鄭凡艷，鄧彩云，張 力，陳 芳，王文娟

(貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一種破壞人體免疫系統(tǒng)的獲得性免疫缺陷綜合癥。HIV感染后其外殼膜上的糖蛋白gp120可致中樞神經(jīng)敏化，進(jìn)而引起運動、感覺的失調(diào)，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛等一系列嚴(yán)重的外周神經(jīng)病變。近年來，HIV致神經(jīng)性疼痛的發(fā)病率越來越高，HIV的病人可呈現(xiàn)不同程度的疼痛，這種頑固性疼痛目前亦無特效治療藥物[1]。此外，目前對于HIV相關(guān)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來發(fā)現(xiàn)離子通道在gp120直接興奮初級傳入神經(jīng)元而導(dǎo)致痛覺過敏的過程中起著關(guān)鍵作用。其中，在疼痛發(fā)生、發(fā)展和傳遞過程中，電壓門控性鉀離子通道(Kv)發(fā)揮著重要的作用。本研究采用gp120作用于大鼠坐骨神經(jīng)[2]，建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，檢測外向型鉀離子通道Kv2.1、Kv4.2的蛋白表達(dá)情況，探討鉀通道在HIV致神經(jīng)性疼痛中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康、清潔級SD雄性大鼠16只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(黔)2012-0001。包膜糖蛋白gp120、兔多克隆抗體Kv2.1、兔多克隆抗體Kv4.2、山羊抗兔IgG-HRG購自abcam公司，兔β-Actin抗體、彩虹180廣譜蛋白Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司，RIPA裂解液(強(qiáng))、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Western一抗、抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)公司)，HRP化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.2 動物分組及大鼠gp120模型建立

1.2.1 動物分組 雄性SD大鼠均為健康、清潔級，體重為225～250 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)數(shù)字表法將其分為gp120模型組和對照組，每組8只大鼠。大鼠的飼養(yǎng)條件為12 h明/暗循環(huán)，室溫(21±1)℃，自由飲食和攝取水。

1.2.2 大鼠gp120模型建立戊巴比妥鈉麻醉雄性SD大鼠，切開大鼠左腿側(cè)彎凹陷皮膚，使坐骨神經(jīng)暴露。實驗組采用2 mm×6 mm氧化纖維素膜浸泡于250 μl濃度為0.1%大鼠血清白蛋白(RSA)生理鹽水溶液中，其中含有100 mg gp120，對照組則放于不含gp120濃度為0.1%的大鼠血清白蛋白生理鹽水中處理。大鼠血清白蛋白處理后的纖維素膜，纏繞與大鼠坐骨神經(jīng)分叉部位且不要壓迫神經(jīng)。此外，若對照組大鼠術(shù)后存在任何的神經(jīng)功能障礙，則剔除該實驗中。

1.3 Western-blot 大鼠麻醉后，急性分離DRG神經(jīng)元，勻漿裂解離心提取相關(guān)蛋白后，﹣20℃冰箱保存。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，每孔上樣20 g，轉(zhuǎn)PVDF膜，BSA封閉2 h，一抗孵育過夜(4℃)，二抗孵育2 h(室溫)。Bio-Rad ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，采用Image Lab軟件分析蛋白條帶，以目的條帶與各自內(nèi)參β-action的灰度比值反映目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Kv2.1蛋白表達(dá) 在大鼠術(shù)后14 d后，麻醉大鼠，急性分離DRG，提取相關(guān)蛋白。Western-blot結(jié)果顯示，與對照組相比，gp120模型組Kv2.1蛋白濃度表達(dá)水平略降低，t=4，P>0.05。見圖1。

2.2 Kv4.2蛋白表達(dá) 大鼠術(shù)后14 d，麻醉大鼠，分離DRG，提取相關(guān)蛋白。Western-blot結(jié)果顯示，gp120模型組Kv4.2蛋白濃度表達(dá)水平明顯低于對照組，t=69，P<0.05。見圖1。

3 討論

神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變或者破壞是引起神經(jīng)病理性疼痛的主要機(jī)制之一，HIV病毒通過其外殼表面膜上的糖蛋白gp120與免疫細(xì)胞上的CD4糖蛋白、趨化因子共受體結(jié)合在一起進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[3-4]。在外周神經(jīng)系統(tǒng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)，gp120可直接入侵繼而引發(fā)神經(jīng)元發(fā)生變性，影響神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)或活性活性。研究表明[5]，gp120體外實驗具有神經(jīng)毒性，外周或者中樞施用gp120足以引發(fā)疼痛。傷害感受器在接收到外界刺激后，引起初級傳入神經(jīng)末梢興奮，細(xì)胞膜去極化形成的向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞電流(動作電位)而形成人類的痛覺。簡單的說，位于傷害感受器上離子通道和特定的分子的共同作用，產(chǎn)生了疼痛的感覺。

Kv是廣泛分布的的一類電壓門控性離子型通道，神經(jīng)元動作電位產(chǎn)生和傳播是其活化的結(jié)果，在疼痛發(fā)生及傳遞過程中發(fā)揮著重要的作用。Kv2.1、Kv4.2分別是外向延遲整流鉀通道(TEA 敏感型)和瞬時外向鉀通道(4-AP 敏感型)的主要成分，均存在于DRG神經(jīng)元中[6-7]。有研究表明[8]，β淀粉樣蛋白片段可作用于瞬時外向鉀通道Kv4.2，使其表達(dá)上調(diào)，引起外向電流的增大。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，gp120模型組大鼠Kv4.2的蛋白表達(dá)明顯降低，提示Kv4.2可能參與gp120所致的HIV相關(guān)病理性疼痛過程的發(fā)生。本研究未發(fā)現(xiàn)gp120模型組大鼠Kv2.1的蛋白表達(dá)發(fā)生改變，提示Kv2.1可能不參與該過程。綜上所述，Kv4.2可能參與gp120所致的神經(jīng)病理性疼痛，其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。