羅娜，王琦，楊文強，于炎冰，張黎

雪旺細胞(Schwanncells，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細胞，起源于神經(jīng)嵴細胞，能分化成髓鞘細胞；其在髓鞘的形成和修復(fù)、維持髓鞘的厚度和絕緣性中起著重要作用[1]。此外雪旺細胞還能分泌各類神經(jīng)營養(yǎng)因子[2]，促進軸突的生長，在神經(jīng)發(fā)育和再生等過程中發(fā)揮重要作用。糖尿病持續(xù)的高血糖會導致雪旺細胞的線粒體功能障礙[3]，凋亡增加，導致髓鞘損傷和脫髓鞘；這可能是糖尿病周圍神經(jīng)病變的一個重要機制[4]。

糖尿病周圍神經(jīng)病(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚未完全明確。研究顯示強化血糖控制或胰腺移植并不能減少2型糖尿病DPN的發(fā)生[5-6]，表明神經(jīng)病變在高血糖早期已經(jīng)發(fā)生。長期的高血糖導致多元醇途徑激活，氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙以及晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)[7]形成。過量的AGEs激活了晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)，導致細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成，細胞氧化損傷；此外AGEs和RAGE的結(jié)合誘導氧化應(yīng)激，從而導致核因子NF-κβ及其相關(guān)促炎基因的上調(diào)，引起神經(jīng)功能障礙和疼痛[8-9]。雪旺細胞中RAGE過度表達與DPN的發(fā)生有關(guān)；AGEs引起關(guān)鍵蛋白(如膠原蛋白)、脂質(zhì)和核酸的修飾有可能改變雪旺細胞的結(jié)構(gòu)和功能，進而影響其包裹的軸突，導致DPN的進一步發(fā)展。因此，探討AGEs導致雪旺細胞損傷的機制對DPN的防治有著重要意義。本研究體外培養(yǎng)了大鼠雪旺細胞，予以不同濃度的AGEs刺激，觀察其對雪旺細胞增殖和凋亡的影響及相關(guān)蛋白表達水平的改變。

1 材料與方法

1.1 材料 RSC-96細胞(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心)；DMEM-H培養(yǎng)基，F(xiàn)BS，0.25%胰蛋白酶，青鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(中國凱基公司)；Caspase-3檢測試劑盒，TUNEL檢測試劑盒，DAPI染液(中國碧云天公司)；p-Akt抗體，Akt抗體，p-GSK3β抗體，GSK3β抗體，β-Actin抗體，β-Tubulin抗體(美國CST公司)；Bcl-2抗體，BAD抗體，CHOP抗體，GRP78抗體(美國Proteintech公司)；兔二抗(中國碧云天公司)，山羊二抗(中國普利萊公司)；AGE-BSA(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 將RSC-96細胞加入DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%雙抗)，置于37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；按1∶2～1∶6傳代，每2～3 d換液1次。細胞傳代后，培養(yǎng)24 h后給予AGEs刺激，將AGEs直接溶于培養(yǎng)基后按照不同的濃度刺激細胞，培養(yǎng)一段時間后繼續(xù)后續(xù)的操作。

1.2.2 細胞活力測定 將RSC-96細胞以2.0×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，每組6個復(fù)孔。用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換低血清DMEM培養(yǎng)基(含2% FBS，1%雙抗)。用0、100、250、500、1 000 μg/mL濃度AGEs處理RSC-96細胞(0 μg/mL AGEs組為對照組)，刺激24 h、48 h、72 h后檢測細胞的存活率。向每孔細胞加入10 μL CCK-8工作液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h；待培養(yǎng)基變成橙色后，用酶標儀檢測各孔細胞在450 nm處的吸光度，即OD值。將各孔細胞的OD值減去空白OD值(培養(yǎng)基加CCK-8檢測液，無細胞)，取各孔細胞平均OD值，細胞存活率=(加藥細胞OD值/對照細胞OD值)×100%。

1.2.3 Caspase-3活力測定 將RSC-96細胞以1.5×105個/mL接種于12孔板，每孔1 mL，每組4個復(fù)孔；用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換低血清DMEM培養(yǎng)基。用0、100和500 μg/mL濃度的AGEs處理RSC-96細胞48 h后，檢測其Caspase-3活力。用胰酶將貼壁細胞消化下來，600 g、4 ℃離心5 min收集細胞，小心吸除上清，PBS清洗1次后，加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。每組細胞取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，再取50 μL樣品用于檢測ρNA(ρ-nitroaniline)。每組樣品中加入40 μL緩沖液和10 μL Ac-DEVD-ρNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp ρ-nitroanilide)，空白對照用50 μL裂解液代替蛋白樣品，混勻后37 ℃孵育1～2 h，顏色明顯變黃后測定樣品的OD值。將各孔細胞的OD值減去空白對照的OD值，取各孔細胞平均OD值，Caspase-3活力=(實驗組OD值/對照組OD值)×(對照組蛋白濃度/實驗組蛋白濃度)×100%。

1.2.4 細胞凋亡檢測 將RSC-96細胞以1.5×105個/mL接種于24孔板(內(nèi)含細胞爬片)，每孔0.5 mL，每組3個復(fù)孔。用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換低血清DMEM培養(yǎng)基，用0、100和500 μg/mL濃度的AGEs處理RSC-96細胞72 h后，檢測細胞凋亡。貼壁細胞用PBS洗一遍后加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗一遍后加入通透液(含0.3% Triton X-100的PBS)室溫孵育5 min。按說明書配置TUNEL檢測液，細胞用PBS洗滌兩次后加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次后加入DAPI染色液，室溫避光孵育10 min。洗去DAPI染色液后用抗熒光猝滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，用ImageJ軟件分析結(jié)果；計算凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.2.5 細胞蛋白檢測 采用免疫印跡法。將RSC-96細胞以1.5×105個/mL接種于6孔板，用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換低血清DMEM培養(yǎng)基。用0、100和500 μg/mL濃度的AGEs處理RSC-96細胞72 h后，提取細胞總蛋白。根據(jù)蛋白濃度算出每組樣品體積，將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液按5∶1混勻后100 ℃加熱5 min。將蛋白樣品混合物和蛋白Maker加入10% SDS-PAGE凝膠內(nèi)，以150 V恒壓電泳60 min。然后取出凝膠，以250 mA恒定電流濕轉(zhuǎn)60 min，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h。用一抗稀釋液稀釋一抗，將PVDF膜在稀釋的一抗中4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；用二抗稀釋液稀釋二抗，將PVDF膜在稀釋的二抗中室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；將ECL顯影液按A液與B液1∶1配好后，將膜在顯影液中避光孵育30～60 s，然后放入成像系統(tǒng)，曝光成像。用Image J軟件分析目標條帶的灰度值，以內(nèi)參的灰度值作為內(nèi)部對照。

2 結(jié) 果

2.1 AGEs對RSC-96細胞增殖的影響 與對照組細胞相比，培養(yǎng)24 h、48 h時各濃度AGEs組RSC-96細胞的活力無顯著下降；但培養(yǎng)72 h時，各濃度AGEs組RSC-96細胞的活力均明顯降低(均P<0.05)(圖1)；表明AGEs處理72 h后RSC-96細胞的增殖能力減弱。

與Control組比較*P<0.05圖1 不同濃度AGEs組RSC-96細胞培養(yǎng)24～72 h相對活力變化

2.2 AGEs對RSC-96細胞凋亡的影響

2.2.1 AGEs組與對照組RSC-96細胞Caspase-3活性比較 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的Caspase-3活性均明顯增強(均P<0.05)。見圖2。

與Control組比較*P<0.05圖2 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞Caspase-3活性比較

2.2.2 AGEs組與對照組RSC-96細胞凋亡指數(shù)比較 隨著AGEs濃度的增加，凋亡細胞(綠色熒光標記陽性細胞)數(shù)增多(圖3)。與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的凋亡指數(shù)均明顯增高(均P<0.05)(圖4)。

2.3 AGEs對RSC-96細胞Akt通路的影響 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的P-Akt、p-GSK3β蛋白水平明顯降低；p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β明顯降低。表明其Akt和GSK3β磷酸化受到了抑制，AGEs可以抑制RSC-96細胞Akt通路的激活。見圖5-7。

2.4 AGEs對RSC-96細胞凋亡蛋白表達的影響 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的BAD蛋白表達水平升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低(圖8)；表明AGEs可以促進RSC-96細胞促凋亡蛋白的表達，抑制RSC-96細胞抑凋亡蛋白的表達。

2.5 AGEs對RSC-96細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的CHOP蛋白表達水平升高，而GRP78蛋白表達水平降低(圖9)；表明AGEs導致了RSC-96細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強且處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激晚期失代償。

圖3 各組RSC-96細胞凋亡檢測結(jié)果(熒光染色，×100)

與Control組比較**P<0.05圖4 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞凋亡指數(shù)比較圖5 各組RSC-96細胞Akt通路蛋白免疫印跡檢測

與Control組比較**P<0.05圖6 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞p-Akt/Akt蛋白水平比較與Control組比較**P<0.05圖7 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞p-GSK3β/GSK3β比較圖8 各組RSC-96細胞的BAD、Bcl-2蛋白表達水平

圖9 各組RSC-96細胞的CHOP、GRP78蛋白表達水平

3 討 論

中國糖尿病患者呈快速增長趨勢，糖尿病前期患者的比例也很高，超過半數(shù)的糖尿病患者會發(fā)展成為DPN，嚴重影響患者生活質(zhì)量[10]。臨床上對DPN的治療方法是控制血糖和疼痛的對癥治療，尚無有效的藥物阻止DPN的發(fā)生。DPN發(fā)病機制十分復(fù)雜，尚未完全闡明。目前認為其與遺傳易感性、胰島素抵抗、高血糖、低度炎癥狀態(tài)、血管內(nèi)皮細胞功能紊亂和凝血功能異常等多種因素有關(guān)。高血糖可導致多元醇途徑激活、AGEs形成增加、蛋白激酶C途徑激活以及己胺糖通路激活等。高血糖時線粒體電子傳遞鏈過氧化物產(chǎn)生過量引起氧化應(yīng)激是以上各種途徑的共同機制。因此，研究DPN的病理機制對于尋找延緩DPN進展的關(guān)鍵藥物意義重大。

高血糖導致過量的AGEs累積是DPN的重要發(fā)病機制，AGEs的形成和累積與糖尿病的進展呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs在糖尿病患者和實驗動物的周圍神經(jīng)中積累，而抗糖基化藥物可以抑制AGEs的形成，改善實驗性糖尿病大鼠的神經(jīng)病變[11-12]。AGEs由賴氨酸側(cè)鏈和大分子(氨基酸、蛋白質(zhì)、磷脂和核酸)末端氨基還原碳水化合物的非酶反應(yīng)(糖基化反應(yīng))生成，這個過程開始形成可逆的希夫堿，然后得到更穩(wěn)定的早期糖基化產(chǎn)物，經(jīng)過進一步的復(fù)雜反應(yīng)，如重排、脫水和縮合，生成了不可逆的交聯(lián)熒光蛋白衍生物，稱為AGEs[13]。機體組織中AGEs累積會對蛋白質(zhì)、脂類和DNA的功能產(chǎn)生不利影響，誘發(fā)炎癥和活性氧濃度的升高，最終影響細胞代謝活動；這些因素進一步導致AGEs累積，引起機體疾病如糖尿病、炎癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病[8,14-15]。在血管壁中AGEs可激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，從而引起生長因子、細胞粘附分子及細胞因子表達增加，抑制細胞復(fù)制并誘導細胞凋亡[16]。然而，AGEs在DPN中的作用機制尚不清楚。

AGEs有許多不同的來源，葡萄糖通過糖基化、自氧化和其他代謝途徑形成免疫化學性質(zhì)不同的AGEs。由早期糖基化產(chǎn)物(amadori product)分解產(chǎn)生的、甘油醛(糖酵解中間產(chǎn)物)產(chǎn)生的、乙醇醛(希夫堿分解產(chǎn)物)產(chǎn)生的、甲基乙二醛(甘油醛和糖基化產(chǎn)物分解產(chǎn)物)產(chǎn)生的和葡萄糖自氧化產(chǎn)生的AGEs分別命名為AGE-1～5[17]。這5種AGEs抗體均能在糖尿病患者的血液中檢測到[18]。這些不同的內(nèi)源性AGEs對神經(jīng)元、視網(wǎng)膜細胞和腎細胞有不同的生物學效應(yīng)[19]；AGE-2(甘油醛衍生的AGEs)能促進神經(jīng)元的凋亡[17]；AGE-2和AGE-3(乙醇醛衍生的AGEs)能顯著抑制SCs的復(fù)制，誘導其凋亡；而AGE-1(葡萄糖衍生的AGEs)對SCs的增殖和凋亡無明顯影響[20]。研究還發(fā)現(xiàn)AGE-2和AGE-3能促進 SCs核因子NF-κβ的活化以及TNF-α和IL-1β的分泌，還能導致細胞氧化應(yīng)激增強和線粒體功能障礙。本研究采用Abcam公司的AGEs，由BSA與乙醇醛發(fā)生反應(yīng)得到的AGE-BSA進行細胞實驗；結(jié)果表明AGEs以劑量和時間依賴性方式影響RSC-96細胞的存活，增強細胞Caspase-3活性，導致細胞的凋亡數(shù)明顯增加。由此推測AGEs直接導致了雪旺細胞的凋亡，進而引起神經(jīng)脫髓鞘和周圍神經(jīng)再生受損；這可能是高血糖引起周圍神經(jīng)病變的重要機制。

Akt是細胞存活的重要調(diào)節(jié)因子，可以抑制細胞凋亡。Akt激活后會磷酸化其下游的調(diào)節(jié)蛋白，最著名的是GSK3，還包括雷帕霉素(mTOR)、TSC2、caspase-9和PRAS40 (AKT1S1)。Akt在促進細胞增殖、分化、凋亡、血管生成和代謝等方面具有相對廣泛的下游效應(yīng)[21]，參與葡萄糖代謝和儲存的糖原合酶受GSK3和其他幾種下游蛋白的調(diào)控；此外，mTORC1通過固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(SREBP)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝；這些因素通過防止蛋白質(zhì)分解來促進細胞生長，通過激活核苷酸合成來刺激細胞增殖，并在不同情況下調(diào)節(jié)細胞自噬[22]。因此可以推斷，Akt信號傳導途徑在糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥、癌癥的發(fā)生和進展、損傷、修復(fù)和重塑等過程中起到至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)Akt在周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突包裹和髓鞘厚度調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[23]；糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展受到Akt信號通路的調(diào)節(jié)[24-25]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，DPN大鼠的背根神經(jīng)節(jié)和坐骨神經(jīng)中Akt的激活受到了抑制[26-27]；在細胞實驗中，藥物激活A(yù)kt信號通路可以保護細胞免受高糖和氧化應(yīng)激等造成的細胞損傷[28-29]；這給尋找神經(jīng)營養(yǎng)藥物一些提示。相反，抑制Akt的激活可以導致細胞的凋亡[30]，這可能成為癌癥治療的一個靶點。本研究觀察到AGEs處理的RSC-96細胞，磷酸化的Akt-Sre473和磷酸化的GSK3β-Ser21/9的表達水平降低，表明Akt信號通路受到了抑制。

Bcl-2和BAD是Akt/GSK3β信號通路的下游調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2可抑制細胞凋亡，BAD則促進細胞凋亡[25]。本研究中， AGEs處理的RSC-96細胞中Bcl-2表達水平降低，而BAD表達水平增高；提示AGEs可能通過阻斷Akt/GSK3β信號通路，影響其下游凋亡相關(guān)蛋白的表達來誘導凋亡。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的3種主要信號通路中，PERK (protein kinase RNA-like ER kinase)/CHOP(CCAT-enhancer-binding protein homologous protein)通路被認為與細胞凋亡密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段是一種旨在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的適應(yīng)性反應(yīng)，被稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)，由葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulatory protein 78，GRP78)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白調(diào)控；PERK信號通路發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，通過抑制蛋白質(zhì)的合成對細胞起保護作用，促進細胞的生存；如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激長期存在，可誘導細胞凋亡的內(nèi)在途徑[31]；PERK通過誘導CHOP的表達而促進細胞凋亡，CHOP可抑制Bcl-2的表達，增加活化Caspase-3的表達水平，導致細胞死亡。GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期表達增多，而在晚期則表達減少。在本研究中，AGEs刺激后的RSC-96細胞GRP78蛋白水平降低，而CHOP蛋白水平升高，Caspase-3的表達水平增加；表明AGEs造成了RSC-96細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激晚期。

有研究認為Akt激活可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[32]，Akt失活則導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CHOP抑制Akt的激活，而GRP78則增強Akt的激活，促進細胞存活[34-35]。本研究推測Akt信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相互作用，互相影響。通過激活A(yù)kt、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進細胞的存活，這為在高血糖和氧化應(yīng)激狀態(tài)下保護神經(jīng)、減少雪旺細胞凋亡提供了很好的方法。本研究通過AGEs刺激大鼠雪旺細胞實驗發(fā)現(xiàn)了DPN可能的機制，即AGEs通過抑制Akt的激活，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致雪旺細胞的凋亡；結(jié)果提示可以通過尋找激活A(yù)kt或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物減緩DPN的進展。