王濤，伍賽群，譚曉輝，陳傳香，岳霞，王慧君，杜思昊，喬東訪

1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.廣東省公安廳刑事偵查局刑事技術(shù)中心，廣東 廣州510050

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）作為一種合成毒品，近年來在全球多個國家和地區(qū)的濫用情況愈發(fā)嚴(yán)重。METH出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，90年代進(jìn)入我國，被認(rèn)為是新型毒品的代表[1-3]。METH 制備工藝較為簡單，可抽吸、鼻吸、口服或注射，大量用藥后吸食者會出現(xiàn)精神興奮、性欲增強(qiáng)，容易出現(xiàn)激動、狂躁和暴力行為。長期吸食METH 可產(chǎn)生強(qiáng)烈的依賴感，并造成嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[4-5]。通過對吸食METH致死者進(jìn)行尸體檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，METH 可導(dǎo)致大腦多腦區(qū)出現(xiàn)損傷，造成神經(jīng)元變性、壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞聚集，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)[6]。

長期以來，研究者們都較為關(guān)注METH 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷機(jī)制，METH 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要毒性作用為損傷多巴胺能神經(jīng)元，而神經(jīng)元的凋亡、自噬和氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成其損傷的重要機(jī)制[6-8]。凋亡是細(xì)胞有序死亡的過程，研究[7-8]表明，METH 可引起多種類型細(xì)胞發(fā)生凋亡。本課題組前期研究[9-10]也揭示了METH 在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。有研究[11]還發(fā)現(xiàn)，METH 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡和自噬的發(fā)生，其中Nupr1、caspase-11、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5（insulin-like growth factor binding protein 5，IGFBP5）等分子發(fā)揮了重要作用。

本課題組前期建立了METH 染毒C57 小鼠模型及體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)METH 也可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的促炎因子表達(dá)上調(diào)及一系列炎癥通路的激活[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)METH 處理后，原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的表達(dá)上調(diào)[6，12]，還發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2（lipocalin 2，LCN2）在介導(dǎo)神經(jīng)炎癥中的重要作用[13]。METH 還可導(dǎo)致體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，中腦和紋狀體腦區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)胞體增大、突起增多等變化[6，12]。前期研究[9-10]通過METH 體內(nèi)外給藥證明了METH 對星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及炎癥通路激活的機(jī)制，然而上述研究都基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或在動物的整體水平進(jìn)行探討，僅關(guān)注于星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)方面，無法闡明體內(nèi)環(huán)境下星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的改變，亦難以說明細(xì)胞狀態(tài)的變化。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵支撐細(xì)胞，對調(diào)控METH 神經(jīng)毒性的具體作用仍有待進(jìn)一步闡明。

本研究擬建立大鼠METH 亞急性中毒模型，探究METH 在轉(zhuǎn)錄水平對星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，以期為METH 的神經(jīng)毒性研究提供更多思路，為METH 吸毒死亡的鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

METH（純度≥90%，中國藥品生物制品檢定所），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS；美國Thermo Fisher Scientific 公司），RIPA 裂解液（10×，德國Merck 公司），磷酸酶抑制劑（美國Sigma 公司），RNAiso Plus（總RNA 提取試劑，日本TaKaRa 公司），Anti-GLAST（ACSA-1）MicroBead 試劑盒（德國Miltenyi Biotec 公司）。

NanoDrop 2000c 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司），2100 生物分析儀（美國Agilent公司），NovaSeq 6000 測序系統(tǒng)（美國Illumina 公司）。

1.2 動物實(shí)驗(yàn)與樣品收集

健康成年雄性SD 大鼠6 只，6～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物實(shí)驗(yàn)操作程序遵循美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南。本研究嚴(yán)格遵守南方醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會的規(guī)范進(jìn)行。

METH 染毒實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于恒溫（22 ℃）、12 h光/暗循環(huán)的房間1 周，使大鼠適應(yīng)環(huán)境條件。隨機(jī)將大鼠分為2 組（每組3 只），分別為METH 亞急性中毒組（簡稱METH 組）和生理鹽水對照組（簡稱對照組）。其中METH 組依據(jù)文獻(xiàn)[12-13]給大鼠每12 h 腹腔注射（15 mg/kg）METH 1 次，共注射8 次；對照組大鼠在相同時間腹腔注射1 mL 生理鹽水。兩組均于最后1 次注射后24 h 將大鼠頸椎脫臼處死，迅速分離大腦，在預(yù)冷的玻璃板上分離紋狀體腦區(qū)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞磁珠分選采用Anti-GLAST Micro-Bead 試劑盒。參照試劑盒說明書進(jìn)行抗體孵育及磁珠分選。分選過程中注意保持低溫，將分選出的陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞放入新的離心管中。分選出的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度均大于95%，可用于后續(xù)RNA 提取與分析。

1.3 mRNA 提取及質(zhì)量控制

提取出的星形膠質(zhì)細(xì)胞每管加入500 μL RNAiso Plus，充分裂解后加入200 μL三氯甲烷，4 ℃下12 000×g離心10 min，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的RNase-free 離心管中，加入等體積異丙醇，4 ℃下12 000×g離心10 min，棄去上清液。加入1 mL 75%乙醇溶液重懸沉淀，再次4 ℃下12 000×g離心10 min，棄去上清液，室溫干燥10 min 后，加入20 μL 無RNA 酶ddH2O，充分溶解RNA。利用NanoDrop 2000c 分光光度計檢測RNA 濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，2100 生物分析儀測定RNA 完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）。單次建庫要求RNA 總量≥1 μg、質(zhì)量濃度≥35 ng/μL、D260/D280≥1.8、D260/D230≥1.0[14]。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及生物信息學(xué)分析

對RNA 定量后，確定文庫構(gòu)建所加入的總RNA量，建庫后進(jìn)行橋式擴(kuò)增。采用NovaSeq 6000 測序系統(tǒng)完成mRNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制（簡稱“質(zhì)控”），其中錯誤率（%）表示質(zhì)控數(shù)據(jù)對應(yīng)的測序堿基的平均錯誤率，應(yīng)在0.1%以下；Q20（%）、Q30（%）代表對質(zhì)控后測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估，Q20、Q30 分別指測序質(zhì)量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比，Q20 應(yīng)在85%以上，Q30 應(yīng)在80%以上[14]。本次測序Q20 全部大于98%，Q30 全部大于94%，說明本次測序樣本質(zhì)控較好。收集產(chǎn)出的數(shù)據(jù)后，依次進(jìn)行數(shù)據(jù)去雜、轉(zhuǎn)錄組拼接、SNP 分析、基因功能注釋、基因表達(dá)差異分析、差異基因表達(dá)模式聚類、差異表達(dá)基因富集分析。

1.4.1 樣本相關(guān)性分析

按照基因表達(dá)的差異倍數(shù)＞1 且P＜0.05、q＜0.05的原則篩選差異表達(dá)基因[14]，基于表達(dá)矩陣進(jìn)行樣本相關(guān)性分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）[14]。樣本相關(guān)性分析有助于理解樣本間的相關(guān)性，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計的合理性。而PCA 有助于降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，深入挖掘樣本之間的關(guān)系和變異。樣本通過降維分析后，在主成分上有相對坐標(biāo)點(diǎn)，各個樣本點(diǎn)的距離代表了樣本的距離。

1.4.2 表達(dá)量差異分析

獲得基因的reads 數(shù)后，使用R 軟件中的DESeq2軟件包進(jìn)行組間差異表達(dá)基因分析，獲得兩組間具有差異表達(dá)的基因。表達(dá)量差異分析的篩選閾值為|log2FC|≥1及P＜0.05，其中FC為差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）。對差異表達(dá)基因制作火山圖。

1.4.3 差異表達(dá)基因GO 分析和KEGG 通路富集分析

對篩選得到的差異表達(dá)基因利用基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫（http://geneontology.org/）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；https://www.kegg.jp/）進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析。對METH 組和對照組上調(diào)及下調(diào)基因進(jìn)行GO 分析，鑒于差異表達(dá)基因數(shù)目較多，本研究從細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生物學(xué)過程及分子功能3 個類別中選取富集最顯著的20 個GO 分析條目繪制柱狀圖。

1.4.4 挖掘部分通路的差異表達(dá)基因

通過GO 分析和KEGG 通路富集分析，對差異表達(dá)的通路進(jìn)行篩選，通過分析原始數(shù)據(jù)，挖掘通路中的差異表達(dá)基因。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 21.0 軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物中毒后表現(xiàn)

對照組大鼠實(shí)驗(yàn)期間狀態(tài)良好。METH 組大鼠出現(xiàn)搖頭、易激惹、自發(fā)轉(zhuǎn)圈等刻板運(yùn)動，行為異常持續(xù)至末次注射METH 后4 h，隨后出現(xiàn)倦怠、活動減少等表現(xiàn)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)質(zhì)控結(jié)果

表1 展示了每個樣本的序列數(shù)目和質(zhì)控后的數(shù)據(jù)，本次測序的錯誤率均小于0.025%。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.1 Sequencing data statistics

2.3 樣本間關(guān)系分析

測序相關(guān)性分析結(jié)果顯示，對照組及METH 組中的樣本相關(guān)性較好（圖1）。PCA 分析表明兩組內(nèi)樣本間相似性較高（圖2），對照組和METH 組樣本的組間差異大。

圖1 相關(guān)性分析結(jié)果Fig.1 Results of correlation analysis

圖2 PCA 結(jié)果Fig.2 Results of PCA

2.4 表達(dá)量差異分析

通過表達(dá)量差異分析，共篩選出876 個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因321 個，下調(diào)基因555 個（圖3）。

圖3 差異表達(dá)基因火山圖Fig.3 Volcano map of differential expressed gene

2.5 差異表達(dá)基因GO 分析

對METH 組和對照組的上調(diào)及下調(diào)基因進(jìn)行GO分析。由圖4可見，生物學(xué)過程富集的基因變化最強(qiáng)，其次是細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最后是分子功能。在生物學(xué)過程類別中，主要變化的有細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、發(fā)育過程、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞組分或合成、細(xì)胞定位、多細(xì)胞組織學(xué)過程、生物黏附功能；在細(xì)胞結(jié)構(gòu)類別中，主要變化的是細(xì)胞組分、細(xì)胞器、生物膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)部分、蛋白復(fù)合物及細(xì)胞連接；在分子功能中，主要變化的是錨定結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)。

圖4 差異表達(dá)基因GO 分析結(jié)果Fig.4 GO analysis result of differentially expressed genes

2.6 差異表達(dá)基因KEGG 通路富集分析

對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，以變化最顯著的20 個通路繪制散點(diǎn)圖（圖5）。其中涉及的信號通路包括類固醇生物合成、脂肪酸生物合成、萜類骨架生物合成、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）信號通路、單磷酸腺苷依賴性蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信號通路、酮體的合成與降解、不飽和脂肪酸的生物合成等。

圖5 KEGG 通路富集分析結(jié)果Fig.5 Enrichment analysis result of KEGG pathway

2.7 部分差異表達(dá)基因的挖掘分析

對萜類骨架生物合成、PPAR 信號通路等通路過程的差異表達(dá)基因進(jìn)一步挖掘，其中表達(dá)呈顯著下調(diào)的基因有Acsbg1、Cpt1a，而顯著上調(diào)的基因有Gdf15、Scd、Scd2、Acsl家族及Fabp家族（P＜0.05，表2）。

表2 表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因的相對表達(dá)量Tab.2 Relative expressions of up-regulated and down-regulated genes

3 討論

長期以來，國內(nèi)外METH 神經(jīng)毒性研究者主要關(guān)注神經(jīng)元的損傷及變化，忽視了星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)整體微環(huán)境中的作用?；诖耍狙芯刻接懥薓ETH 染毒大鼠紋狀體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的mRNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化。通過對大鼠進(jìn)行METH亞急性處理，聯(lián)合生理鹽水處理的對照組，用免疫磁珠分選得到紋狀體腦區(qū)內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，對純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行mRNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選出876 個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因有321 個，下調(diào)基因有555 個。通過PCA 及樣本相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)對照組和METH 組樣本的組間差異大，同時兩組內(nèi)樣本間相似性較高。

GO 分析是基于GO 數(shù)據(jù)庫，把基因的功能分成細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子功能和生物學(xué)過程3 個部分。本研究利用GO 數(shù)據(jù)庫，得到了目標(biāo)基因在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子功能和生物學(xué)過程3 個層面上主要關(guān)聯(lián)的生物學(xué)功能。GO 分析結(jié)果顯示，生物學(xué)過程富集的基因變化最強(qiáng)，其次是細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最后是分子功能。在生物學(xué)過程類別中，主要變化的有細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、發(fā)育過程、應(yīng)激反應(yīng)等；在細(xì)胞結(jié)構(gòu)類別中，主要變化的是細(xì)胞組分、細(xì)胞器、生物膜結(jié)構(gòu)等；在分子功能類別中，主要變化的是錨定結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)。上述結(jié)果表明，METH 對大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)在細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)過程、細(xì)胞外及細(xì)胞器的功能等方面。

KEGG 數(shù)據(jù)庫是通路相關(guān)數(shù)據(jù)庫的一種，是了解高級功能和生物系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫資源。本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，涉及的信號通路包括類固醇、脂肪酸、萜類骨架的生物合成，PPAR、AMPK 信號通路，酮體、不飽和脂肪酸的生物合成等。KEGG 和GO分析都提示METH 處理會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常（如萜類骨架生物合成），類固醇、PPAR 信號通路的富集也與細(xì)胞代謝、生物過程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等相關(guān)，表明METH 可能通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

萜類骨架生物合成、PPAR 信號通路等通路過程的差異表達(dá)基因挖掘結(jié)果顯示，表達(dá)呈顯著上調(diào)的基因有Scd、Scd2、Acsl家族及Fabp家族，而顯著下調(diào)的基因有Acsbg1、Cpt1a。這些分子不僅與細(xì)胞過程、細(xì)胞組分高度相關(guān)，也是脂肪酸代謝、降解和生物學(xué)合成的重要組成部分。萜類骨架生物合成、PPAR 信號通路也可能是METH 對星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的重要機(jī)制之一。此外，還發(fā)現(xiàn)Gdf15顯著上調(diào)，Gdf15在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用中發(fā)揮重要作用。有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，Gdf15可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)CXC趨化因子配體3（CXC chemokine ligand 3，CXCL3）、IL-8 等細(xì)胞因子的顯著上調(diào)，Gdf15促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞重構(gòu)及血腦屏障的緊密連接增強(qiáng)，小鼠海馬興奮性損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞Gdf15的表達(dá)顯著增加。說明Gdf15在METH 誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)毒性中也可能具有重要作用。

本課題組前期對METH 神經(jīng)毒性作用中星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能進(jìn)行了深入研究[11-12]，星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有多種功能，在支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)和保護(hù)神經(jīng)元等方面發(fā)揮了重要的作用。生理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞具有支持和隔離神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、攝取和滅活神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)節(jié)離子濃度、傳遞第二信使、營養(yǎng)修復(fù)、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞再生、抗氧化以及參與學(xué)習(xí)記憶等功能。病理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，對各種損害因素產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)，其活化具有瀑布效應(yīng)，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)組織發(fā)揮著保護(hù)和毒性損傷的“雙刃劍”效應(yīng)[17]。前期研究[18]結(jié)果表明，METH 染毒的小鼠紋狀體腦區(qū)出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大、突起增多等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。紋狀體包括背側(cè)紋狀體及腹側(cè)紋狀體：背側(cè)紋狀體是大腦中被認(rèn)為在決策、動機(jī)和獎賞方面起重要作用的部分，由豆?fàn)詈撕臀矤詈藘蓚€亞區(qū)組成；腹側(cè)紋狀體由伏隔核和嗅結(jié)節(jié)構(gòu)成，參與運(yùn)動和情緒反應(yīng)，尤其是與快樂和行為動機(jī)有關(guān)。本研究提取了整個紋狀體腦區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)一系列與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能有關(guān)的通路變化，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與METH 對紋狀體的毒性作用。未來還可分別對腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體的功能行進(jìn)一步探討，以說明星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同腦區(qū)中的作用機(jī)制。

本研究對METH 染毒大鼠紋狀體中的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，共篩選出差異表達(dá)基因876 個，其中上調(diào)基因321 個，下調(diào)基因555 個。從體內(nèi)直接分選出星形膠質(zhì)細(xì)胞相較于體外培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)研究，有助于闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞在METH 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用及機(jī)制，排除了體外實(shí)驗(yàn)多因素的干擾，更貼近腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。通過對差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析，富集出多條信號通路，部分闡明了METH 對星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的影響及分子機(jī)制。差異表達(dá)基因還提示了PPAR 信號通路相關(guān)分子、Gdf15等的可能作用機(jī)制，這有待后續(xù)深入研究。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析METH 對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及機(jī)制，可為METH 相關(guān)死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定提供新的思路。