張倫敏，張 翔

(遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

人腺病毒(Human adenovirus，HADV)肺炎由腺病毒(ADV)感染所致,其臨床特點(diǎn)起病急、高熱持續(xù)時間長、中毒癥狀重[1].好發(fā)于6個月至5歲兒童，是較為嚴(yán)重的兒童社區(qū)獲得性肺炎[2]，臨床上大約有1/3 的腺病毒肺炎因各種原因轉(zhuǎn)變?yōu)橹匕Y腺病毒肺炎[3]。重癥肺炎是小兒危重癥疾病之一，通常進(jìn)展快，全身中毒癥狀重[4]。目前發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但認(rèn)為與病毒血清型、滴度以及宿主的免疫應(yīng)答能力相關(guān)[5]，輔助性T細(xì)胞17(Th17)是一類主要分泌IL-17 A、IL-17F、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子Th 細(xì)胞亞群，并通過這些細(xì)胞因子在機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，是最早參與抗感染免疫應(yīng)答的效應(yīng)性T細(xì)胞，同時在介導(dǎo)慢性炎癥、自身免疫病和腫瘤發(fā)病中也具有重要作用，孤獨(dú)核受體γt(Orphan nuclear receptor gammat，RORγt)是調(diào)控Th17細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，很大程度上決定著Th17細(xì)胞的分化、發(fā)育，無論是體內(nèi)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還是體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化都需要RORγt的參與。其表達(dá)水平的高低可以直接反映Th17細(xì)胞功能狀態(tài)。本研究擬檢測兒童腺病毒肺炎外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)水平，探討兒童腺病毒肺炎的免疫發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組全部來源于本院兒科住院患兒30例，其中男性患兒17例，女性患兒13例；年齡3個月至12歲，平均(5.2±2.0)歲。對照組30例為健康體檢兒童，其中男性兒童18例，女性兒童12例，年齡1～11歲，平均(6.2±3.1)歲。病例組與對照組在年齡、性別構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《兒童腺病毒肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]；(2)病原學(xué)檢測為腺病毒；(3)治療前個1月未使用影響免疫系統(tǒng)功能類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他自身免疫系統(tǒng)疾??；(2)合并有嚴(yán)重肝、心、腎疾病及惡性腫瘤疾病。

1.2 試劑和儀器 Trizol(Invitrogen公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍脊?，PCR儀器(Eppendorf公司)，核酸蛋白微量分析儀(Thermo公司)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒、Real-TimePCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，DNA Marker( TaKaRa公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，β-actin、RORγt引物均由寶生物工程(大連)工程有限公司合成(見表1)。

表1 檢測基因與對應(yīng)的引物序列

1.3 方法 抽取空腹患兒及正常健康兒童外周血3 ml，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取外周血單個核細(xì)胞總RNA，取總RNA樣品2 μl放于核酸微量分析儀下測其RNA的濃度及OD260/OD280值(以DEPC水調(diào)零)進(jìn)行純度鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15 min；85℃ 5 s。Real-time PCR 反應(yīng)條件：變性(95℃，3 min)；退火(95℃，5 s)；延伸(60℃，30 s)；循環(huán)(40 cycles)。各樣本相對表達(dá)量采用國際通用的相對定量法(2-ΔΔCT法)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以Ct值為統(tǒng)計參數(shù)依次計算下列數(shù)據(jù)：△△Ct=(Ct目的-Ct內(nèi)參)病例組-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對照組，目的基因相對于某基因的表達(dá)量=2-ΔΔCT。

2 結(jié)果

RORγt mRNA部分標(biāo)本QRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳(見圖1)。β-actin、RORγt基因的Real time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一，熔解曲線未見雜峰，均為單一峰，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)期明顯，排除了非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，擴(kuò)增產(chǎn)物較好(見圖2～5)。

病例組外周血PBMCs中RORγt mRNA的表達(dá)水平為(5.30±3.95)，對照組為(1.11±0.50)，病例組明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.75，P<0.001)。

3 討論

腺病毒屬于DNA病毒，分為A、B、C、D、E、F、G 7個亞群，90個血清型[6],主要在細(xì)胞核內(nèi)繁殖，耐溫、耐酸、耐脂溶劑的能力較強(qiáng)。HADV-3、HADV-7型腺病毒在我國最常見，其中HADV-7型最容易發(fā)生重癥肺炎和死亡，目前該發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但認(rèn)為與病毒血清型、滴度以及宿主的免疫應(yīng)答能力相關(guān)[7]。已有研究證實(shí)CD4+T細(xì)胞能識別腺病毒衣殼蛋白[8],具有免疫應(yīng)答正性調(diào)節(jié)功能，其中Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，IFN-α、IL-2等細(xì)胞因子增強(qiáng)抗感染能力，Th2細(xì)胞主要分泌IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子輔助B細(xì)胞活化參與機(jī)體體液免疫。兩者之間相互抑制增殖，由此說明Th1與Th2細(xì)胞比例的失衡可能參與到病毒感染的發(fā)生[9]，隨著分子免疫學(xué)研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)Th1/Th2平衡失調(diào)并不能完全闡明腺病毒肺炎的發(fā)病機(jī)制。

Th17 細(xì)胞是一類不同于Th1、Th2細(xì)胞的CD4+T 細(xì)胞另一亞群，其主要分泌IL-17A、IL-17F細(xì)胞因子，IL-17是最重要的效應(yīng)因子，IL-17具有促進(jìn)炎癥作用的細(xì)胞因子[10]，尤其在炎癥早期，能夠誘導(dǎo)促炎因子(如TNF、IL- 6)、趨化因子(如MPC1和MIP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，引起組織細(xì)胞的浸潤和組織破壞。除此之外，IL-17還參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化，對T細(xì)胞的活化起協(xié)同刺激作用[11]。RORγt作為Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th17細(xì)胞的分化、發(fā)育中起重要作用，RORγt誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化并調(diào)節(jié)IL-17的表達(dá)，若抑制RORγt 的表達(dá)，則能夠抑制未致敏T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。

目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RORγt mRNA與兒童腺病毒肺炎發(fā)病關(guān)系的報道較少，本研究通過檢查兒童腺病毒肺炎外周血中Th17細(xì)胞中RORγt mRNA表達(dá)水平，探討RORγt mRNA在兒童腺病毒肺炎發(fā)病機(jī)制中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對照組外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。表明兒童腺病毒肺炎Th17細(xì)胞在CD4+T輔助細(xì)胞中所占的比例上升，RORγt的高表達(dá)可能促進(jìn)了Th17細(xì)胞分化，通過調(diào)節(jié)IL-17等致炎因子的分泌參與了兒童腺病毒肺炎的發(fā)生，提示Th17細(xì)胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt與兒童腺病毒肺炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并在兒童腺病毒肺炎的免疫致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但是RORγt在兒童腺病毒肺炎發(fā)病過程中更深層的作用及與其他轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)影響還有待進(jìn)一步研究。