LV-CMV-EGFP-CCK2R-Flag-WPRE-pA 分別轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，建立HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。免疫熒光染色后采用共聚焦顯微鏡觀察CCK1R 和CCK2R 的表達(dá)情況。

1.8.6 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)HEK293-CCK1R 細(xì)胞和HEK293-CCK2R 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

實驗分組：HEK293-CCK1R 細(xì)胞分為對照組、2 mmol/L METH 組、1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH組和1 μmol/L CCK-8 組；HEK293-CCK2R 細(xì)胞分為對照組、2 mmol/L METH 組、1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組和1 μmol/L CCK-8 組。不同濃度CCK-8預(yù)處理12 h 后再用2 mmol/L METH 作用18 h，采用Western 印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3 和caspase-3的表達(dá)變化。

1.8.7 siRNA 對SH-SY5Y 細(xì)胞中β-arrestin 2 干擾效率的檢測

在進(jìn)行siRNA 干擾實驗前，采用含不同β-arrestin 2 敲減序列的siRNA 對SH-SY5Y 細(xì)胞處理6 h。實驗分為5 組：對照組、siRNA 陰性對照組（未敲減序列）、β-arrestin 2 siRNA-1 組、β-arrestin 2 siRNA-2組和β-arrestin 2 siRNA-3 組。采用熒光顯微鏡觀察siRNA 熒光表達(dá)（FAM 綠色熒光標(biāo)記），Western 印跡法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.8.8 CCK-8對METH 誘導(dǎo)的β-arrestin 2敲減后SHSY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

實驗分為4組：對照組、2 mmol/L METH組、1 μmol/L CCK-8+2 mmol/L METH 組、1 μmol/L CCK-8 組。按照實驗分組提前24 h 接種細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12 h加1 μmol/L CCK-8 預(yù)處理，再用2 mmol/L METH 作用18 h。采用Western 印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3 和caspase-3 的表達(dá)變化。

1.9 統(tǒng)計分析

使用SPSS 21.0 軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行統(tǒng)計，符合正態(tài)分布的計量資料以表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間均數(shù)比較，最小顯著差異法進(jìn)行兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8對METH誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 染色和流式細(xì)胞術(shù)分析METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，1、2 mmol/L METH 處理細(xì)胞24 h 后，右上和右下象限細(xì)胞計數(shù)總和增加（圖1），說明細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05，表1）。Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示，經(jīng)METH 處理后細(xì)胞核呈碎裂、固縮狀態(tài)的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖2）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度METH對SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1 The apoptosis rate of SH-SY5Y cells treated with different concentrations of METH detected by flow cytometry（n=3，%）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度METH對SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1 The apoptosis rate of SH-SY5Y cells treated with different concentrations of METH detected by flow cytometry（n=3，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05。

圖1 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis of SH-SY5Y cells detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI staining and flow cytometry

圖2 Hoechst 33258 染色檢測凋亡細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變Fig.2 Morphological changes of apoptotic nuclei detected by Hoechst 33258 staining

檢測2 mmol/L METH 處理的SH-SY5Y 細(xì)胞不同時間點（0、6、12、18、24 h）凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化（圖3，表2），結(jié)果顯示，與0 h 組相比，12 h、18 h 和24 h組的Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均增加（P＜0.05），但Bcl-2 蛋白表達(dá)無明顯變化；18 h 和24 h 組的Bax/Bcl-2 值升高（P＜0.05）。

表2 METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化Tab.2 Expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cells（n=3，）

表2 METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化Tab.2 Expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cells（n=3，）

注：1）與0 h 組比較，P＜0.05。

圖3 Western 印跡法檢測METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cells detected by Western blotting

給予SH-SY5Y 細(xì)胞0.1 μmol/L和1 μmol/L CCK-8預(yù)處理后，與METH組相比，0.1 μmol/L CCK-8+METH 組 和1 μmol/L CCK-8+METH組的右上和右下象限細(xì)胞計數(shù)總和顯著降低（圖4），說明細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05，表3）。Hoechst 33258 染色結(jié)果亦顯示，CCK-8 預(yù)處理后發(fā)生核碎裂、固縮的細(xì)胞數(shù)量減少（圖5）。

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度CCK-8 對METH誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響Tab.3 Effects of CCK-8 on the apoptosis rate induced by METH in SH-SY5Y cells detected by flow cytometry（n=3，，%）

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度CCK-8 對METH誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響Tab.3 Effects of CCK-8 on the apoptosis rate induced by METH in SH-SY5Y cells detected by flow cytometry（n=3，，%）

注：1）與METH 組比較，P＜0.05。

圖4 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of SH-SY5Y cells detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI staining and flow cytometry

圖5 Hoechst 33258 染色檢測凋亡細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化Fig.5 Morphological changes of apoptotic nuclei detected by Hoechst 33258 staining

Western 印跡法結(jié)果顯示，與METH 組相比，0.1 μmol/L CCK-8+METH 組 和1 μmol/L CCK-8+METH 組的Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），0.01 μmol/L CCK-8+METH 組、0.1 μmol/L CCK-8+METH 組 和1 μmol/L CCK-8 組的cleaved caspase-3 蛋白和Bax/Bcl-2 值降低（P＜0.05），1 μmol/L CCK-8+METH 組的Bcl-2 表達(dá)則明顯增加（P＜0.05，表4，圖6）。

圖6 Western 印跡法檢測CCK-8 對METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosisrelated proteins induced by METH in SH-SY5Y cells detected by Western blotting

表4 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.4 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cells（n=3，）

表4 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.4 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in SH-SY5Y cells（n=3，）

注：1）與METH 組比較，P＜0.05。

2.2 CCK-8通過CCK2R抑制METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

慢病毒空載體LV-CMV-mCherry-WPRE、LVCMV-EGFP-WPRE 分別轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞24 h 后，可見細(xì)胞有紅色（mCherry）或綠色（EGFP）熒光表達(dá)（圖7）。穩(wěn)定傳代后進(jìn)行CCK1R 和CCK2R 的免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下可見CCK1R 和CCK2R 表達(dá)于細(xì)胞膜上（圖8），通過對多個視野下細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，表達(dá)熒光的陽性細(xì)胞比例約為80%，提示CCK1R和CCK2R 均成功表達(dá)于HEK293 細(xì)胞，可以進(jìn)行后續(xù)受體機(jī)制的研究。

圖7 明場和熒光下慢病毒空載體轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞的形態(tài)（×200）Fig.7 Morphology of HEK293 cells transfected with lentivirus vectors under phase and fluorescence（×200）

圖8 慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞的激光共聚焦成像Fig.8 The confocal images of lentivirus-transfected HEK293 cells

CCK-8 對METH誘導(dǎo)HEK293-CCK1R細(xì)胞或HEK293-CCK2R 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)作用的實驗結(jié)果（圖9、表5）顯示：在HEK293-CCK1R 細(xì)胞中，CCK-8+METH 組與METH 組相比，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá)差異以及Bax/Bcl-2值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而在HEK293-CCK2R細(xì)胞中，CCK-8+METH 組與METH 組相比，凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)和Bax/Bcl-2 值均下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.5 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R （n=3，）

表5 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.5 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R （n=3，）

注：1）與METH 組比較，P＜0.05。

圖9 Western 印跡法檢測CCK-8 對METH 誘導(dǎo)HEK293-CCK1R 和HEK293-CCK2R 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.9 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in HEK293-CCK1R and HEK293-CCK2R detected by Western blotting

2.3 β-arrestin 2 介導(dǎo)CCK-8 對METH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用

首先對siRNA 轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測，F(xiàn)AM 綠色熒光標(biāo)記的siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到SH-SY5Y 細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（圖10）。通過Western 印跡法檢測siRNA 的干擾效率（圖11），與陰性對照組相比，β-arrestin 2 siRNA-2和β-arrestin 2 siRNA-3 組的β-arrestin 2 表達(dá)明顯降低，其中β-arrestin 2 siRNA-3 的敲減效率最高（表6，P＜0.05），故后續(xù)實驗采用β-arrestin 2 siRNA-3作為干擾序列。

表6 siRNA干擾對SH-SY5Y細(xì)胞β-arrestin 2 表達(dá)的影響Tab.6 Effects of siRNA on the expression of β-arrestin 2 in SH-SY5Y cells（n=3，）

表6 siRNA干擾對SH-SY5Y細(xì)胞β-arrestin 2 表達(dá)的影響Tab.6 Effects of siRNA on the expression of β-arrestin 2 in SH-SY5Y cells（n=3，）

注：1）與陰性對照組比較，P＜0.05；2）與β-arrestin 2 siRNA-2比較，P＜0.05。

圖10 明場和熒光下siRNA 轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)（×200）Fig.10 Morphology of SH-SY5Y cells transfected with siRNA under phase and fluorescence（×200）

圖11 Western 印跡法檢測不同siRNA 序列轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y 細(xì)胞β-arrestin 2 的表達(dá)Fig.11 Expression of β-arrestin 2 in SH-SY5Y cells transfected with different siRNA sequences detected by Western blotting

采用Western 印跡法檢測β-arrestin 2 siRNA 敲減SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果（圖12、表7）顯示，與對照組相比，METH 組和CCK-8+METH組凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-3 的 表達(dá)和Bax/Bcl-2 值均顯著增加（P＜0.05），而Bcl-2 表達(dá)與其他組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與METH組相比，CCK-8+METH 組凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2的表達(dá)和Bax/Bcl-2值均無顯著變化，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖12 Western 印跡法檢測CCK-8 對METH誘導(dǎo)β-arrestin 2 敲減SH-SY5Y細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.12 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in β-arrestin 2 knockdown SH-SY5Y detected by Western blotting

表7 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)β-arrestin 2 敲減SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.7 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in β-arrestin 2 knockdown SH-SY5Y （n=3，）

表7 CCK-8 對METH 誘導(dǎo)β-arrestin 2 敲減SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.7 Effects of CCK-8 on the expression of apoptosis-related proteins induced by METH in β-arrestin 2 knockdown SH-SY5Y （n=3，）

注：1）與對照組比較，P＜0.05。

3 討論

METH 是目前濫用最為嚴(yán)重的合成毒品，長期濫用可導(dǎo)致一系列的神經(jīng)精神癥狀。深入研究METH的機(jī)體損傷機(jī)制，對METH 濫用相關(guān)案件的法醫(yī)學(xué)鑒識具有重要意義。目前，對METH 濫用引起的神經(jīng)損傷已有大量治療藥物的探索性研究[8]，但開發(fā)沒有成癮性且副作用小的治療藥物尤為重要。CCK-8 是CCK 典型的活性形式，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高的神經(jīng)肽，其在毒品領(lǐng)域的應(yīng)用研究始于阿片類藥物的防治，其“抗阿片”作用已有廣泛研究[3]。WEN 等[6，9]研究發(fā)現(xiàn)，CCK-8 具有抗感染、抗METH 引起的氧化應(yīng)激損傷等功能，也明顯抑制重復(fù)METH 暴露引起的行為改變，如活動性增加、行為敏化、刻板效應(yīng)以及多巴胺能神經(jīng)元毒性等。本研究選取SH-SY5Y 細(xì)胞作為研究對象，該細(xì)胞系具有神經(jīng)元的一般特性，是研究神經(jīng)元凋亡常用的細(xì)胞模型[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCK-8可顯著抑制METH 引起的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡，提示CCK-8 可能通過抗凋亡途徑抑制METH 的神經(jīng)毒性。進(jìn)一步使用CCK-8 和METH 先后處理SH-SY5Y 細(xì)胞，利用Hoechst 33258 染色觀察SH-SY5Y 細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與METH 單獨處理組相比，CCK-8 預(yù)處理組呈致密濃染細(xì)胞核形態(tài)的比例有所減少，這在形態(tài)學(xué)上亦支持了CCK-8 的抗凋亡作用。

線粒體凋亡通路中，Bax和Bcl-2是主要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白[11]，caspase-3 被稱為凋亡執(zhí)行蛋白，當(dāng)有凋亡信號刺激時，caspase 酶家族成員被激活，將caspase-3裂解成活性形式cleaved caspase-3，而后者參與激活核酸內(nèi)切酶，使基因鏈斷裂從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]，檢測Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)并計算Bax/Bcl-2值，能反映細(xì)胞凋亡的真實情況。研究[13]表明，METH能誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞促凋亡蛋白Bax 和cleaved caspase-3 上調(diào)，同時抗凋亡蛋白Bcl-2 下調(diào)。本研究中，METH 可顯著增加SH-SY5Y 細(xì)胞Bax 和cleaved caspase-3 蛋白的表達(dá)和Bax/Bcl-2 值，同時降低Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，表明在本實驗條件下2 mmol/L METH可誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生凋亡。CCK-8 已被證實能通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路的蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡[14-16]。因此，在METH 給藥前先給予CCK-8 預(yù)處理12 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與METH 單獨處理組相比，CCK-8 預(yù)處理可顯著抑制METH 誘導(dǎo)的上述凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果在分子水平進(jìn)一步表明了CCK-8 對METH 誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡具有抑制作用。

CCK-8 可通過與靶細(xì)胞膜表面CCK1R 與CCK2R特異性結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。CCK2R 屬于高敏感性受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，主要分布在大腦皮層、伏隔核、尾狀核、海馬、杏仁核、黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)等腦區(qū)[17]，而CCK1R 屬于低敏感性受體，主要分布在胰腺、膽囊、腸道等外周器官，但其在下丘腦、海馬、迷走神經(jīng)背核和腦干也有分布[18]。為了探討CCK-8抑制METH 誘導(dǎo)神經(jīng)損傷作用的受體機(jī)制，本研究選取了HEK293 細(xì)胞，該細(xì)胞系極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的受體，且轉(zhuǎn)染效率較高，通過慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，建立穩(wěn)定的HEK293-CCK1R細(xì)胞系和HEK293-CCK2R 細(xì)胞系，以模擬神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的CCK1R和CCK2R。本研究結(jié)果顯示，HEK293-CCK1R 細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中均未觀察到CCK-8對METH 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用，但是CCK-8 卻顯著抑制了METH誘導(dǎo)的HEK293-CCK2R細(xì)胞凋亡。GOU 等[19]采 用CCK-8預(yù)處理HEK293-CCK2R細(xì)胞同樣逆轉(zhuǎn)了METH誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，但在HEK293-CCK1R 細(xì)胞中無明顯作用。因此，CCK-8 是通過CCK2R 發(fā)揮抑制METH 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，CCK 受體激活后一般與磷脂酶C 結(jié)合，啟動三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯（diacylglycerol，DG）信號，并促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活性升高，而PKC 及Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶可使細(xì)胞內(nèi)多種底物蛋白質(zhì)磷酸化，并最終產(chǎn)生生理效應(yīng)[20]。然而，相關(guān)研究結(jié)果[7，21]顯示，CCK受體下游除了與G蛋白耦聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）結(jié)合，也可能與β-制動蛋白（β-arrestin 1 或β-arrestin 2）結(jié)合發(fā)揮偏向激動作用。β-arrestin 2 在神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，可負(fù)向調(diào)節(jié)多種GPCR 的功能，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，其可能促進(jìn)凋亡[22]，也可能抑制凋亡[23]。本研究采用siRNA 敲減SH-SY5Y 細(xì)胞中的β-arrestin 2 表達(dá)后，阻斷了CCK-8 預(yù)處理對METH誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用，說明CCK-8通過與CCK2R結(jié)合并激活β-arrestin 2 信號途徑發(fā)揮其抗凋亡作用。但是，CCK2R 與β-arrestin 2 之間存在何種相互作用，在CCK-8 和METH 處理后該作用會發(fā)生何種變化，還有待在后續(xù)研究中進(jìn)行深入探索。

綜上所述，本研究在細(xì)胞水平和分子水平證明了CCK-8 對METH 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，且CCK-8 可能是與CCK2R 特異性結(jié)合并通過β-arrestin 2 途徑抑制METH 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，揭示了CCK-8抑制METH 誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的信號機(jī)制，為合成毒品的毒理機(jī)制研究和METH 濫用相關(guān)案件的法醫(yī)學(xué)鑒識提供了新思路。